Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

динат соединяют прямыми линиями с точками на кинетической

кривой,

соответствующими значениям

Vmax/2,

Vmax/3,

Vmax/4

...

Эти прямые отсекают на горизонтальной линии

Vmax

одинаковые

отрезки, равные К

(рис.

3.16).

KJTI Km K/n rvn

Рис.

3.16. Определение ки-

нетических констант (Кш и

Vmax)

по методу Диксона

[S]

Отрезки, отсекаемые на горизонтальной линии, одинаковы по ве-

личине только в том случае, если рассчитанное значение

Vmax

рав-

няется его истинному значению. Если значение

Vmax

меньше рас-

считанного, то с увеличением [S ] получаемые значения Km моно-

тонно убывают, если больше - возрастают. Кроме К

методом Дик-

сона можно определить и

другие

параметры ферментативной реак-

ции.

Отрезок, отсекаемый касательной при [S ] = 0 на уровне

Vmax,

равен концентрации фермента в системе (рис.

3.17).

Если известна

Рис,

3.17. Опреде-

ление концентрации

фермента (Ет) и кон-

центрации

фермент-

субстратного комп-

лекса [ES] по методу

Диксона

121

концентрация

фермента в системе, можно проверить правильность

проведения касательной. Расстояние

между

осью ординат и каса-

тельной

дает

значение [ES]. Отрезок

между

кривой и касательной

равен концентрации свободного субстрата [S ].

Каким

бы методом ни определяли или рассчитывали К

Vmax,

существует

систематическая ошибка определения, вытекающая из

самого характера этих методов.

Для численного определения величин

Vmax

и К

целесообразно

использовать методы статистической обработки результатов на

ЭВМ,

дающие помимо численных значений достоверные сведения о

величинах статистических ошибок.

Определение констант скоростей ферментативной реакции

Мы

рассмотрели различные графические методы определения К

Vmax,

входящих в уравнение Михаэлиса. Но эти параметры опре-

деляются константами скорости элементарных стадий фермента-

тивной

реакции ki и k-i, кг:

ki k

E +

S^TES

ilE+P.

k-l k-2

Константу кг можно найти из уравнения кг = Vmax/[Eo]. Кон-

станты скорости ki, k-i, k-2 определить труднее. Однако они

дают

более фундаментальные представления о реальных процессах, про-

исходящих в

ходе

ферментативной реакции. Можно узнать, напри-

мер,

насколько быстро

субстрат

взаимодействует с ферментом, и

сравнить эту величину со скоростью распада фермент-субстратного

комплекса.

Поэтому целесообразно рассмотреть эксперименталь-

ные

методы определения этих параметров.

Метод Слэтера

Строят график зависимости Km от v и получают прямую с накло-

ном

1/ki [Е] (рис.

3.18),

где k-i - константа диссоциации фермент-

субстратного комплекса. Данный метод применяют в особых

случа-

ях, когда можно в условиях эксперимента изменить кг (ингибитор,

связывающийся с субстратом без влияния на ki).

Метод Гутфройнда и Рафтона

Этот метод можно применять, если имеется специальная аппара-

тура

для изучения предстационарной кинетики. Для того чтобы по-

нять

сущность данного метода, надо провести анализ накопления

продукта ферментативной реакции во времени (рис.

3.19).

В мо-

122

tga=i/k

[E]

Рис.

3.18.

Определение

константы скорости фермен-

тативной реакции методом

Слэтера

Рис.

3.19. Кривая накопле-

ния

продукта

ходе

реакции:

предстационарное состоя-

ние;

2 -

стационарное состоя-

ние;

3 -

переходная фаза;

4 -

динамическое равновесие

мент смешения фермента

субстратом начинается предстационар-

ная

фаза продолжительностью несколько минут или миллисекунд,

в течение которой и образуются фермент-субстратные комплексы.

Предстационарная фаза далеко

не

всегда может быть выявлена

без специальной регистрирующей аппаратуры.

этой целью при-

меняют метод "остановленной струи" (Б.Чане

сотр.).

кювету

спектрофотометра

автоматической регистрацией оптической

плотности одномоментно добавляются растворы фермента

и суб-

страта

помощью специальных приспособлений

далее осуществ-

123

ляется запись накопления продукта через микросекунды. Таким об-

разом,

с помощью спектрофотометров с автоматической регистра-

цией

можно уловить предстационарную фазу, затем графически об-

работать

результаты

в координатах (Р-Ро) от времени t (рис.

3.20),

где Р - концентрация продукта в момент времени t, Pn - исходная

концентрация

продукта.

Рис.

3.20. Определе-

\ t нис длительности

нредстационарного

участка

Во многих ферментативных реакциях в реакционную смесь до-

бавляют некоторое количество продукта (измеренное) и в его при-

сутствии измеряют начальную скорость реакции.

Экстраполируя линейный участок (см. рис. 3.20) до пересечения

с осью абсцисс,

получают

длительность предстационарного состоя-

ния

г , причем т «1/ki [S ]. Из этого соотношения легко определить

ki, a k-i можно найти расчетным методом из уравнения

-k-i+k2/ki.

