Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

(1/VX1

IQ/K,)

Рис.

3.27. Графический

анализ полного бесконку-

рентного ингибирования в

координатах

Лайнуивера-

Берка

(WM1 +IVIS])

a = 1/VK,

Рис.

3.28. Графический

анализ полного бесконку-

рентного ингибирования в

координатах

Диксона

+Ks/[S])

[I]

конкурентного ингибирования в обратных координатах Лайнуиве-

ра-Берка - серия параллельных прямых (рис.

3.27).

Причем в коор-

динатах Диксона наблюдается полная линеаризация (рис.

3.28).

При

неполном бесконкурентном ингибировании ингибитор также

может связываться с уже образовавшимся комплексом фермент-

субстрат,

а не со свободным ферментом. Но комплекс, содержащий

ингибитор, частично активен. Скорость его разложения меньше,

чем для фермент-субстратного комплекса в отсутствие ингибитора:

E + I + P.

Данный тип ингибирования графически в обратных координатах

Лайнуивера-Берка представлен на рис.

3.29а.

Графически данный

тип ингибирования в координатах Диксона показан на рис.

3.296.

131

"I/Km

VIS]

-К

[I]

Рис.

3.29. Графическое представление неполного бесконкурентного типа ингиби-

рования в координатах Лайнуивера-Берка (а) и в координатах Диксона (б)

Константа ингибирования при этом определяется по уравнению

(3.38):

(3.38)

[ESI] •

Таким образом, неполное бесконкурентное ингибирование ха-

рактеризуется линеаризацией в координатах Диксона, в отличие от

неполного конкурентного и неконкурентного ингибирования.

При

кажущемся бесконкурентном ингибировании

субстрат

не ре-

агирует

со свободным ферментом, осуществляется реакция с уже

образовавшимся комплексом фермент-ингибитор:

EI+S^r[ESI

J -*-Е1 + Р.

Образовавшийся комплекс претерпевает внутримолекулярные

перестройки или конформационныс изменения и получается неак-

тивный комплекс, что схематично описывается следующим обра-

зом:

ESI^TISE;

Ki = [ESI 1/ [ISE ].

(3.39)

Константа равновесия этой реакции является не константой дис-

социации

комплекса фермент-ингибитор, а так называемой "кон-

стантой внутренней конверсии". Графически в координатах Лайну-

ивера-Берка данный тип ингибирования совпадает с полным бес-

конкурентным (см. рис.

3.27).

Отличия касаются точек пересечения

прямых с осями абсцисс и ординат и зависят только от Ki (от [I ] не

зависят, так как свободный ингибитор не

присутствует

в смеси, со-

132

держится

виде комплекса

ферментом).

Для

выявления различий

нужно сравнить экспериментальные данные

полным бесконкурен-

тным ингибированием.

Смешанный

тип

ингибирования характеризуется

тем, что

инги-

битор

действует

ца

участок связывания,

и на

каталитический центр

фермента, независимо

от

того, перекрываются

они или нет. При

смешанном типе ингибирования увеличивается константа диссоци-

ации

уменьшается

Vmax.

Ингибирование смешанного типа можно

представить

себе

как

совокупность конкурентного

неконкурент-

ного ингибирования.

данном

случае

фактически образуется

как

двойной комплекс фермент-ингибитор,

так и

тройной комплекс ин-

гибитор-фермент-субстрат

и оба

комплекса каталитически неак-

тивны.

График

для

ингибирования смешанного типа

координатах

Лай-

нуивера-Берка представлен

на

рис.

3.30.

Пересечение прямых наблюдается

левом квадранте.

коорди-

натах Диксона пересечение

их

наблюдается также

левом квадран-

те. Схематически можно представить

себе

процесс следующим

об-

разом:

E +

S^ES^E

Е +1

^Г EI

S^T EIS

ES +1

^ ESI.

Кроме рассмотренных выше,

существуют

другие

особые

(спе-

цифические) типы ингибирования.

При

графическом представле-

нии

экспериментальных данных специфических типов ингибирова-

ния

координатах Лайнуивера-Берка пересечение прямых может

наблюдаться

правом квадранте.

