Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

действие ферменты проявляют в водных растворах и поэтому явля-

ются гомогенными катализаторами. Но без применения теории ге-

терогенного катализа

трудно

представить механизмы ферментатив-

ных реакций, так как ферменты относятся к высокомолекулярным

белкам, и необходимо

учитывать

существование в растворе фер-

ментов микроповерхности раздела, характерной для гетерогенных

катализаторов. К

тому

же каталитическая активность ферментов

обусловлена специфической реакционной способностью групп ак-

тивного центра и

структурой

укладки полипептидного каркаса.

Многие

ферменты функционируют лишь в связанном со

структур-

ными

компонентами клетки состоянии (ферменты цикла трикарбо-

новых кислот, АТФ-азы).

Таким

образом, ферменты характеризуются признаками как го-

могенных, так и гетерогенных катализаторов. Кроме того, они об-

ладают

рядом особых свойств, отличающихся от катализаторов не-

биологической природы. Главное отличие - исключительно высокая

каталитическая активность и ярко выраженная специфичность дей-

ствия.

Ферменты,

как и

другие

катализаторы, ускоряют только реак-

ции,

протекание которых термодинамически возможно, т.е. реак-

ции

с уменьшением свободной энергии AG < 0. Ферментативный

катализ характеризуется выигрышем энергии активации в 16 - 18

ккал,

в то время как катализаторы небиологической природы

дают

снижение

энергии активации на 4 - 7 ккал (рис. 3.9,

3.10).

Кинети-

ческие исследования показывают, что скорость ферментативных

реакций

определяется не только энергией активации, но и энтро-

пийным

фактором, причем их взаимодействие для ферментов более

выражено, чем для небиологических катализаторов.

Ферменты несоизмеримо продуктивнее катализаторов небиоло-

гического происхождения и

обладают

не только высокой каталити-

ческой активностью, но и способностью изменять ее под влиянием

изменения

микроокружения белковой молекулы или при измене-

нии

условий внешней среды. Ферменты ускоряют лишь те биохими-

ческие процессы, скорость которых в

отсутствие

катализатора (при

данных условиях температуры, рН среды) весьма мала.

4. Физико - химические механизмы ферментативного катализа

Первая

теория ферментативного катализа принадлежит Э. Фи-

шеру.

Она известна в науке как "ключ-замок", т.е. Фишер предло-

жил статическую модель ферментативного катализа, предполагаю-

щую очень

жесткую

подгонку

субстрата

к активному центру фер-

мента.

ill

Энергия

активации

отсутствие

катализатора

Реагенты

Энергия

активации

присутствии

катализатора

Продукты

Координата реакции °-

Рис.

3.9. Уменьшение энергии активации реакции с помощью катализатора

Минимальная

энергия,

необходимая

для

ката-

лизированной

реакции

Минимальная

энергия,

необходимая

для

некаталиэиро-

ванной

реакции

Энергия

столкновения • -

Рис

3.10. Увеличение частоты столкновений, приводящих к реакции, в присутст-

вии катализатора

Важным этапом в изучении механизмов ферментативного ката-

лиза были работы американского биохимика Д. Кошланда, предло-

жившего динамическую модель ферментативного катализа, или те-

орию индуцированного

структурного

соответствия фермента и суб-

страта. В соответствии с этой теорией

субстрат

при взаимодействии

с активным центром фермента вызывает существенные изменения

его конформации, поэтому и происходит точная переориентировка

функциональных групп активного центра. Главная причина увели-

чения

скорости реакции состоит в замене маловероятной реакции

высокого порядка на высокоэффективную более низкого порядка.

Согласно модели Кошланда специфичность и каталитическая ак-

тивность фермента связаны

друг

другом,

но их механизмы раз-

личны, и ферментативная реакция осуществляется при взаимном

расположении сорбирующих и каталитических центров фермента.

Ряд фактов действительно

свидетельствует

об изменении кон-

формации

ферментов в присутствии

субстрата.

