Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

но

проанализирован М.Диксоном. Он предложил строить графики

зависимости lg

Vmax

от рН и lg Km от рН (рис.3.34,

3.35).

Исследуя влияние рН на максимальную скорость ферментатив-

ной

реакции, можно получить информацию о тех группах фермен-

та, ионизационное состояние которых влияет на активность ката-

литического центра. Величина рК, полученная из рН зависимости

максимальной скорости (см. рис.3.34), характеризует рК того ами-

нокислотного остатка, ионизация или деионизация которого необ-

ходима для превращения субстрата, причем рК' - -lgK, где К - кон-

станта диссоциации группы.

По

величине рК можно определить, какие аминокислотные ос-

19 v

Рис. 3.34. Изучение рН-зависимостей кинетических

параметров

ферментативных

реакций

РН

Рис. 3.35. Изучение рН-зависмостей кинетических

параметров

ферментативных

реакций

141

татки принимают непосредственное участие в катализе (существу-

ют таблицы рК аминокислот). Не всегда можно иметь однозначные

ответы на такие вопросы, так как рК для многих аминокислот сов-

падают и в этом

случае

необходимо применять дополнительные фи-

зико-химические методы исследования.

По

характеру зависимости константы Михаэлиса от рН можно

судить о природе групп,

участвующих

в образовании фермент-суб-

стратного комплекса, ионизованное или деионизованное состояние

которых необходимо для образования комплекса. Полученные та-

ким

образом величины рК характеризуют аминокислотную

группу,

которая

находится в центре связывания и принимает участие в об-

разовании

комплекса.

Из

графика зависимости lg V/K

от рН получают величину рК

для свободного фермента или субстрата. При этом применяется ме-

тод касательной к точке перегиба, анализируются в основном вог-

нутые участки (см. рис.

3.35).

Таким

образом, с помощью

трех

графических построений можно

установить, какие величины рК отвечают группам свободного фер-

мента, фермент-субстратного комплекса или субстрата. Примером

фермента, детально изученного с точки зрения влияния рН на ки-

нетические параметры, может служить фумараза (фермент, пре-

вращающий фумарат в малат). Были рассчитаны графическим пу-

тем рКа и рКв для свободного фермента, равные соответственно 6,2

6,8. Из этих величин рК

следует,

что в состав его активного цент-

ра

входит

имидазольная группа гистидина. Если зависимости

lgVmax

от рН субстрата и

lgK

от рН совпадают, можно сделать вы-

вод, что ионизация одних и тех же групп необходима для связыва-

ния

и превращения субстрата.

Часто

Vmax

сильно зависит от рН, a Km практически не зависит. В

таких случаях

следует

проверить рН-зависимость не только пара-

метров полной реакции, но и индивидуальных констант.

Графический

анализ зависимости активности фермента от рН

субстрата имеет серьезные недостатки. В первую очередь рК сво-

бодных аминокислот может отличаться от рК аналогичных амино-

кислотных остатков в белке на 1-3 единицы рН. Поэтому иденти-

фикация

природы группы только по величине рК весьма сомнитель-

на,

если нет

других

независимых данных, подтверждающих данные

рН-зависимости.

Данные методы обработки можно использовать и для изучения

механизмов ингибирования. Так, анализируя зависимость констан-

ты диссоциации ингибитора от рН субстрата, можно сделать выводы

142

об аминокислотных группах, которые

участвуют

в связывании ин-

гибитора. В некоторых случаях это может служить контролем того,

является

ли ингибирование истинно конкурентным или кажущимся

конкурентным.

В случае конкурентного ингибирования значения

рК

для субстрата и ингибитора должны совпадать.

КОНТРОЛЬНЫЕ

ВОПРОСЫ

И ЗАДАЧИ

Что понимают под термином "скорость химической реакции"?

В каких единицах выражается скорость биохимической реакции?

Каков физический смысл константы скорости реакции?

Что называется порядком реакции по веществу?

Может

ли порядок реакции быть нулевым, дробным, отрицательным?

Почему молекулярность реакции не превышает трех? В чем различие понятий

"порядок" и "молекулярность" реакции?

Какими уравнениями описываются зависимости концентраций реагирующих

веществ

от времени в случае необратимых реакций второго порядка?

Можно

ли на основании определения порядка реакции судить о ее сложности?

Может

ли молекулярность реакции быть дробной величиной?

10.

