Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

вносят значительные артефакты, которые необходимо учитывать

при

анализе электронно-микроскопической картины.

Однако

одной клетке одномоментно

могут

протекать

до 1000

разнообразных ферментативных реакций, различных внутримоле-

кулярных переходов (спираль-клубок), межмолекулярных (ассоци-

ация-диссоциация)

взаимодействий.

временных характеристиках

ряда физических

химических реакций

методов

их

исследования

дает

представление рис.

4.3.

Переходы типа "спираль-клубок"

Перераспределение

электронов

молекулах

Фермент-субстратный комплекс

Образование

Кислотно-основной Ассоциация

катализ

| 1

г-

Распад

Диссоциация

Гидратация

гидролиз

Поверхностная

диффузия

Перенос протонов, диссоциация

Вращательная

растворе

мембране

Перенос электронов

диффузия

1 h

-с

10"

КГ"

10"

Спектроскопические

методы

Температурный

•

скачок

Рассеяние

лазерного света

Ядерный магнитный резонанс

Деполяризация

флуоресценции

Ручн

10*

|ые методы

ЭПР-слектроскопия

Ультразвуковое поглощение

Концентрационный скачок

•

(метод

остановленного потока)

Рис.

4.3. Временные характеристики некоторых физических и химических реак-

ций (А) и методов их исследования (Б)

Не

существует

универсального метода

биофизике,

как и в

био-

логии.

Каждый метод имеет свои достоинства, ограничения

недо-

161

статки. Поэтому, как правило, для решения поставленной задачи

применяют несколько методов, дополняющих

друг

друга.

Для исс-

ледования ряда характеристик и состояния биомембран широко ис-

пользуют

метод

электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и

метод

ядерного магнитного резонанса

(ЯМР).

5б. Метод электронного парамагнитного резонанса

Интерес в мембранологии к

методу

ЭПР значительно возрос по-

сле разработки

метода

спиновых меток, когда стабильный малоре-

акционный

свободный радикал присоединяют к молекуле биополи-

мера известной

структуры

и функции. Синтез стабильных нитро-

ксильных радикалов в нашей стране был осуществлен Э.Г.Розанце-

вым: на их основе были созданы ЭПР-зонды (спиновые зонды), ко-

торые были использованы для характеристики микровязкости мем-

бран, для определения степени упорядоченности микроокружения

зонда, его поступательной и вращательной подвижности, степени

диффузии меченых молекул при изменении температуры, концент-

рации

липидов, воздействии различными ионами металлов. Моле-

кулярная подвижность зондов находилась в

пределах

10" - 10" с.

Спин-метку можно вводить в разнообразные соединения с опре-

деленной предсказуемой локализацией в биомембране, что разре-

шает количественно оценить подвижность и взаимодействие

между

собой различных компонентов мембраны. В жирных кислотах нит-

роксильную группировку можно вводить на разном расстоянии от

полярной

карбоксильной СООН-группы, что позволяет тестировать

биомембраны на разной глубине в поперечном направлении.

Метод ЭПР с применением спиновых зондов позволил измерить

плотность упаковки молекул в липидном бислое, подвижность жир-

нокислотных цепей на разной глубине мембраны. Однако этот ме-

тод оказался малоинформативным при изучении функционирова-

ния

мембранных ферментов из-за различия в скоростях

между

фер-

ментативными реакциями и скоростями молекулярной подвижно-

сти. Кроме того, ряд экспериментальных

результатов

можно объяс-

нить,

исходя из разных точек зрения. Вот почему данные, получен-

ные при помощи

метода

ЭПР, для однозначной трактовки

нужда-

ются в дополнительной проверке другими методами.

Принципы

методов ЭПР, ЯМР и ряда

других

и области их приме-

нения

в биофизике изложены в

главе

5в. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

В мембранологии

метод

ЯМР позволил сопоставить подвижность

162

различных жирнокислотных цепей в липидном бислое. Увеличение

подвижности звеньев в цепи

растет

по направлению от эфирной

связи к метальному концу.

