Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

новной

выполняемой функции: белки-ферменты, белки структур-

ные,

белки-рецепторы, белки транспортные и т.д.

Мембранные белки являются амфипатическими соединениями,

их выделение и фракционирование возможно лишь только при ис-

пользовании

детергентов, нарушающих гидрофобные взаимодейст-

вия

и приводящих к разрушению бислоя липидов. Мембранные бел-

ки

имеют гидрофобные и гидрофильные участки, т.е. они - амфи-

фильные

соединения.

Низкомолекулярный

детергент состоит из гидрофильной головки

гидрофобного

хвоста.

Так как взаимодействие гидрофобных уча-

стков молекулы детергента с гидрофобными участками мембранно-

го белка сильнее, чем взаимодействие липида с белковой молеку-

лой,

то гидрофобные участки детергента вытесняют липиды и свя-

зываются с белками. Полярные группы детергента взаимодейству-

ют с молекулами воды. Мембранные белки переходят в

воду

в виде

комплекса

молекулы белка с детергентами, а в ряде случаев с час-

тью прочно связанных с молекулой белка молекул липидов. Поляр-

ные

концы детергента

могут

нести заряд (додецилсульфат натрия -

ДСН),

либо быть неионогенными (тритон

Х-100):

WWW0-S-CT

Net

Додецилсульфат натрия

сн

ендо,

(О-СН

)9-ю-ОН

Тритон

Х-100

В благоприятных условиях при низких концентрациях детерген-

та мембранные белки

могут

сохранять нативную конформацию и

быть активными, сохранив часть связанных липидов.

Для получения индивидуальных мембранных белков используют

методику разделения их при помощи электрофореза в полиакрила-

мидном

геле

после обработки ДСН (при 100 °С в

%-ном растворе).

В этих условиях разрушаются все нековалентные связи (белок-ли-

пидные,

белок-белковые).

Так

как количество связавшегося ДСН с белком прямо пропор-

ционально

его массе, то суммарный отрицательный заряд включен-

181

ного детергента значительно превышает собственный заряд белка,

поэтому перемещение молекул последнего в электрическом поле

определяется в основном его молекулярной массой. По количеству

фракций

судят

о составе белков, их молекулярной массе, а по ин-

тенсивности окраски (например, кумасси синим) определяют коли-

чество белка данной фракции. С помощью метода двухмерного

электрофореза было идентифицировано более 50 различных белков

типичной плазматической мембране позвоночных животных.

В мембране эритроцитов человека удалось выявить более 15 ос-

новных белков с молекулярными массами от

15000

до

250000

Да.

На

долю

трех

из них (спектрина, гликофорина и белка полосы III)

приходится более 60% массы

всех

мембранных белков. Спектрин

непрочно

связан в мембране с внутренней стороны. Он составляет

около 30% массы мембранных белков (3 1(г копий на клетку) и об-

разует

при взаимодействии с другими белками (анкирином и др.)

цитоскелет.

Встраивание молекул белка в бислой фосфолипидов осуществля-

ется поэтапно: сначала происходит адсорбция молекулы белка на

поверхности бислоя фосфолипидов, что вызывает конформацион-

ную перестройку белковой молекулы и затем образование гидро-

фобного контакта с ацильными частями фосфолипида. Это приво-

дит к внедрению молекулы белка в бислой.

Для мембранных белков характерно неодинаковое соотношение

гидрофильных и гидрофобных участков в молекуле, что определяет

силу гидрофобных взаимодействий в области неполярных хвостов

липидов и электрических взаимодействий в области головок фосфо-

липидов на наружной и внутренней поверхностях мембран (см. рис.

4.6). Интегральные белки имеют не менее

двух

гидрофильных уча-

стков,

которые располагаются на наружной и внутренней поверхно-

стях мембраны (рис. 4.7). Иногда белковая молекула несколько раз

пересекает мембрану (рис. 4.8).

Полярная

область

1'ис. 4.7.

Схема

амфипатического ин-

тегрального

мембранного белка,

удер-

жииаемого в л

ими

дном бислое гидро-

фобными взаимодействиями с

углево-

дородными цепями

молекул

липидов

Гидрофобная

область

Полярная

область

182

соон

Цитоплазма

- спираль

Липидный

бислой

Внеклеточное

пространство

Рис. 4.8.

Структура

молекул

бактериородоп-

сина

и ее

политопическое

расположение

липид-

ном

слое.

Полипептидная

цепь

пересекает

бислой

виде

семи

спиралей

Периферические

белки являются монотопическими, а интеграль-

ные

- би- и политопическими. Так, гликофорин является битопи-

ческим белком, а бактериородопсин, транспортные АТФазы, кана-

лообразователи - политопическими.