Например,

субстра-

112

ты индуцируют диссоциацию глутаматдегидрогеназы на субъедини-

цы.

Спектр поглощения химотрипсина изменяется при его взаимо-

действии с субстратом за счет вызванных изменений конформации

молекулы фермента.

По

современным представлениям, среди механизмов, которые

играют главную роль в образовании фермент-субстратного комп-

лекса, можно выделить следующие: 1) образование ковалентных

связей;

2) гидрофобное взаимодействие

между

неполярными

угле-

водородными радикалами молекул субстрата и дегидратированны-

ми

участками белковой глобулы; 3) электростатическое взаимодей-

ствие

между

заряженной группой субстрата и ионизированными

группами фермента; 4) образование водородных связей.

Общим для большинства ферментных систем является то, что

субстрат

связывается с их активным центром двумя или большим

числом точек. В качестве примера можно указать на сорбцию моле-

кулы субстрата на активном центре папаина: молекула субстрата

связывается с белком за счет гидрофобных взаимодействий, допол-

нительную ориентацию ей придают три водородные связи с амино-

кислотными

остатками белка Gly-66,

Asp-158.

Образование много-

точечных комплексов способствует

тому,

что полипептидные цепи

белка, и особенно боковые группы аминокислотных остатков, не за-

фиксированы

слишком жестко и подвижны.

Рентгенография

фермент-субстратного комплекса

дает

прямую

информацию

о конформационных превращениях белка. Так, ак-

тивный

центр лизоцима расположен в специальной полости, при

вхождении субстрата полость сужается и более плотно "зажимает"

субстрат

(смещение на

0,075

нм). Не менее важную роль в образо-

вании

фермент-субстратного комплекса играет повышенная микро-

вязкость

активного центра. Многоточечный характер комплексооб-

разования

при взаимодействии фермента с субстратом в сочетании

с повышенной микровязкостью активного центра приводит к прак-

тически полной диффузионной неподвижности молекул субстрата,

что способствует уменьшению энтропии при образовании фермент-

субстратного комплекса. При сорбции активным центром молекулы

субстрата она переходит из водного окружения в окружение, со-

зданное аминокислотными остатками. Молекула субстрата оказы-

вается в поле сильных электрических взаимодействий

между

реа-

гентами, которые вносят существенный вклад в энергетику фермен-

тативного катализа, т.е. в процесс снижения энергии активации ре-

акции.

Фермент-субстратный комплекс может образовываться при уча-

113

стии различных связей: ковалентных, ионных, водородных и гидро-

фобных взаимодействий. Поэтому конформационное изменение

пространственной структуры фермента происходит без разрыва

пептидных связей, т.е. без изменения первичной структуры.

Образование фермент-субстратного комплекса происходит, как

правило, при участии функциональных групп белка, которые не

принимают участия в последующей химической модификации мо-

лекул субстрата.

В процессе образования фермент-субстратного комплекса с по-

мощью рентгеноструктурного анализа выявлены два типа конфор-

мационных перестроек:

1. Локальные конформадионные перестройки (не более 1,5 нм).

Они

связаны с изменением небольшого участка полипептида и бо-

ковой группы аминокислотного остатка. Например, в молекуле кар-

боксипептидазы при связывании с липидом (субстратом)

Туг248

смещается на 1,2 нм.

2. Крупномасштабные конформационные перестройки, сопро-

вождающиеся смещением на расстояние более 1,5 нм. Это может

быть обусловлено смещением структурных доменов. Например, в

молекуле гексокиназы при связывании с лигандом происходит пе-

реориентация доменов.

Таким образом, по теории Кошланда, комплементарная

структу-

ра активного центра образуется в молекуле фермента не заранее, а

в процессе ферментативной реакции.