При

исследовании белков в мембране

метод

ЯМР рассматривают

как

не модифицирующий ее, позволяющий получать сведения об

интактной мембране наряду с другими немодифицирующими мето-

дами, к которым относят

метод

сканирующей микрокалориметрии

метод

кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения.

5г. Метод флуоресцентной спектроскопии

Методы флуоресцентной спектроскопии в мембранологии ис-

пользуют

для получения информации о подвижности молекул, вхо-

дящих в состав мембран (латеральной диффузии в

пределах

одного

слоя; флип-флоп переходов - перемещения молекул из одного слоя

другой;

для определения локализации молекулы в мембране от

поверхности мембраны; для характеристики измерения микровяз-

кости; для определения скорости проникновения ряда веществ че-

рез мембрану; для исследования трансформации энергии в энерго-

сопрягающих мембранах; для исследования влияния ряда блокато-

ров электронно-транспортной цепи; для изучения ряда фермента-

тивных реакций, в осуществлении которых принимает

участие

фер-

мент-мембраносвязанный комплекс.

Изучение интенсивности флуоресценции при введении флуорес-

центных зондов в биомембраны и клетки позволяет выяснить изме-

нение

относительной микровязкости мембран в зависимости от тем-

пературы, действия многовалентных катионов, неполярных раство-

рителей, концентрации ионов водорода и

других

факторов.

Флуоресцентные зонды применяют для определения степени свя-

зывания

хромофора с мембранными компонентами. Перемещение

зонда из неполярной области мембраны в полярную

будет

сопро-

вождаться снижением интенсивности флуоресценции со сдвигом

максимума в более длинноволновую область.

В последнее десятилетие стали применять флуоресцентные зон-

ды, чувствительные к изменению рН-среды (производные акриди-

на) , что позволило изучать изменение концентрации ионов водоро-

да на разных

участках

клетки при протекании ряда физиологиче-

ских процессов (дыхания, фотосинтеза и др.) и анализировать про-

никновение

веществ через мембрану, метаболизм ряда веществ.

ДЛоуренс в 1952 г. впервые применил флуоресцентный зонд

1-анилин-8-нафталин-сульфонат (АНС) для исследования связыва-

ния

зонда с компонентами мембраны. Связывание заряженных мо-

163

лекул зонда с мембраной зависит от плотности электрических заря-

дов в ней и при правильно подобранной концентрации интенсив-

ность флуоресценции

будет

целиком зависеть от флуоресценции

связанного с мембраной зонда. Это позволяет определять количест-

во заряженных групп в мембране и величину трансмембранного по-

тенциала.

Определяя степень поляризации флуоресценции и используя

флуорофоры с высоким квантовым выходом, можно изучать харак-

теристики белок-липидных взаимодействий. Для этих целей при-

меняют дансилхлорид, взаимодействующий с ЫНг-группами ве-

ществ. В последнее время стали использовать метод флеш-фотолиза

(см.

главу

6), дающий возможность измерять при помощи лазерно-

го излучения высокой интенсивности поляризацию флуоресценции.

Это позволило рассчитать время вращательной корреляции белко-

вых молекул (табл. 4.2).

Таблица

4.2

Время

вращательной

корреляции

некоторых

белков

(при

температуре

2УС).

Белок

Апомиоглобин

Лактоглобулин

(мономер)

Трипсин

а-Лактоглобулин

(димер)

Сывороточный

глобулин

Макроглобулин

Са-АТФаза

(мембраносвязанная)

То же в

присутствии

АТФ

То же при

повышении

температуры

до

Молекулярная

мас-

са,

к Да

900

100

тер

8,3

нс

8,5 нс

12,9

нс

20,3

не

41,7

нс

5д. Метод определения дисперсии оптического вращения

кругового дихроизма

Изучение спектров кругового дихроизма позволяет судить о ха-

рактере вторичной структуры мембранных белков. Однако при объ-

яснении

порученных данных возникают осложнения, которые зави-

сят от негомогенности мембранных суспензий, трудности выделе-

ния

и очистки мембранных фракций белков.