Разнообразные

функции мембранных белков зависят от их высо-

кой

конформационной подвижности, способности переходить в на-

пряженное

(state tensed) и расслабленное (state

relaxed)

состояния.

Эти состояния обратимы (R^T-переходы), что связано с измене-

нием

четвертичной и третичной

структур

белковых молекул.

Монотопические

белки вызывают эластическую деформацию од-

ной

стороны мембраны, что облегчает взаимодействие мембранных

рецепторов с гормонами (например, с инсулином).

За

счет гидрофобности белка и его встраивания в область непо-

лярных хвостов липидов (например, цитохрома

Ъ$)

может происхо-

дить резкое изменение кривизны и деформация бислоя.

Интегральные белки, проникающие через мембрану,

могут

ока-

зывать значительное давление на бислой, что приводит к сжатию

одних и уширснию

других

его участков (например, гликофорин в

мембране эритроцитов).

Процесс

синтеза мембранных белков протекает в рибосомах эн-

доплазматической сети. К месту функционирования он поступает

за счет диффузии на короткое расстояние, путем контактов

между

различными органеллами, в

результате

чего происходит обмен мо-

лекулами белка. На значительные расстояния молекулы мембран-

ного белка переносятся везикулами, формирующимися в аппарате

Гольджи.

183

Углеводы

мембран

Углеводы

в свободном состоянии в мембранах практически не об-

наруживаются. Они

входят

в состав белков (гликопротеины и про-

теогликаны) и в состав липидов (гликолипиды), что составляет со-

ответственно около 10%

всех

белков и от 5 до 26% липидов. В гли-

копротеинах наиболее часто встречаются такие моносахариды, как

глюкоза, галактоза, манноза, глюкозамин, нейраминовая кислота;

в протеогликанах - галактоза, ксилоза, глюкуроновая кислота, глю-

козамин,

галактозамин.

Гликолипиды включают глюкозу, галактозу, фруктозу, глюкоза-

мин,

нейраминовую кислоту и др.

Углеводная часть белковой молекулы находится на внешней сто-

роне мембраны, что связано с их функциональной ролью: осуществ-

лением межклеточных взаимодействий, ограничением подвижно-

сти белковых молекул, обеспечением иммунных реакций.

Включение

углевода

в состав белков защищает их от протеолиза

во время транспорта к месту функционирования, обеспечивает мо-

лекулярное узнавание и закрепление белковой молекулы в опреде-

ленном месте мембраны.

6в. Принципы построения мембранных липидных

структур

В силу природной амфифильности липидов их молекулы

будут

ориентироваться на поверхности и внутри полярного (вода) и непо-

лярных растворителей (ацетоне, эфире, хлороформе) вполне опре-

деленным способом, образуя на границе раздела монослои (липид-

ные пленки), бислои (мембраны), и в объеме растворителя - мицел-

лы (рис. 4.9).

Способность липидов образовывать различные структуры при из-

менении

концентрации липидов или изменении температуры по-

лучила название концентрационного или температурного мезомор-

Фосфолипидная

мицелла

Фосфолипидный

бислой

Рис.

4.9.

Фосфо-

лидная

мицелла и

фосфолидный

бислой

вводе

184

физма.

Структурные переходы можно наблюдать при исследовании

зависимости размера площади, занимаемой молекулой липида, от

величины поверхностного давления (рис.

4.10).

Монослои

При

нанесении на поверхность воды раствора липида в

летучем

органическом растворителе (эфире, ацетоне и др.) пленка свободно

растекается по поверхности при отсутствии ее ограничений. Поляр-

ные

головки при этом обращены к воде, а углеводородные неполяр-

ные

хвосты ориентированы в

воздух.

Молекулы липида практиче-

ски

не взаимодействуют

друг

с другом, что напоминает состояние

молекул вещества в газообразном состоянии.

По

мере ограничения поверхности (сжатия пленки) происходит

увеличение плотности упаковки провзаимодеиствовавших липид-

ных молекул. Возникает сплошная пленка липида, что соответству-

ет состоянию "двумерной жидкости". При дальнейшем сжатии

пленки

достигается максимальная упаковка молекул, при которой

головки обращены к воде, углеводородные хвосты в виде частокола

направлены в

воздух.

Это состояние упаковки молекул получило

название

конденсированного монослоя, в котором площадь, прихо-

дящаяся

на одну молекулу липида,

будет

минимальной, поэтому

ЛАоААо

40,0

30,0

20,0

10,0

0,01

оооооо ооооо

Коллапс

"Твердый

монослой

Ь' и

UIXJ

о О О

"Жидки]»-

'МОНОСЛОЙ

0,2

0,3 0,4 0,5 0,6 1 2

Площадь, занимаемая молекулой,

нм

<С

Сжатие монослоя

' '

Рис.