Можно

ли определить константу ki (см. схему реакции) параллельной

необ-

ратимой реакции первого порядка, измеряя только текущие концентрации веществ

АиВ?

11.

Какова функциональная зависимость изменения концентрации реагирующих

веществ

со временем в последовательной реакции А - В - С?

12.

Изобразите

графически изменение концентрации со временем участников по-

следовательной

реакции А -» В -» С.

13.

Как формулируется правило Вант-Гоффа о температурной зависимости ско-

рости

реакции? Что представляет

собой

температурный коэффициент скорости ре-

акции? Каково его значение для ферментативных реакций?

14.

Может

ли температурный коэффициент скорости реакции быть меньше 1?

Если

да, то для каких реакций? Приведите примеры.

15.

Каков физический смысл энергии активации?

16.

Какую информацию можно получить при изучении зависимости константы

скорости

ферментативной реакции от температуры?

17.

Можно

ли энергию активации рассчитать теоретически или оценить каким-

либо

эмпирическим путем?

18.

При изучении превращения некоторого исходного вещества в продукт, кото-

рое

протекает по реакции первого порядка, были получены следующие данные:

Т.К

293 298 308 313 318 323

к- Юс' 1,76

3,3813,524.749,8

75,8

Определите

энергию активации с помощью диаграммы Арреииуса.

19.

При определении каталитической актишюсти пептидазы из тонкого кишечни-

ка, гидролизующей дипептид

глицилглицин

по реакции:

Глицилглицин

И2О—»

2 глицин,

были получены следующие экспериментальные данные:

143

[S]

.ммоль

Продукт

мг/мин

1.5

0.21

2.0

0,24

По

этим данным определите

грае

3,0

0,28

шческим

4,0

0,33

8,0

0,40

путем величины Кщ и Ymax

16,0

0.45

для этого

препарата фермента.

20.

Приведенные ниже данные были получены при изучении конкурентного ин-

гибирования, вызываемого а- /?-оксиметиласпартатом в системе с /3-метиласпарта-

зой.

Ингибитор изучали в системе с наилучшим субстратом, концентрация

ингибитора 5- 10 моль.

у(без1)

0,014(71,4)

0.026

(38.4)

0,092 (10,8)

0,136(7,3)

0.150

(6.6)

v (с добавл. I)

0,006

(166,6)

0,010

(100)

0,040

(25)

0.086(11,6)

0,120(8,3)

0,165(6) 0,142(7)

скобках - обратные значения величин v и S. Определите Кщ и Km ' (в присутст-

вии ингибитора) Y'max и Ymax. а также К| (константу ингибирования данной фер-

ментативной реакции).

21.

Пестицид ингибирует активность данного фермента А. В лаборатории опреде-

лена зависимость V or

[S].

510 (20000)

10'

(10000)

510 (2000)

1,5 10"

(666,6)

2,5

1Q"

(400)

10'

(200)

[S],

моль/л

3,3

10"

5,0

•

10'

6,7

•

10'

1,65-

10"

2,21

•

10"

V, моль/мин 10

без

ингибитора

129

149

моль

103

125

Определите,

к какому типу ингибиторов можно отнести исследуемый пестицид.

22.

В таблице (см. ниже) приведены начальные скорости катализируемой фер-

ментом реакции при различных концентрациях субстрата:

а)

определите Ymax и Km методом Лайнуивера-Берка;

б)

определите те же величины методами Иди-Хофсти, Хейнса, Корниш-Боудена

Диксона.

[S],

моль

4,1

•

10~

9.5-

10'

5,2-

10"

1,03-10'

4,9-

10"

1.06-

10"

5.1

•

10~

V, моль/

•

мин

•

177

173

125

106

10'

144

23.

Какие виды конкурентного ингибирования Вам известны?

24.

Каковы механизмы смешанного ингибирования?

25.

Назовите методы определения константы ингибирования (Ki).

26.

Определить Vmax и Кщ для ферментативной реакции по следующим данным,

используя графические методы.

[S],

моль V,

мкмоль/мин

2,5-

10'

4,0-

10"

•

10'

•

10'

10~

112

•

10"

128

10"

139

•

10"

140

27.

При нагревании раствора гексокиназы в течение 12 мин при 45°С фермент те-

ряет 50% активности. Но если гексокиназа инкубируется при 45 С в присутствии

очень большой концентрации одного из ее субстратов (глюкозы), то она утрачивает

лишь

3% активности. Объясните, почему тепловая денатурация гексокиназы

замед-

ляется

в присутствии большой концентрации субстрата.

