Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

3. Виды биологических мембран

Существуют

различные классификации мембран в зависимости

от главных признаков, положенных в их основу.

По

происхождению мембраны

делят

на естественные и искусст-

венные;

мембраны бактерий, растений, животных. Значительно ча-

ще в биологии естественные мембраны

делят

по принадлежности к

органоидам: наружная (цитоплазматическая), ядерная, митохонд-

риальная, эндоплазматическая, мембрана аппарата Гольджи, лизо-

сомальная и т.д.

По

выполняемой функции или

участию

в биологическом процес-

се

существуют

фотосинтетические, рецепторные, энергосопрягаю-

щие,

возбудимые и невозбудимые биомембраны.

Искусственные липидные мембраны в зависимости от включения

различных белков-каналообразователей, переносчиков, ферментов

подразделяются на модифицированные и ^модифицированные.

Я.Кагава

(1985)

выделяет

следующие

виды биологических мемб-

ран:

Поверхностные мембраны

Внутриклеточные мембра-

ны

Мембраны внешней повер-

хности клетки

Комплексы клеток

Цитоплазматические мем-

браны

Мембраны, образующие

сферические

структуры

Мембраны, образующие

разветвленную сеть

Опорные

структуры

Межклеточные

структуры

Клеточный пласт эпителия

Лизосомальные

Митохондриальные

Пероксисомальные

Гладкий эндоплазматиче-

ский

ретикулум

Шероховатый эндоплаз-

матический

ретикулум

Клеточная стенка

Клеточная оболочка

Базальная мембрана

Таким образом, биологические мембраны отличаются большим

разнообразием по своей

структуре,

принадлежности к различным

субклеточным образованиям, выполняемым функциям.

4. Методы выделения и изучения мембран

Методы выделения мембран

Для получения мембран из клеток органов и тканей используют

разные методы дезинтеграции, гомогенизации и выделения различ-

ных фракций, характеризующих мембраны субклеточных орга-

нелл.

151

Для дезинтеграции, разрушения клеток и тканей используют

различные методики:

1. Растирание ткани в фарфоровой ступке пестиком с добавлени-

ем мела, кварцевого песка, корунда.

2. Использование механических гомогенизаторов с вращающи-

мися

ножами, пестиком, цилиндром, в том числе и тефлоновым.

3. Ультразвуковые гомогенизаторы, где используют разную дли-

ну волны и разные интенсивности излучения для разрушения кле-

ток

в жидкой среде.

4. Метод замораживания-оттаивания, когда при замораживании

кристаллики

льда разрывают многочисленные мембраны и при от-

таивании

ткани мембраны и содержимое их поступает в жидкую

среду,

5. Метод осмотического шока; применим к таким клеткам, как

эритроциты.

Помещение эритроцитов в дистиллированную

воду

или

сильно гипотонические растворы приводит к поступлению воды

эритроциты, их растяжению, образованию дефектов в мембране,

ее разрыву,

выходу

гемоглобина из эритроцитов, образованию

"теней"

эритроцитов, которые представляют собой мембраны, так

как

все клетки животных не имеют оболочек, а покрыты только

мембраной,

поэтому их иногда называют голыми.

Для выделения различных фракций мембран в основном исполь-

зуют

метод ступенчатого, последовательного центрифугирования

или

центрифугирования в градиенте плотности раствора сахарозы,

фикола

или хлористого лития.

Последовательность и этапы выделения некоторых видов биоло-

гических мембран представлены на рис. 4.1.

Дифференциальное

центрифугирование является, очевидно, са-

мым распространенным методом выделения мембран субклеточных

органелл из гомогенатов тканей. Частицы и фрагменты, первона-

чально равномерно распределенные по объему центрифужной про-

бирки,

оседают со скоростью, зависящей от их размера, плотности и

формы.

Характеристика клеточных компонентов печени крыс представ-

лена в табл. 4.1.