4.10. Общий вид диаграммы зависимости поверхностного давления от площа-

ди, приходящейся на молекулу липида

185

образуется твердый конденсированный, практически несжимаемый

монослой (см. рис.

4.10).

При

достижении определенной величины давления происходит

сдвиг слоев, наползание их

друг

на

друга

(давление коллапса). Из-

мерение поверхностного давления проводится при помощи пленоч-

ных весов Лэнгмюра или методом Вильгельми, который основан на

взвешивании тонкой пластинки из инертного материала при сопри-

косновении

ее с поверхностью монослоя.

По

измеренной величине скачка электрического потенциала

(AV) вычисляют значение дипольных моментов молекул и получа-

ют информацию об ориентации поверхностно-активных молекул на

поверхности монослоя и характере их взаимодействия с липидами.

Разработана установка с применением радиоактивных меток, по-

зволяющая измерять поверхностное давление, поверхностный по-

тенциал и поверхностную радиоактивность.

Липидные монослои служили удобной простейшей моделью био-

логических мембран с начала XX в. Достаточно вспомнить работы

Б.Франклина,

лорда Релея (Дж.Стратта), ИЛэнгмюра. Липидные

монослои и в настоящее время позволяют оценить поверхностную

активность отдельных компонентов, характер взаимодействия меж-

ду ними.

Структура и свойства монослоя зависят от строения липидных

молекул. Триглицерины образуют конденсированные монослои при

поверхностном давлении 10~

Н/см . При максимальной плотности

упаковки молекул площадь, приходящаяся на одну молекулу, в мо-

нослое равняется

0,19-0,20

нм , а при введении ненасыщенной

жирной кислоты предельная площадь увеличивается до 0,26 -

0,27 нм . В данном

случае

образуется менее упорядоченная жидко-

растянутая пленка.

Ионизация

полярных групп липидов при сдвиге рН приводит к

более разреженному состоянию молекул в монослое,

тогда

как до-

бавление двухвалентных и многовалентных катионов значительно

увеличивает плотность упаковки молекул и уменьшает площадь,

приходящуюся на одну молекулу.

Молекулы белка при адсорбировании и проникновении в моно-

слой липидов уменьшают поверхностное давление, изменяют вели-

чину электрического потенциала и увеличивают площадь, прихо-

дящуюся на одну молекулу.

Мицеллообразовапие

Мицеллы - это простейшие надмолекулярные образования, агре-

186

Мицелла

классического типа

Распад | | Ассоциация

Липид

Полярная

головка

Углеводородный хвост

Распад I I Ассоциация

Неполярный растворитель +

следы

воды

Обращенная

мицелла

Рис.

4.11.

Липидные

мицеллы

в воде и

нсполярпом

растворителе

гаты липидов в объеме растворителя. Липиды в полярном раствори-

теле (воде) образуют мицеллы обычного, классического типа, а в

органических растворителях - обращенные мицеллы (рис. 4.11).

В обычных мицеллах гидрофильные головки контактируют с мо-

187

лекулами воды,

гидрофобные хвосты (углеводородные цепи)

фор-

мируют гидрофобное ядро.

неполярных растворителях (гексане,

бензоле, декане

и др.)

ядро образуют полярные головки липидов,

углеводородные цепи

будут

взаимодействовать

молекулами непо-

лярного растворителя,

что

приводит

образованию обращенной

мицеллы (см. рис.

4.11).

Соотношение размеров полярной

неполярной частей молеку-

лы, степень амфифильности, концентрация липидов сказываются

на

форме мицелл, которая может переходить

от

шарообразной

(сферической)

элипсоидальной

цилиндрической.

Как

правило,

легко образуют мицеллы

воде липиды, обладающие объемистой

или заряженной головкой

небольшой углеводородной цепью, фос-

фолипиды

одной углеводородной цепью

или с

двумя,

но

коротки-

ми

цепями (динексаноил-

диоктаноилфосфатидилхолины).

Названные вещества имеют высокие

по

сравнению

другими

ли-

пидами критические концентрации мицеллообразования

(10" -

-10"

моль/л).

В каждую мицеллу

входит

от

нескольких десятков

до

нескольких

сотен молекул, которые образуют

шар или

эллипс диаметром

от 6

до

нм. Стержни

цилиндры формируются

при

увеличении

кон-

центрации вещества

или

снижении температуры. Они включают

до

1000

более молекул (рис.

4.12).

Рис.