(3.32)

I» 6. Ингибиторный анализ

Действие большинства ферментов можно подавить, или ингиби-

ровать, определенными химическими реагентами. Изучение инги-

биторов ферментов позволяет получать ценную информацию о суб-

стратной специфичности, природе функциональных групп активно-

го центра, механизме каталитической активности ферментов. Ин-

гибиторы ферментов

служат

также полезным инструментом при ис-

следовании метаболических путей в клетке.

Существуют

ингибиторы

двух

основных типов: необратимые и

обратимые. Необратимые ингибиторы химически модифицруют

124

важные для проявления активности функциональные группы моле-

кулы фермента. Например, иодацетамид - необратмый ингибитор,

взаимодействует с SH-группами цистеина (ингибитор папаина,

глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы).

Обратимое ингибирование бывает

двух

типов: конкурентное и

неконкурентное. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстра-

том за связывание с активным центром, по своей

структуре

напоми-

нает

субстрат

данного фермента. Но в отличие от субстрата конку-

рентный ингбитор не подвергается ферментативному превращению

E + I^EI.

k-i

Классическим примером конкурентного ингибирования является

ингибирование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. В этом

случае

химические структуры ингибитора и субстрата аналогичны.

Ингибитор связывается с той же группой активного центра, что и

субстрат,

и занимает участок связывания субстрата, поэтому актив-

ность фермента уменьшается. Здесь

субстрат

и его аналог (ингиби-

тор) конкурируют за участок связывания на ферменте.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано не только

аналогами субстрата, но и другими реагентами, химическая струк-

тура

которых отличается от субстрата, но они

могут

реагировать с

функциональными группами активного центра. В активном центре

фермента различают центр связывания и каталитический центр

(способствующий превращению субстрата). При конкурентном ин-

гибировании ингибитор может связываться с обоими участками, но

влиять на группы центра связывания. Ингибитор может также вза-

имодействовать только со связующим участком, при этом образует-

ся

комплекс EI, который препятствует превращению субстрата.

Конкурентные ингибиторы изменяют (увеличивают) К

Km'-Km (1+7^7).

(3.33)

где К

- истинное значение константы Михаэлиса до влияния инги-

битора; Ki - константа ингибирования.

При

конкурентном ингибировании

Vmax

не изменяется, К

уве-

личивается; при линеаризации в координатах Лайнуивера-Берка

можно получить серию веерно расположенных прямых (рис.

3.21):

Ki ^-,

(3.34)

А./Ц

125

Наклон графика,

соответствующего

ингибированной

реакции

к,

В отсутствие

ингибитора

Наклон =—-

Отсекаемый

отрезок

= ;

-1

[S]

(1 +

[I]/K,)

Рис.

3.21. Графический анализ конкурентного ингибировання в координатах Лай-

нуивера-Берка

где величина К

' - константа Михаэлиса реакции в присутствии

ингибитора.

Конкурентное ингибирование может быть полным, неполным, а

также кажущимся конкурентным. Рассмотрим полное конкурент-

ное ингибирование. В этом

случае

все группы, связывающие суб-

страт, способны реагировать с ингибитором.

Если ингибитор взят в достаточно высокой концентрации, он мо-

жет полностью блокировать ферментативный процесс. При полном

конкурентном ингибировании наблюдается линеаризация кинети-

ческой кривой в координатах Диксона (рис.

3.22).

Кинетические кривые строят при различных концентрациях суб-

страта (Si и S2) и определяют константу ингибирования (отрезок,

отсекаемый на оси абсцисс от нулевой точки). При обработке экспе-

риментальных данных графически в координатах Диксона отлича-

ют полное конкурентное ингибирование от неполного конкурентно-

го.

При

неполном конкурентном ингибировании ингибитор лишь ча-

стично блокирует субстратсвязывающие группы активного центра,

поэтому он не способен полностью помешать присоединению суб-

страта.

Полное

и неполное конкурентное ингибирование

дают

одни и те

же графики в обратных координатах Лайнуивера-Берка, но эти ти-

126

tga

= K

/ V[S]K,

II]

Рис.

3.22. Графи-

ческий анализ пол-

ного конкурентного

ингибирования в ко-

ординатах

Диксона

K,[(K

+ [S]) / K

]

пы

ингибирования можно различить

помощью графиков

коорди-

натах Диксона. Неполное конкурентное ингибирование

координа-

тах

1/v от [I]

дает

нелинейную зависимость

(в

виде гиперболы).

Могут

быть

другие

варианты нелинейной зависимости

коорди-

натах Диксона. Если зависимость описывается параболой,

то

можно

предположить,

что с

одной субъединицей фермента связываются

две молекулы ингибитора (рис.

3.23).

[S],

Рис.