28.

Метанол

очень токсичен, прием 30 мл

внутрь

приводит к смерти. Это обуслов-

лено

продуктом его метаболизма - формальдегидом.

Метанол

быстро окисляется до

формальдегида под действием фермента печени алкогольдегидрогеназы. Одним из

методов

лечения при отравлении метанолом являются внутривенные вливания эта-

нола или прием вовнутрь, причем в количествах, которые у здорового человека вы-

зывают интоксикацию. Объясните, почему такое лечение является эффективным?

СПИСОК

РЕКОМЕНДУЕМОЙ

ЛИТЕРАТУРЫ

Бейли

Дж.,Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.,

1989.

Т.1 692

с.

е р е з и н И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного

катализа. М., 1977. 279 с.

Варфоломеев

С.Д., Зайцев СВ. Кинетические методы в биохимических

исследованиях.

М., 1982. 343 с.

Кантор Ч.,Шиммел П. Биофизическая химия. М.,

1984.

Т.1-3.

е л е т и Т. Основы ферментативной кинетики. М., 1990. 348 с.

Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., 1979. - 280 с.

о э н Ф. Регуляция ферментативной активности. М., 1986. 144 с.

Попов

Е.М. Структурная организация белков. М., 1989. 351 с.

Рубин

А.Б., П ы т ь е в а Н.Ф., Ризниченко Г.Ю. Кинетика биологиче-

ских

процессов. М., 1987. 299 с.

Фримантл М. Химия в действии. М., 1991. 528 с.

145

ГЛАВА

МЕМБРАНОЛОГИЯ

Естественный ход развития современной физико-химической би-

ологии привел к

выводу

о первостепенном значении биологических

мембран почти во

всех

проявлениях жизнедеятельности клеток и

организма. Рост и развитие, питание, обмен веществ и выделение,

регуляция клеточной деятельности, взаимодействие клеток и орга-

низма

с внешней средой, фотосинтез, зрительное восприятие, нерв-

ная

деятельность, эндокринная регуляция функций, иммунные ре-

акции

и др. осуществляются при непосредственном участии разно-

образных общих и специализированных мембран. Мембранные

структуры

лежат

в основе пространственной организации бактери-

альной,

растительной и животной клеток.

Возникновение

патологических состояний, заболевания, как

правило,

связано с изменением функционирования биологических

мембран.

Таким

образом, знание основ мембранологии становится обяза-

тельной составной

частью

подготовки биолога, медика, специалиста

области растениеводства, ветеринарии, лесного хозяйства и дру-

гих специалистов.

1. Терминология

Биологические

мембраны

(лат. membrana - оболочка, кожица,

перепонка)

- поверхностные

структуры

молекулярного размера (в

среднем

8,0-12,0

им), отграничивающие клетку от внешней среды

(поверхностная, наружная, плазматическая мембрана) или внутри-

клеточные органоиды, частицы от цитоплазмы (ядерная, митохонд-

риальная,

лизосомальная и

другие

мембраны), выполняющие ряд

общих и специальных функций.

Искусственные

мембраны

- мембраны, получаемые в экспери-

менте из смеси липидов.

Модифицированные

мембраны

- мембраны с включением раз-

личных веществ, изменяющих их

структуру

и функции. Для этой

цели чаще всего используют белки (антибиотики, ферменты и др.).

Матрикс

- цитоплазма, внутриклеточное содержимое, за исклю-

чением органоидов.

Биоэлектрогенез

мембран

- способность мембран реализовывать

процессы,приводящие к возникновению разности электрических

146

потенциалов по обе ее стороны, чаще всего

между

наружной средой

содержимым мембраны.

Проницаемость

мембран

- способность мембран пропускать ато-

мы,

ионы, молекулы как в прямом, так и в обратном направлениях.

Полупроницаемость

мембран

- способность мембран пропускать

в прямом и обратном направлениях одни ионы, молекулы, частицы

не пропускать другие.

Селективные

мембраны

- мембраны, избирательно переносящие

одни ионы, молекулы и не пропускающие другие.

Транспорт

веществ

через

мембрану

- перенос веществ через

мембрану.

Транспорт

веществ

активный

- перенос веществ через мембра-

ну против градиентов с затратой энергии АТФ при участии специ-

альных молекулярных

структур

- приводит к возрастанию величи-

ны

локальной свободной энергии за счет расходования энергии

АТФ.