отсутствие

ингибитора

•*.

Рис.

3.30. Графическое пред-

ставление смешанного типа ин-

гибирования

в координатах Лай-

нуивера-Берка

133

Специфические ингибиторы способны взаимодействовать с той

или иной боковой цепью белков, что приводит к снижению актив-

ности фермента. В принципе это явление позволяет изучать приро-

ду аминокислотных остатков, принимающих участие в катализе.

При

этом после блокирования боковых цепей возможно нарушение

конформации,

которое может усиливаться по мере протекания ре-

акции.

Интерпретация результатов исследования при специфиче-

ских типах ингибирования вызывает затруднение. Так, трудно ре-

шить однозначно, является ли наблюдаемое ингибирование кажу-

щимся

конкурентным или неполным конкурентным, т.е. достаточ-

но

сложно решить, за счет чего уменьшается скорость реакции: это

прямое следствие конформационных изменений или

других

эффек-

тов. Для доказательства необходима постановка дополнительных

экспериментов по влиянию данного ингибитора на конформацию с

привлечением новых физико-химических методов исследования.

Графические представления для описанных типов ингибирова-

ния

справедливы лишь в тех

случаях,

когда механизм реакции со-

ответствует

уравнению Михаэлиса. Особый случай ингибирования

ферментативной реакции - это действие избытка субстрата или

продукта. При ингибировании субстратом добавление его после оп-

тимальной концентрации вызывает снижение каталитической ак-

тивности (рис.

3.31).

При этом может наблюдаться полное и непол-

ное ингибирование. При полном субстратном ингибировании кри-

вая симметрична; при неполном наблюдается несимметричная кри-

вая и повышение вязкости среды, при этом имеет место диффузион-

ное торможение.

График

Лайнуивера-Берка для ингибирования субстратом привс-

Рис.

3.31. Зависимость актив-

ности фермента от концентрации

субстрата

при ингибировании из-

бытком

субстрата

134

Рис. 3.32.

График

Лайнуивера-Бер-

ка для

случая

ингибирования

избытком

субстрата

ден на рис. 3.32. В этом

случае

нет четкой линеаризации и наблю-

дается кривизна, направленная

вверх.

При

ингибировании избытком

субстрата

механизмы этого про-

цесса можно представить следующим образом:

а) при высокой концентрации

субстрата

он может связываться с

другим участком, отличающимся от активного центра и может на-

блюдаться ингибирование;

б) увеличение концентрации

субстрата

выше определенного пре-

дела изменяет ионную силу и ингибирует реакцию. Схематично эти

процессы можно представить следующим образом:

ki ki

S^^ES^r

E + P.

k-i

ft ks

SES

В фармакологии часто используют величину [I ]50- Это концент-

рация

ингибитора, необходимая для ингибирования реакции напо-

ловину (табл. 3.1).

Таблица

3.1

Соотношение

между

[1]50 и Ki для

различных

типов

имибирования

Тип

ингибирования

Конкурентное

Неконкурентное

Бесконкурентное

[1150

(Km+[S])Ki/K

К)

+[S])Ki/[S]

Для случаев неполного ингибирования простые соотношения от-

сутствуют.

Для определения константы ингибирования используют

график

Диксона.

Этот метод

требует

измерения скорости реакции при нескольких

135

заданных постоянных концентрациях

субстрата

при изменении

концентрации

ингибитора; в некоторых

случаях

он оказывается за-

труднительным. Поэтому используют

метод

Лайнуивера-Берка по

координатам точек пересечения графиков с осями и тангенсами уг-

ла наклона. В табл. 3.2 приведены обозначения, которые

будут

ис-

пользованы ниже.

Таблица

3.2

Обозначения

в уравнениях для

расчета

констант ингибирования

Реакция

в отсутствие

ингибитора

Реакция

в присутствии

ингибитора

График

Лайнуивера-Берка

Величина

отрезка,

отсекаемо-

го

на

оси х

на

оси у

Наклон

Полное

неконкурентное ингибирование:

к,- cm

Ж.