Есть точка зрения (В. Дженкс, 1972), что силы сорбции исполь-

зуются для создания напряжений (деформаций) в молекулах реаги-

рующих компонентов, что уменьшает энергию активации фермен-

тативной реакции. При этом предполагается, что активный центр

устроен так, что в

результате

деформации молекула субстрата ак-

тивируется. Ни

субстрат,

ни фермент не имеют жесткой конформа-

ции,

поэтому при связывании наблюдаются конформационные пе-

рестройки

всех

участков ферментативного процесса. Термодинами-

ческая сущность

всех

теорий одна и та же: потенциальная свобод-

ная

энергия связывания субстрата на ферменте тратится на сниже-

ние

энергии активации последующей химической реакции.

Комплексообразование субстрата с ферментом концентрирует и

взаимно ориентирует реагирующие частицы (молекулы субстратов,

группировки активного центра), увеличивая число эффективных

соударений. Это означает повышение предэкспоненциального мно-

жителя в уравнении Аррениуса. Образование фермент-субстратно-

го комплекса снижает энергию активации реакции. Это происходит

114

за счет изменения распределения электронной плотности в молеку-

ле субстрата путем ее насильственной деформации при образовании

комплекса

(молекула субстрата как бы становится на "дыбы"), свя-

зи

растягиваются и разрываются при значительно меньшей затрате

энергии.

Энергия, выделяющаяся при образовании фермент-суб-

стратного комплекса или при протекании одной из стадий сложной

ферментативной реакции, не диссипируется, а используется для

преодоления активационных барьеров следующих стадий фермен-

тативной реакции.

Для ферментативного катализа необходима вся белковая

глобу-

ла. Нельзя "отрезать" часть белковой цепи без ущерба для активно-

сти фермента. Фермент представляет собой "дрожащую, пульсиру-

ющую"

структуру,

причем случайные броуновские движения доме-

нов

обеспечивают молекуле энергию, необходимую для того, чтобы

произошли

спонтанные перестройки

между

открытыми и закрыты-

ми

конформациями. Динамика белковой структуры играет решаю-

щую роль в ферментативном катализе.

В одной из последних моделей ферментативного катализа, пред-

ложенной

Д.С. Чернавским, источником энергии также является

сорбция

субстрата, которая вызывает статические напряжения в

белковой части фермента. В молекуле белка как бы запасается

энергия

сорбции, и ее можно представить как пружину, при перехо-

де энергии на

атакуемую

связь - как движение стержня. Отличие

этой

модели от известной под названием "дыбы" состоит в том, что

запасаемая энергия расходуется не сразу и не на первой, а на любой

стадии процесса. Д.С. Чернавским разработаны задачи для опреде-

ления

степени сжатия молекулы белка при образовании фермент-

субстратного комплекса. Приток субстрата в ферментативной реак-

ции

не является постоянной величиной, эта функция носит слож-

ный

характер. Поэтому в поведении ферментативной системы воз-

можно наличие

двух

или более стационарных состояний. Системы,

обладающие двумя или несколькими стационарными состояниями,

между

которыми возможны переходы, называются триггерными.

Причем

переход из одного стационарного состояния в

другое

может

совершаться различным путем в зависимости от направления изме-

нения

значения параметра. Такое свойство систем называют гисте-

резисом.

Множественность стационарных состояний и связанные с

этим

триггерные и гистерезисные явления играют важную роль как

средство регулирования биологических систем: внутриклеточные

процессы метаболизма, транспорт веществ через мембраны. Наряду

с триггерными ритмами возможны автоколебательные процессы.

115

Обнаружение биологических часов с эндогенным ритмом послужи-

ло убедительным доказательством, что источником биологических

ритмов является автоколебательная система биохимической реак-

ции

внутри клетки.

В ферментативном катализе важную роль

могут

играть кислот-

но-основный,

ковалентный, электростатический и многофункцио-

нальный катализы. В процессе кислотно-основного катализа проис-

ходит

захват

или отдача протона молекулой катализатора - молеку-

ла субстрата подвергается химической атаке не одной каталитиче-

ской

группой, а сразу несколькими. Это связано с тем, что третич-

ная

структура

белка позволяет сосредоточить в активном центре

значительное число электрофильных и нуклеофильных групп, та-

ких как имидазольная, карбоксильная SH-группы, аммонийная,

фенольная.