Транспорт

веществ

пассивный

- перенос через мембрану ве-

ществ по градиенту, главным образом за счет механизма диффузии

осмоса; идет за счет уменьшения свободной локальной энергии.

Некоторые термины

будут

объяснены при последующем изложе-

нии.

2. Краткая история мембранологии

История

учения о мембранах связана с историей цитологии и ги-

стологии, развитием оптических и физико-химических методов ис-

следования, так как мембраны являются не только составной час-

тью клеток (наружная мембрана), но и практически

всех

ее важ-

нейших органелл, компонентов: ядер, митохондрий, хлоропластов,

эндоплазматической сети, лизосом и др.

Термин "клетка" был предложен в 1665 г. изобретателем микро-

скопа англичанином Робертом Гуком при описании тонкого среза

коркового дерева.

При

систематическом изучении клеток животных (эритроцитов,

сперматозоидов) и. бактерий основатель научной микроскопии гол-

ландский исследователь Антони ван Левенгук описал в 1677 г. об-

щие черты строения разнообразных клеток.

Однако прошло более 150 лет, прежде чем в 1838 г. М.Шлейден,

а затем немецкий анатом Т. Шван

(1839)

утвердили принцип кле-

точного строения

всех

живых организмов. В 1958 г. Р.Вирхов обос-

новал утверждение, что все живые одноклеточные и многоклеточ-

147

ные организмы (бактерии, растения, животные) возникают из

клетки и имеют клеточное строение ("каждая клетка - из клетки").

Термин "мембрана" был введен более 100 лет назад для обозначе-

ния

клеточной поверхности, отделяющей клетку от среды и

друг

от

друга

и для обозначения полупроницаемой оболочки, пропускаю-

щей

воду

и ряд растворенных в ней веществ.

Первые исследования мембран были связаны с их осмотическими

свойствами. Так, 1851 г. немецкий физиолог X. фон Моль исследо-

вал плазмолиз и деплазмолиз растительных клеток и пришел к вы-

воду,

что клеточные стенки функционируют как полупроницаемые

мембраны, а клетки

ведут

себя как осмометры.

В 1855 г. ботаник К. фон Негели на интактных и поврежденных

растительных клетках исследовал проницаемость пигментов в клет-

ки

через клеточную поверхность, которую назвал плазматической

мембраной.

Следует

выделить работы немецкого ботаника и физико-химика

В.Пфеффера, который работал с искусственными осадочными мем-

бранами и провел аналогию их функционирования с клеточными

мембранами. Осмотические свойства растительной клетки

изучал

шведский ботаник X. де

Фриз.

На

физико-химический

подход

к исследованию биомембран ока-

зали большое влияние создание теории осмотического давления

Я.Вант-Гоффом и обоснование теории электролитической диссоци-

ации

С.Аррениусом.

именем немецкого физико-химика

В.Оствальда

связано изуче-

ние

возможной роли мембран в происхождении биоэлектрических

явлений.

Значительный вклад в исследование механизмов проницаемости

клеточных мембран внесли

труды

Э.Овертона и его сотрудников,

которые с 1885 до 1902 г. изучили проницаемость поверхностой

мембраны клеток для более чем 500 различных веществ. На основе

результатов

исследования ими сформулированы эмпирические за-

коны

клеточной проницаемости, ряд из которых не

утратил

своего

значения

и в настоящее время (зависимость проницаемости мемб-

ран от полярности и величины электрического заряда проникающе-

го иона, способности проникающего вещества растворяться в липи-

дах и проникать через мембрану, зависимость скорости проницае-

мости от степени диссоциации

исследуемого

вещества и др.).

Э.Овертон считал, что мембрана состоит из липидов, образующих

непрерывный слой.

Для более конкретного представления о строении мембран много

148

дали количественные измерения величины поверхности эритроци-

тов и поверхности липидов, входящих в состав мембраны эритроци-

тов, проведенные Е.Гортером и Ф.Гренделем в 1925 г. Поверхность

экстрагированных из эритроцита

рной

оболочки липидов оказалась

в два раза больше, чем поверхность эритроцитов, что позволило ут-

верждать о двухрядном расположении липидов в биомембране. Ин-

тересно, что при извлечении липидов ацетоном экстракция была

неполной,

но так как ими было допущено занижение площади эрит-

роцитов, то эти две ошибки удачно скомпенсировались, что позво-

лило сделать правильное заключение.