Из

данных табл. 4.1

следует,

что центрифугирование при малых

ускорениях приводит к оседанию только крупных частиц (неразру-

шенных клеток, ядер). При увеличении относительного центробеж-

ного ускорения до

10000

g оседают преимущественно митохондрии,

а при

100000

g в осадок выпадают микросомальные фракции и вези-

кулы, в супернатанте (надосадочной жидкости) остаются только во-

152

Клетки печени

Ядерная

I Гомогенизация в сахарозе

Гомогенат

| Центрифугирование 600 в, 10 мин

1м

моль Центрифугирование

NaHCO,

3900 g, 45 мин

ракция

Супернатант

Обработка ультразвуком

в растворе сахарозы,

цитрата натрия

Ядерные

мембраны

(уд.

плотность 1,21)

Нуклеоплазма

Центрифугирование

8500 д. 10 мин

Центрифугирование

в градиенте плот-

ности

(сахарозы

2000 д, 30 мин)

Аппарат Гольджи, фагосомы и др.

Супернатант

Центрифугирование

100000 д, X мин

Митохондриальная

фракция

Цен

трифуг ирование

в градиенте плот-

ности

сахарозы,

электрофорез

П Г

Лизосомы

Пероксисомы Митохондрии

-Фракция

микросом

Центрифугирование

е градиенте плотности

сахарозы

Супернатант

Цен

Цитоллазматические мембраны

(уд.

плотность 1,17)

|рование

д,

10 ч

Обработка

ультразвуком,

осмотическим

шоком

Внутренняя

мембрана мембрана

Рибосомы

Супернатант

• -

выделяемые

фракции мембраны

Рис. 4.1.

Схема

выделения из гомогената печени крысы субклеточных мембранных фракций

дорастворимые белки. Последовательное центрифугирование с уве-

личением ступенчатого относительного центробежного ускорения и

времени центрифугирования получило название метода дифферен-

циального центрифугирования субклеточных фракций (см. рис.

4.1).

Таблица

4.1

Клеточные

компоненты

печени

крыс

Фракции

Целые

клетки

Ядра

Аппарат

Гольджи

крупные

фрагменты

везикулы

Митохондрии

Лизосомы

Шероховатые

микросомы

Гладкие

микросомы

Плазматические

мембраны

крупные

фрагменты

везикулы

Диаметр

частиц,

мкм

15-20

3-12

1-3

0,05-0,5

0,7-1.1

0,4-0,8

0,05-0.2

0.05-0,3

3-20

0.05-0,3

Режим

осаждения

ускорение,

600

2000

145000

10000

145000

1500

145000

время,

мин

Равновес-

ная

плотность,

г/см

1,20

1,32

1,12-1,16

1,06-1,16

1,17-1.21

1,12-1,16

1,13-1,25

1,06-1,23

1,15-1,19

1,07-1.19

Анализ табл. 4.1 показывает, что

даже

при повторных центрифу-

гированиях получаемые фракции

будут

содержать кроме основной

фракции

различные примеси мембран

других

частиц. Достижима

только определенная степень чистоты фракций.

Скорость осаждения частиц

будет

прямо пропорциональна вели-

чине

центробежного ускорения, разности

между

их плотностью и

плотностью среды.

Фрагменты разрушенных клеточных мембран

могут

замыкаться

пузырьки (микросомы) разного диаметра - от 0,3 до 3 мкм. Фрак-

ция

микросом обычно состоит из мембран, принадлежащих к раз-

личным

субклеточным органеллам и образованиям.

Основные методы изучения биологических мембран

Поскольку

биомембраны имеют разнообразное строение

даже

пределах одной клетки, а отдельные участки одной и той же мемб-

раны

могут

иметь различное строение (мозаичность структуры) и

выполнять

разнообразные функции, то и методы их изучения отли-

чаются большим разнообразием. Условно можно выделить несколь-

154

ко

групп методов исследования

структуры

и функций биомембран,

базирующихся на конечных целях, которые ставят отдельные био-

логические науки и дисциплины: биохимические; физиологиче-

ские;

генетические; иммунологические; биофизические.