- с f -е

Полное

бесконкурентное ингибирование:

b-a

Неполное бесконкурентное ингибирование:

(3.40)

(3.41)

(3.42)

Смешанное ингибирование:

Ki-

cjjj

... (3.43)

помощью приведенных уравнений можно рассчитать констан-

ту ингибирования ферментативных реакций.

& 7. Влияние активаторов и других факторов микроокружения

на

скорость ферментативной

реакции

Вещества, которые способны увеличивать скорость ферментатив-

ной

реакции, называются активаторами. Если активатор обратимо

связывается с ферментом, т.е. может диссоциировать, и фермент

подчиняется кинетике Михаэлиса, то для исследования этого про-

цесса можно прменить те же принципы, что и для определения ти-

пов ингибирования. Активаторы

делят

на конкурентные, неконку-

рентные, бесконкурентные, смешанные. Под воздействием актива-

торов может увеличиваться прочность связи фермент-субстрат (в

противоположность влиянию ингибитора, который вызывает

деста-

билизацию связи). Активаторы ускоряют стадию распада фермент-

субстратного комплекса, а также

могут

изменять его конформацию,

136

переводя ее в наиболее выгодную с энергетической точки зрения.

Если

активатор связывается со свободным ферментом, то реакция

может быть представлена следующей схемой:

I^TEA^TEAS

I^IEAP,

P 1

где А - активатор, S и Р -

субстрат

и продукт реакции соответствен-

но.

Уравнение скорости реакции

будет

иметь вид:

v-Vmax/l+K

/S(l+K

/[A]),

(3.44)

где К« - константа диссоциации комплекса ЕА (константа актива-

ции).

Этот тип активации относят к конкурентному типу и при обра-

ботке экспериментальных данных в обратных координатах Лайнуи-

вера-Берка можно получить семейство прямых, которые пересека-

ются в точке, лежащей на оси ординат (как при конкурентном ин-

гибировании).

Если

активатор связывается не со свободным ферментом, а с фер-

мент-субстратным комплексом и активатор покидает фермент

прежде, чем образуется продукт, то процесс можно представить

следующей схемой:

S А

Е ^TESrTESA 1П ЕРА^Г ЕР1ГЕ.

А Р

Иногда

активатор проявляет свое действие в

результате

связыва-

ния

не с ферментом, а с субстратом:

Sz^AS;

ASZTEAS

1ГГЕ

АР.

Причем

молекулы свободного субстрата

могут

образовывать с

ферментом тупиковый комплекс.

Иногда

активаторы выполняют двойную функцию, они связыва-

ются как с ферментом, так и с субстратом. Поэтому истинным суб-

стратом является активатор -

субстрат,

который может образовы-

вать активный комплекс с ферментом-активатором.

A AS

Е^Г

EA^TEAAS

А + Р

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации

свободного активатора не является гиперболической, поскольку ак-

тиватор взаимодействует с ферментом дважды.

Несущественные активаторы проявляют свое действие за счет

137

связи

либо с ферментом, либо с субстратом (или с обоими) и отли-

чаются от необходимых активаторов тем, что фермент обладает не-

которой

активностью и в их отсутствии.

Существуют и такие активаторы, без которых ферментативная

реакция

не может протекать:

А:= ЕА;КА-[Е][А]/[ЕА];

(3.45)

S^EAS—»ЕА

+ Р; K

- [EA][S]/[EAS].

(3.46)

Ионы

металлов (Mn

, Co

, Mg

) выполняют роль активаторов

многих ферментов. Так, Mg

является активатором креатинкина-

зы.

Нередко активация ионами металлов достигает максимума

только через несколько часов инкубации с ферментом. Некоторые

ферменты,

действующие на водонерастворимые нейтральные веще-

ства,активируются отрицательно заряженными липофильными мо-

лекулами, например, лизофосфолипаза из Penicillum. Она

эффек-

тивно

действует

на фосфоглицериды, но не

действует

на лецитин,

если не добавлен фосфотидилинозит.