Проведенные в 1928 г. С.Гелфаном и в 1930 г. Л.Блинксом при

помощи микроэлектродов работы по измерению электрического со-

противления поверхностного слоя клеток показали их большую ве-

личину (десятки и

даже

сотни тысяч Ом на см ), что подтверждало

липидную

структуру

биомембран.

Однако измерения величин поверхностного натяжения показали

значительно более низкие значения, чем для липидного слоя, что

могло свидетельствовать о нахождении на липидном слое молекул

другого

слоя, снижающего поверхностное натяжение. Такими ве-

ществами могли быть белки.

Это позволило Дж.Даниелли и Х.Давсону в 1935 г. предложить

бутербродную

модель (модель сандвича) строения биологической

мембраны. Принципы этой модели в видоизмененном виде сохране-

ны

в многочисленных современных моделях строения биомембран.

Согласно этой модели мембрана состоит из

двух

липидно-белковых

слоев. Причем наружный ряд белка обращен к внешней среде или

цитоплазме, а внутренние ряды липидов обращены

друг

другу.

При

рассмотрении в поперечном направлении мембрана имела три

слоя: однорядный белковый, двурядный липидный if однорядный

белковый; или два слоя, состоящих из ряда липида и ряда белка

каждый.

Споры и работы по выяснению строения и функций мембран про-

должались. Мембрану необходимо было увидеть, а для этого извест-

ные методы оптической микроскопии не годились: слишком мало

было разрешение. Даже ультрафиолетовая микроскопия имела пре-

дел разрешения порядка

2000

А. Но уже в 1939 г. М.Кноль и Г.Рус-

ка

предлагают электронный микроскоп, разрешающая способность

которого имела десятки ангстрем. Однако не было методов подго-

товки клеток для электронной микроскопии, которая требовала

контрастирования и обезвоживания ультратонких срезов. Но и эти

трудности были преодолены. Появились серии работ Дж.Робертсо-

149

на,

Ф.Шестранда. В 1974 г. они получили Нобелевскую премию за

цикл

работ по изучению биомембран при помощи электронной

микроскопии.

Первая

Нобелевская премия в области мембранологии была по-

лучена

в 1961 г. Дж.

Бекеши

за исследование роли

слуховых

бази-

лярных мембран (область отоларингологии).

Необходимо подчеркнуть, что, начиная с 1963 г., Нобелевские

премии

в области медицины стали присуждать работам, в опреде-

ленной

степени связанным с исследованиями биологических мемб-

ран.

В 1963 г. А.Ходжкин,

А.Хаксли

и Дж.Эклс получили эту награ-

ду за серию блестящих исследований по выявлению роли биомемб-

ран

в электрогенезе потенциалов покоя и потенциалов действия; в

1964 г. ФЛайнен - за изучение мембранных липидов, связанных с

биоэнергетикой;

в 1967 г. -

Дж.Уолд

- за исследование мембран зри-

тельных клеток (область офтальмологии); в 1970 г. -

Дж.Аксельрод

др. - за изучение роли лизосом в области клеточной патологии; в

1971 г. Е.Сазерленд - за работы по исследованию мембранных ре-

цепторов гормонов и вторичных мессенджеров; в 1972 г. Дж. Эдель-

ман

и др. - за выяснение антигенных свойств клеток и клеточных

мембран.

Исследованиями

биологических мембран занимаются не только

представители таких наук, как цитология, гистология, биооргани-

ческая химия, биохимия, биофизика, физиология, генетика, моле-

кулярная

биология.

Структуру

и функции биомембран и искусст-

венных мембран широко

изучают

в таких областях науки, как эмб-

риология,

онкология, технология создания искусственных меди-

цинских

материалов и искусственных органов, трансплантацион-

ная

иммунология, фармакотерапия, психиатрия.

Искусственные мембраны широко применяют в крупнотоннаж-

ных технологических процессах, таких как переработка нефти и

получение нефтепродуктов, в лакокрасочной промышленности, при

очистке сточных вод и улавливании различных примесей, при пере-

работке сельскохозяйственной и животноводческой продукции, в

медицине,

ветеринарии и многих

других

областях.

В последнее десятилетие мембранология стала претендовать на

то,

чтобы считаться самостоятельной наукой, возникла мембранная

биология.

Однако каждая наука имеет свои области исследования и

применения,

поэтому мы выясним роль биомембран в области био-

физики,

где такие разделы, как фотобиология, радиобиология,

электробиология, кинетика биологических процессов и др., невоз-

можно понять без знания

структуры

и функций биомембран.

150