Кратко

остановимся на характеристике первых

четырех

групп и

более подробно рассмотрим биофизические методы изучения био-

мембран.

1. Биохимические методы исследования биомембран позволяют

выделять в максимально чистом виде отдельные компоненты раз-

личных мембран, изучать их физико-химические свойства, способ-

ность образовывать надмолекулярные лабильные комплексы, опре-

делять время "жизни" отдельных компонентов, путей биосинтеза и

распада, влияние на метаболизм различных физико-химических

факторов

как внутренней, так и внешней среды: ионов,

температу-

ры и т.д.

2. Физиологические методы предусматривают исследование раз-

личных функций как на естественных, так>и на искусственных

мембранах или в модельных опытах на пластинчатых тканях (ко-

же, передней брюшной стенке лягушки, стенке мочевого пузыря

мелких животных, стенке кишечника животных, пластинке зелено-

го листа и др.). Физиологическими методами

изучают

проницае-

мость мембран для атомов, ионов, различных молекул; процессы,

протекающие в биомембранах при возбуждении, торможении, про-

ведении нервного импульса; поступление, распределение и выведе-

ние

ионов и молекул из клеток и тканей, влияние физико-химиче-

ских факторов на состояние мембран и изменение физиологических

функций

клеток.

3. Генетические методы, основанные на использовании мутан-

тов, дефектных по синтезу определенных мембранных белков, по-

зволяют решать вопросы о роли данных молекул белка в надмоле-

кулярной

организации, изменении функций мембран, их самоорга-

низации.

4. Иммунологические методы предусматривают выделение опре-

деленных мембран, использование их как антигенов с целью после-

дующего

применения выработанных антигенов для идентификации

специфических

участков мембран, распределения антигенов на

изучаемых

участках

мембраны, выделения комплексов антиген-ан-

титело с последующим разделением на антиген и антитело.

Рассмотрим биофизические методы исследования биологических

мембран бактерий, клеток растений, животных, выполняющих раз-

личные функции.

155

5. Биофизические методы исследования

биологических мембран

биофизическим подходам для выяснения структуры и функций

биологических мембран относят ряд высокоинформативных, хоро-

шо зарекомендовавших себя методов, позволяющих получать до-

стоверные сведения о состоянии молекул, молекулярных комплек-

сов, целой мембраны и изменении их физико-химических парамет-

ров в зависимости от функционального состояния мембран. Эти ме-

тоды используют также для решения биохимических, физиологиче-

ских, цитологических вопросов.

биофизическим методам относят:

- метод электронной микроскопии;

- метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и исполь-

зования

спиновых меток;

- метод ядерного магнитного резонанса

(ЯМР);

- метод флуоресцентной спектроскопии (и использования флуо-

ресцентных зондов);

- метод определения дисперсии оптического вращения и кругово-

го дихроизма;

- метод дифференциальной сканирующей калориметрии;

- метод рентгеновского рассеяния нейтронов;

- метод моделирования;

- метод искусственных мембран;

- метод радиоактивных изотопов;

- метод обнаружения фазовых переходов в мембранах.

5а. Метод электронной микроскопии

Предел разрешения оптического микроскопа в видимой области

света составляет

2000

А , а это не позволяет увидеть биологические

мембраны, толщина которых составляет в среднем

80-120

А . Элек-

тронная микроскопия доводит разрешение до 5-10 А , на уровне

размера диаметра атома урана. Электронный микроскоп в реаль-

ных условиях более чем в 500 раз превосходит разрешающую спо-

собность оптического микроскопа. Ограничения разрешающей спо-

собности светового микроскопа зависят согласно доказательствам

Эрнста

Аббе

от волновой природы света:

d - : ,

п sin a

где d - разрешающая способность микроскопа - то минимальное

расстояние

между

двумя точками, когда глаз воспринимает ихъ как

раздельные; Д - длина волны источника света; п - показатель пре-

156

ломления

среды,

которой находится объект;

а -

апертурный

угол,

под которым виден радиус объектива

из

точки размещения объекта.