Причем взаимодействие с субстратом одной функцио-

нальной группы может быть усилено за счет

других.

В последние годы активный центр ферментов, действующих на

полимерные субстраты (протеазы, карбогидразы), рассматривают

как

центр, состоящий из отдельных участков или "сайтов". Каждый

"сайт" связывает мономерный остаток полимера. В состав связую-

щего участка лизоцима

входят

6 "сайтов" (Филлипс и сотр.). Прово-

дятся работы по картированию активных центров карбогидраз.

Таким образом, в настоящее время не

существует

единой теории,

объясняющей уникальные каталитические свойства ферментов и

высокую специфичность действия. Однако для небольшого числа

ферментов, первичная

структура

и физико-химические свойства

которых исследованы, был выдвинут целый ряд вполне вероятных

гипотез, подтвержденных результатами экспериментов с помощью

методов рентгеноструктурного анализа, электронного парамагнит-

ного резонанса, спектроскопических методов. Общими положения-

ми

этих гипотез являются:

1) сорбция субстрата на активном центре фермента определяется

соответствием

между

пространственной и электронно-химической

структурой молекулы субстрата и химическими группировками ак-

тивного центра и облегчает протекание последующей химической

реакции;

2) полифункциональный характер химического взаимодействия

между

ферментом и сорбированным субстратом;

3) эффекты микросреды, характеристики которой в области ак-

тивного центра

могут

существенно отличаться от физико-химиче-

ских условий

других

участков белковой молекулы.

116

5. Кинетика ферментативных реакций

Кинетика

ферментативного катализа - это учение о скоростях и

механизмах ферментативных реакций. Кинетические исследования

начинаются с изучения зависимости концентраций продуктов реак-

ции

или каких-либо промежуточных соединений от времени. При

этом используются самые разнообразные биохимические и биофи-

зические методы определения концентраций веществ. Эксперимен-

татор для облегчения интерпретации результатов должен поддер-

живать в системе ряд параметров постоянными (рН, температуру,

концентрацию

ингибиторов).

Для объяснения полученных экспериментальных данных созда-

ют кинетические схемы, которые учитывают элементарные стадии

трансформации

молекул в виде последовательных реакций. В иде-

альном

случае

данные кинетических исследований

следует

сопо-

ставлять с данными изучения структуры фермента.

Кинетика

ферментативного катализа стала развиваться в начале

XX в. Анри в 1902 г. впервые выдвинул гипотезу об образовании в

ходе

реакции фермент-субстратного комплекса. Затем это предпо-

ложение было подтверждение экспериментально при работе с папа-

ином.

В 1913 г. Л.Михаэлис и сотр. опубликовали свою теорию общего

механизма ферментативных реакций. Они ввели понятие макси-

мальной скорости и показали, что зависимость скорости реакции от

концентрации

субстрата является равнобочной гиперболой и мате-

матически описывается уравнением Михаэлиса:

v-VmaxSo/K

+So,

(3.25)

где v - скорость реакции;

Vmax

- максимальная скорость; К

- кон-

станта Михаэлиса; So - концентрация субстрата.

Особенностью кинетики ферментативных реакций является не-

линейная

зависимость скорости v от концентрации субстрата S.

Фермент и

субстрат

реагируют обратимо с образованием комплекса

ES,

который распадается с образованием продукта и исходного фер-

мента:

S^ES^E

+ P.

k-i k-2

Если

[So ] > [E ], то [ES ] - const и реакция переходит на нулевой

порядок.

При этом

(326)

K,n+[So]'

(J>/0)

117

где

Кщ

выражается

моль/л.