Известен

еще один тип веществ, взаимодействующих с фермен-

том. Это "либераторы". Их нельзя отнести ни к ингибиторам, ни к

активаторам. Но они

могут

подавлять действие ингибиторов или ак-

тиваторов путем освобождения фермента от ингибитора и активато-

ра. Выявлены либераторы для изоцитратдегидрогеназы,

глутамат-

дегидрогеназы, ацетилглутаматкиназы. Эти вещества

действуют

так

же, как ингибиторы, по конкурентному, неконкурентному и

бесконкурентному механизмам. В двойных обратных координатах

получают картину, соответствующую типу ингйбирования.

При

увеличении концентрации либератора ингибирующий эф-

фект

ингибитора уменьшается до полного снятия и фермент акти-

вируется.

Можно

рассматривать влияние рН на скорость ферментативной

реакции

в качестве либератора. Так, ионы Н

или ОН"

могут

и ин-

гибировать, и активировать ферментативную реакцию.

8. Влияние рН субстрата на скорость ферментативной реакции

Большинство

ферментов характеризуется определенным значе-

нием

рН субстрата, при котором проявляется оптимальная актив-

ность.

При

других

значениях рН (выше и ниже этого) способность к

осуществлению реакции уменьшается (рис.

3.33).

При

изучении зависимости активности фермента от рН субстрата

измерение скорости реакции проводят в условиях насыщения фер-

138

а ю

РН

8 10

РН

рн

Рис.

3.33. Зависимость активности фермента от рН субстрата: а - трипсин; б - хо-

линэстераза;

в - пепсин; г - папаин

мента субстратом и при оптимальной температуре каталитической

реакции.

Кривая, характеризующая зависимость активности фер-

мента от рН, может иметь колоколообразную форму (трипсин);

иногда оптимальная активность фермента проявляется в диапазоне

значений

рН (холинютсраза). Кривая, характеризующая зависи-

мость активности от рН, может быть представлена прямой линией,

139

если заряженные группы не играют существенной роли в катализе

(папаин).

Влияние рН на активность ферментов осуществляется за счет из-

менения

в состоянии ионизации отдельных компонентов фермента-

тивной

реакции. Такие изменения

могут

происходить в нативном

ферменте, фермент-субстратном комплексе или субстрате. Показа-

но,

что рН субстрата влияет на скорость ферментативной реакции

тремя способами: воздействием на величину максимальной скоро-

сти ферментативной реакции,

(Vmax),

на образование фермент-суб-

стратного комплекса и на устойчивость молекулы фермента.

Значение

рН, соответствующее максимальной активности, не

обязательно совпадает с величинами рН, характерными для нор-

мального внутриклеточного окружения этого фермента. В клетке

оно

может быть выше или ниже оптимума in vitro. Это позволяет

предположить, что влияние рН на активность является одним из

факторов

регуляции обмена веществ в клетке.

Оптимальные значения

Vmax

наблюдаются при величинах рН от

6 до 9. Молекулы ферментов содержат большое количество ионизи-

рующихся групп, и поэтому они

могут

находиться в виде целого ря-

да различных ионных форм. Но каталитическая активность прояв-

ляется,

как правило, в узком интервале рН, в связи с чем можно

предполагать, что только одна из ионных форм фермента (точнее

его активного центра) каталитически активна. Причем распределе-

ние

всего количества фермента

между

этими ионными формами за-

висит от рН и констант ионизации (рК) отдельных групп фермент-

субстратного комплекса, активного центра и субстрата.

Таким

образом, зависимость активности фермента от рН опреде-

ляется:

1) величинами рК ионизируемых групп активного центра

фермента,

участвующих

в связывании субстрата; 2)величинами рК

функциональных групп молекулы субстрата,

участвующих

в свя-

зывании

субстрата с ферментом; 3)величинами рК функциональ-

ных групп молекулы фермента, ответственных за каталитический

акт; 4)величинами рК

других

групп фермента, состояние иониза-

ции

которых может определять специфически активную конформа-

цию

молекул фермента.

Из

этих рассуждений

следует,

что активность фермента в значи-

тельной мере определяется ионизацией

двух

особых групп в актив-

ном

центре (кислой и основной). Надо сказать, что в молекуле фер-

мента много одинаковых групп, способных к ионизации, но присут-

ствие в активном центре более одной такой группы маловероятно.

Характер рН-зависимости ферментативной реакции был деталь-

140