Световой микроскоп

хорошим иммерсионным объективом обеспе-

чивает разрешающую способность около

0,2 мкм

(2000

А ). Для не-

вооруженного глаза человека разрешающая способность равна

на

расстоянии

25 см от

глаза

0,2 мм;

таким образом, полезное увели-

чение составляет

1000 раз.

В ультрафиолетовом микроскопе

кварцевой оптикой разрешаю-

щая

способность увеличивалась примерно

в два

раза

составляла

около

1000 А , что

явно недостаточно

для

исследования биологиче-

ских мембран. Необходимы были принципиально иные источники

излучения

более короткой длиной волны.

величинах различных

биологических объектов

возможных методах

их

выявления позво-

ляет судить рис.

4.2.

ММ

Предел

видимости

невооруженного

глаза

. _1 100

мк

Область

световой

микроскопии

Область

электронной

микроскопии

Методы

структурного

анализа

мк

— 1000

100

—=

А "I

Крупные клетки

Эритроциты

Бактерии

Вирусы

Белки

Аминокислоты

Атомы

Рис.

4.2. Полулогарифмическая

схема

величин различных объектов и возможные

методы их

выявления

157

В 1924 г. Л. де Бройль теоретически предсказал периодичность

движения электрона, которому можно приписать определенную

длину волны:

=V150/K

где V - энергия электрона в электрон-вольтах, измеряемая разно-

стью

потенциалов

между

раскаленной нитью катода и сеткой анода

в электронной пушке. В этом

случае

при подаче напряжения в

000В

движущиеся электроны

будут

иметь

А-V150/60000"-

- 0,05 А , что в 100 000 раз меньше длины волны видимого света.

В 1927 г. справедливость теории Л. де Бройля подтвердили рабо-

ты Г.П.Томсона и Девидсона и исследования Джермера. Была изме-

рена длина волны потока электронов и выявлено ее соответствие

вычислениям Л. де Бройля.

Бушем разработана теория электронных линз. Было установле-

но,

что пучок электронов в магнитном или электрическом поле мо-

жет сходиться в

другой

точке оси симметрии или расходиться из

другой

точки оси. Для магитных линз можно определить фокусное

расстояние, которое можно менять за

счет

изменений силы прохо-

дящего в линзах тока. Буш обосновал возможность создания элект-

ронной

оптики. Работой ряда исследователей была показана полная

аналогия

между

электронной и световой оптикой и возможность со-

здания электронного микроскопа.

Первый электронный микроскоп был сконструирован в 1932 г.

М.Кноллем и

Г.Руска.

Электронные микроскопы с разрешающей

способностью 20 А появились в продаже уже в 1945 г. Дж. Гильер

довел

разрешающую способность их до 10 А . Изображение в элект-

ронном

микроскопе монохроматично и интенсивность освещенно-

сти отдельных участков зависит только от способности разных уча-

стков объекта рассеивать электроны.

Для изучения биомембран используют различные виды элект-

ронной

микроскопии:

- электронная микроскопия светлого поля (наиболее распростра-

ненная).

Светлыми выглядят участки, мало рассеивающие электроны;

- электронная микроскопия темного поля. Светлыми выглядят уча-

стки,сильно рассеивающие электроны, так как в конечном изобра-

жении принимают

участие

рассеянные электроны;

- панорамное электронное микроскопирование;

- сканирующая электронная микроскопия.

Для проведения электронной микроскопии в мембранологии при-

158

меняют ряд методов приготовления образцов и получения контр-

астного изображения:

- электронная микроскопия срезов биологической ткани;

- методика замораживания-скалывания;

- методика травления;

- методика приготовления реплик.

Во

всех

случаях к препарату для электронной микроскопии

предъявляют три основных требования:

- препарат должен быть достаточно тонким;

- разные участки препарата должны в разной степени рассеивать

электроны;

- исследуемые объекты должны быть устойчивыми по отношению

бомбардировке электронами и выдерживать вакуумное разреже-

ние

до 10~

- 10 мм рт. ст.