3.23. Графи-

ческий анализ не-

полного конкурент-

ного ингибирования

в координатах Дик-

сона

[I]

Кажущееся конкурентное ингибирование имеет место

в том слу-

чае, если ингибитор, связываясь

белком, изменяет

его

структуру

(конформацию).

При

этом может наблюдаться ингибирование,

по

кинетике напоминающее конкурентное.

127

Таким образом, в некоторых случаях причиной ингибирующего

эффекта

является изменение нативной конформации белка, а не

изменение модифицированной группы. При кажущемся конкурент-

ном

ингибировании возможно также, что ингибитор,

будучи

свя-

занным

с белком, препятствует активированному действию суб-

страта на каталитически активную конформацию. Ингибитор как

бы возвращает молекулу фермента в неактивное состояние. Эти

представления были подтверждены экспериментальными данными

о том, что мочевина и гуанидинхлорид, которые влияют на конфор-

мацию белков, конкурентно ингибируют некоторые ферменты.

При

неконкурентном ингибировании ингибиторы, как правило,

не имеют

сходства

с субстратом и

могут

обратимо связываться как

со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплек-

сом (рис.

3.24).

Значение К

при добавлении неконкурентного ин-

гибитора в систему не изменяется, a

Vmax

- уменьшается. С теоре-

тической точки зрения механизм неконкурентного ингибирования

может быть интерпретирован различными способами:

Осекаемый

1 I

отрезок

= —

[IJ/K.)

]§]

Рис.

3.24. Графический

анализ неполного некон-

курентного

ингибирова-

ния

координатах

Лайну-

ннсра-Берка

1. Центр связывания субстрата и каталитический центр фермен-

та различны. Ингибитор связывается с каталитическим центром и

затрудняет превращение субстрата.

2. Центр связывания и каталитический центр перекрываются, а

ингибитор связывается с другими группами белка, изменяя конфор-

мацию фермента, чем затрудняется протекание ферментативной

реакции.

3. Ингибитор не связывается ни с каталитическим центром, ни с

центром связывания и не влияет на конформацию фермента, но он

может локально изменять распределение заряда на участке поверх-

ности белка, что затрудняет ионизацию групп,

участвующих

в ка-

128

талитическом акте реакции. Например, одновалентные ионы таким

путем ингибируют фермент фумаразу

v =

(3.35)

или

[Л

I/'

max

(3.36)

-1

где

V'max

- максимальная скорость реакции в присутствии ингиби-

тора.

Неконкурентное ингибирование, как и конкурентное, бывает

трех

видов: полное, неполное и кажущееся. Для полного неконку-

рентного ингибирования можно предположить

следующую

схему

реакции:

E + S -*ES-»E + P;

E + I ^ EI;

ES + I Z

При

неконкурентном ингибировании

субстрат

и ингибитор кон-

курируют не за участок связывания, а за конформацию, необходи-

мую для проявления активности фермента.

При

полном неконкурентном ингибировании.ингибитор и суб-

страт не влияют на связывание

друг

друга

с ферментом, но комп-

лексы фермента, содержащие ингибитор, совершенно не активны.

Полное

неконкурентное ингибирование в координатах Диксона ли-

неаризуется (рис.

3.25):

Рис. 3.25.

Графиче-

ский

анализ

полного

не-

конкурентного

ингибиро-

вамия

координатах

Диксона

(I)

129

ES +

I^TESI;

V'max

J£± (3.37)

При

неполном неконкурентном ингибировании комплексы, со-

держащие ингибитор, частично сохраняют активность и

могут

пре-

вращать

субстрат,

хотя

с меньшей скоростью. В этом

случае

непол-

ное и полное неконкурентное ингибирование ничем не отличаются

в координатах Лайнуивера-Бсрка и отличить эти два вида ингиби-

Рис.

3.26. Графический анализ

неполного неконкурентного ингиби-

рооания в

координатах

Диксона

[I]

рования можно лишь в координатах Диксона (рис.

3.26).

Получа-

ются гиперболы, параболы в отличие от прямых линий, характер-

ных для полного неконкурентного ингибирования.

При

кажущемся неконкурентном ингибировании ингибитор мо-

жет связываться с

субстратом

(конкурирующий компонент) и с

фермент-субстратным комплексом (неконкурирующий компо-

нент).

В некоторых

случаях

может наблюдаться ингибирование,

формально аналогичное неконкурентному. Условием для этого яв-

ляется равенство константы диссоциации комплекса фермент-инги-

битор и константы диссоциации тройного комплекса фермент-инги-

битор-субстрат:

Kie=K

Выделяют

еще один тип ингибирования - бесконкурентное. В ли-

тературе

можно встретить термин антиконкурентное, или сопря-

женное (чаще - бесконкурентное). Ингибитор не способен присое-

диняться к ферменту, но он

образует

комплекс с фермент-субстрат-

ным комплексом. Известны три разновидности бесконкурентного

ингибирования: полное, неполное и кажущееся (схемы одинаковы:

При

полном бесконкурентном ингибировании комплекс, содер-

жащий ингибитор, полностью не активен. График для полного бес-

130