Для

стационарной стадии реакции,

когда концентрация ES становится постоянной

[So

]

> [Ео ], можно

определить концентрацию

[ES]:

+ls

а скорость ферментативной реакции выразится уравнением

(328)

Кщ

+ [So ]

где

кг -

каталитическая константа, константа распада фермент-суб-

стратного комплекса,

и ее

обозначают к

ат.

случае

простых механизмов

ккат-Vmax/lEo];

(3.29)

это

будет

молекулярная активность фермента. Классическое урав-

нение

Михаэлиса стало фундаментальным принципом

всех

кинети-

ческих исследований ферментов. Формально

оно

соответствует

изотерме Ленгмюра

показывает,

что

фермент

действует

как гете-

рогенный

катализатор. Решая исходное уравнение

"Vmax[So]/K

+[So] относительно

получаем

«<^p-1)

•

[SO].

(3.30)

Значения

варьируют

пределах

10* - 10"

моль/л.

В первоначальной форме уравнение Михаэлиса неудобно для оп-

ределения кинетических параметров

Vmax

и К

. Так, по

графику

зависимости

v от [S ]

довольно сложно определить точное значение

Vmax

(рис.

3.11).

Как

правило, величины

Vmax

и К

находят

на ос-

нове линеаризации уравнения Михаэлиса. Наиболее часто приме-

к. [S]

ЛИС

)

1'ис. 3.11. Кривая на-

сыщения для

односубст-

ратной ферментативной

реакции (по Л.

Михаэ-

118

няется

график двойных обратных координат. Для этого обе части

уравнения получают в обратных величинах:

"77

г п

"*" Т7

(»5.jl)

Vmaxl-S]

Vmax

строят графики в координатах 1/v от 1/S, которые называют гра-

фиком

Лайнуивера-Берка (рис.

3.12).

mH.

Рис.

3.12. Линеаризация

уравнения Михазлиса в ко-

ординатах

Лайнуивера-Бер-

. 1

[S]

V(nax

. — - Km

Vmax/Km

Рис.

3.13. Линеаризация

уравнения

Михаэлиса в ко-

ординатах Иди-Хофсти

v/[S]

Существуют и другие методы определения кинетических кон-

стант, в частности метод Иди-Хофсти. В этом случае строят график

зависимости v от v/ [S ] (рис.

3.13).

Величину Кш получают путем деления длины отрезка, отсекае-

мого на оси ординат, на длину отрезка, отсекаемого на оси абсцисс.

Известен

также метод Хейнса для определения Km и

Vmax

(рис.

3.14).

Статистический анализ показал, что методы Иди-Хофсти и Хей-

нса

дают более точные результаты, чем метод Лайнуивера-Берка.

119

[S]

VmaX

Рис.

3.14. Линеаризация урав-

нения

Михаэлиса

в координатах

Хейнса

- Km [S]

Это связано с тем, что в графиках Иди-Хофсти и Хейнса и зависи-

мые, и независимые переменные

входят

в величины, откладывае-

мые на обеих осях координат.

Очень точный графический

метод

определения кинетических па-

раметров - график Эйзенталя и Корниш-Боудена. На нем каждой

концентрации

субстрата

кривой (Si)

соответствует

значение на-

чальной скорости. Значение [Si ] с обратным знаком откладывают

на

оси абсцисс, на оси ординат - значения vi; через полученные па-

ры точек проводят прямые, пересекающие ось ординат, и проекция

общей точки пересечения на ось абсцисс равна Km, на вертикаль-

ную -

Vmax

(рис.

3.15).

Vmax

Рис.

3.15. Определение

кинетических констант

(Km

и Vmax) по методу

-[S4]

-[S3]

-[S2]

-[Si] IS] Корниш-Боудена

Для определения кинетических параметров ферментативных ре-

акций

применяют и

метод

Диксона. На оси абсцисс откладывают

концентрации

субстрата

[S ], на оси ординат - v, точку начала коор-

120