4.12. Различные типы мицелл, образуемых липидами в воде: а - сферические

мицеллы; б - эллипсоидальные; в - цилиндрические; г - диски, образуемые

фосфо-

липидами и амфифильными аполипопротсинами

188

В неполярных растворителях более легкому формированию ми-

целл способствует малый размер полярной головки, малая величи-

на

ее заряда и наличие длинных углеводородных цепей (яичный

фосфатидилхолин в бензоле).

Образование различных форм мицелл легко обнаруживается при

добавлении к образцу детергентов или

других

липидов. Наряду со

сферическими,

эллипсоидальными, цилиндрическими мицеллами

можно обнаружить диски (см. рис.

4.12).

Последние легко форми-

руются при смешении фосфолипидов с солями желчных кислот.

Бислои

Бимолекулярный

липидный слой (бислой) - энергетически наи-

более выгодная форма ассоциации тех липидов, которые не способ-

ны

образовывать мицеллы в полярном растворителе. Бислой легко

образуют липиды, у которых соизмеримы площадь полярной голо-

вки

и поперечное сечение углеводородных цепей. Это присуще

большинству фосфолипидов. В бислое монослои располагаются па-

раллельно

друг

другу,

взаимодействуя гидрофобными углеводород-

ными

хвостами, а гидрофильные поверхности их обращены к воде.

Критическая

концентрация мицеллообразования для липидов

бислойных

структур

на несколько порядков ниже по сравнению со

сферическими

и цилиндрическими структурами и составляет около

10 моль/л. Практически весь фосфолипид ассоциирован.

Процентное

соотношение липид/вода, строение и свойства фос-

фолипида

определяют характер и особенности ламеллярного строе-

ния

ассоциатов. Это

могут

быть мультиламеллярные бирядные

слои,

моноламеллярные и многослойные липосомы (пузырьки).

Толщина

липидного бислоя зависит от длины углеводородных

цепей

(обычно 4-5 нм), от плотности упаковки молекул: уменьша-

ется при наличии двойных связей, боковых заместителей в цепи,

цис-конфигурации

боковых метальных групп.

Фазовые

переходы

Липидный

бислой в зависимости от температуры может нахо-

диться в твердом (кристаллическом, гелевом) и жидкокристалличе-

ском

(жидком) состояниях. Физический смысл перехода

между

эти-

ми

состояниями состоит в замораживании или плавлении углеводо-

родных цепей липидов, что фиксируется для конкретного липида

при

строго определенной температуре (температуре фазового пере-

хода^).

Температура фазового перехода понижается при введении цис-

189

двойной

связи, метальной группы в середину цепи. Возрастание t

на

15-20 °С отмечается при увеличении длины насыщенной цепи на

два метиленовых звена.

Строение полярных головок влияет на t

. Так, включение фосфа-

тидилхолина вместо фосфатидилэтаноламина при одних и тех же

углеводородных звеньях понижает температуру фазового перехода

на

20 °С.

Фазовый

переход зависит от изменения концентрации ионов во-

дорода, ионного состава среды, особенно ионов Са

, добавления

мембранотропных веществ, изменения липидного состава бислоя.

При

температуре ниже t

подвижность углеводородных цепей резко

ограничена: они находятся в максимально вытянутой трансконфор-

мации

и наиболее плотно упакованы. Повышение температуры до

значения

фазового перехода приводит к плавлению липидного бис-

лоя:

резко усиливаются вращательная и колебательная подвижно-

сти молекул за счет возрастания скорости гош - транс-изомериза-

ции,

появления кинков в цепях, увеличения межлипидного рассто-

яния,

уменьшения толщины бислоя. Липидный бислой становится

менее упорядоченным. В жидкокристаллическом состоянии бислоя

скорость латеральной диффузии высока (коэффициент латеральной

диффузии липидов имеет величины в пределах 10" - 10" см • с" )

В среднем молекула липида совершает от 1000 до

100000

переходов

на

среднее расстояние, равное ее поперечному размеру (около

нм).

Переход из одного ряда в

другой

(флип-флоп переход) идет очень

медленно из-за необходимости преодоления высокого энергетиче-

ского барьера при переходе полярной головки через гидрофобную

область, образуемую углеводородными цепями. Полупериод флип-

флопа

составляет несколько часов, а при латеральной диффузии то

же расстояние (4-5 нм) липидная молекула проходит за 2,5 мс.

Если

происходит замыкание липидных мембран и идет образова-

ние

везикул, реализуются условия, приводящие к различию пара-

метров бислойной мембраны на внутренней и наружной поверхно-

стях: по плотности упаковки (выпуклая и вогнутая поверхности),

величинам рН, различии в содержании поверхностно-активных ве-

ществ, отдельных ионов. Формируется топологическая асиммет-

ричность искусственных и биологических мембран.

Модельные

мембраны

Бимолекулярные липидные мембраны (БЛМ, бислойные, "чер-

190