Из

этих требований

следует,

что изучать живые организмы и

клетки

живых организмов в физиологических условиях невозмож-

но.

При проведении электронной микроскопии биологических объ-

ектов всегда имеют дело с обезвоженными клетками, обработанны-

ми

солями или соединениями тяжелых металлов. Практически мак-

симально допустимая толщина среза составляет около 0,1 мкм

©о

(1000 А ) для получения разрешения около 100 А и от 50 до 100 А

при

разрешении в 10 А . Так как толщина большинства клеток жи-

вотных от 1 до 50 мкм, то кусочки ткани после обезвоживания зали-

вают в эпоксидную смолу, желатин, метилметакрилат. После пол-

имеризации

блок

режут

при помощи ультрамикротома со стеклян-

ными

или алмазными ножами на слои толщиной от 500 до 1000 А .

Эти срезы контрастируют ("окрашивают") растворами солей молиб-

дена, марганца, вольфрама, свинца, урана, четырехокиси осмия.

Атомы

тяжелых металлов реагируют в основном с молекулами бел-

ка:

создают в клетках участки с высокой электронной плотностью.

Для получения истинной картины исследуют большое число срезов

- методика получения серийных срезов с их анализом в порядке

получения (на 1 мм ткани до

100000

срезов).

Методика замораживания-скалывания состоит в быстром замора-

живании

образца, затем при помощи ультрамикротома, нож котор-

рого не срезает, а скалывает образец по липидному бислою, образо-

ванному слабыми взаимодействиями. На образованную поверх-

ность напыляют слой золота, серебра,

углерода

и при помощи ска-

нирующего электронного микроскопа производят анализ образо-

ванной

поверхности.

159

При

замораживании-травлении замороженный образец высуши-

вают в вакууме.

Методика приготовления реплик заключается в покрытии иссле-

дуемого

образца путем напыления в

вакууме

золотом, платиной,

углеродом и получении "слепка" с поверхности объекта. Для прида-

ния

жесткости реплике ее укрепляют слоем

углерода,

наносимым

напылением

в вакууме. Контур реплики повторяет поверхность

объекта.

Метод реплик получил применение для исследования биомемб-

ран,

поверхностей вирусов и кристаллов белков, которые мало ус-

тойчивы в

вакууме

при действии пучка электронов.

В большинстве случаев биологические объекты (белки, нуклеи-

новые кислоты) помещают на пленку-подложку из

углерода

или

пластика (формвара, парлодиона), прозрачную для электронного

пучка. Пленка толщиной до 1000 А размещается на медном диске-

сетке с отверстиями приблизительно 75 мкм.

Для проведения электронно-микроскопического исследования

макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, их комплексов), ви-

русов, фагов, рибосом используют метод оттенения при малом

угле

напыления

углеродом, золотом, платиной.

Электронная

микроскопия позволила установить молекулярную

структуру

разнообразных и многочисленных биологических мемб-

ран

и положила конец спорам об их наличии, существовании. С ее

помощью проведена реконструкция субклеточных структур, орга-

нелл,

клеточных контактов, мембранных рецепторов. Электронная

микроскопия

помогла понять механизм выполнения ряда функций

мембран.

Метод электронной микроскопии используют для идентифика-

ции

чистоты фракции ядерных, митохондриальных мембран, вези-

кул шероховатого эндоплазматического ретикулума, содержащего

на

своей поверхности рибосомы.

Сочетание метода электронной микроскопии с методами гисто-

химии позволяет изучить распределение биологически важных

макромолекул в различных компартментах клетки.

Метод электронной микроскопии позволяет ответить на много-

численные вопросы о распространении мембранных структур, их

взаимоотношениях, особенностях структуры мембран различных

органелл и субклеточных частиц и образований. Но это статика

клетки

при определенных подготовительных процессах, полностью

исключающих возможность изучения динамики и механизмов фун-

кционирования

мембранных машин. Подготовительные процессы

160