Определение дисперсии оптического вращения и кругового дих-

роизма позволяет решить вопрос о действии ряда внешних факто-

ров на степень спирализации участков белковх молекул и оценить

164

состояния

конформации белковых молекул как

результат

взаимо-

действия молекул мембранных белков

друг

с другом.

5е. Метод дифференциальной

сканирующей микрокалориметрии

Изменение

фазового состояния системы, в частности биомембра-

ны,

при постоянном давлении обычно сопровождается поглощением

или

выделением тепла, что рассматривают как молекулярную реор-

ганизацию анализируемой системы. В биомембранах можно выяв-

лять переход от жидкокристаллического состояния в твердокри-

сталлическое и обратно, например, при понижении или повышении

температуры образца.

Современные микрокалориметры позволяют в образцах массой в

несколько

миллиграммов измерять энергетическую ценность фазо-

вых переходов в водно-липидных дисперсиях, искусственных бис-

лойных мембранах, мицеллах, везикулах из известных фосфолипи-

дов. Это дало возможность колилественно характеризовать органи-

зацию бислоев липидов, искусственных мембран.

Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии

было установлено, что фазовые переходы в бислоях индивидуаль-

ных фосфолипидов происходят в интервале долей

градуса.

В то же

время для смеси фосфолипидов критическая температура (Т

р) фа-

зового перехода расширяется до 1-2 °С.

Ряд

фосфолипидов слабо взаимодействует и не смешивается

друг

с другом. Обнаружено это у фосфолипидов, у которых углеродные

цепи

по длине не совпадают на четыре и более атомов

углерода.

Не

смешиваются глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды: на тер-

мограммах отмечают два раздельных пика, свидетельствующих о

наличии

двух

фазовых переходов. Но если к такой пробе добавить

холестерин, то образуется одна фаза со смешанными свойствами.

Если

фосфолипиды хорошо смешиваются, то температура фазо-

вого перехода служит характеристикой такой системы. Чем длин-

нее жирнокислотная цепь фосфолипида, чем меньше содержится в

ней

непредельных жирнокислотных остатков, тем выше температу-

ра фазового перехода.

Липидные системы

дают

петлю гистерезиса при определении Ткр

фазового перехода при их нагревании и охлаждении. При нагрева-

нии

р сдвигается в сторону более высокой температуры, что объ-

ясняется

образованием ряда слабых связей, приводящих к коопера-

тивности и возникновению "памяти липидов", причиной которых

может быть и разная энергия гидратации и дегидратации линидного

бислоя при нагревании и охлаждении.

165

Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии

оказался

наиболее информативным и ценным для искусственных

мембран определенного липидного состава. Наличие холестерина в

естественных мамбранах затрудняет обнаружение четких измене-

ний

теплопродукции, характерных для фазовых переходов.

Внутриклеточные мембраны

содержат

значительное количество

непредельных жирнокислотных радикалов. Они остаются "жидки-

ми"

в широком диапазоне

температур

(5 - 60 °С), что значительно

снижает область применения этого

метода

для изучения нативных

мембран клетки.

5ж. Метод радиоактивных меток

Применение

метода

радиоактивных меток в мембранологии дик-

туется

рядом преимуществ перед известными другими. Это прежде

всего:

- высокая чувствительность

метода,

позволяющая определять ни-

чтожно малые концентрации веществ (10~

- 10" моль/л),

хотя

диапазон измерения довольно широк - от 10 "

до 10 "

моль/л, тог-

да как химические методы имеют предел 10 "

моль/л;

- возможность работать с малыми количествами вещества, изме-

ряемыми

микрограммами;

- возможность исследования динамики ряда процессов (проник-

новение

молекул вещества, ионов, атомов) через мембрану,

выход

ионов

через каналы мембраны и др.;

- возможность следить за превращением меченных двойной мет-

кой

молекул в процессе метаболизма;

- возможность количественных измерений процессов и реакций,

протекающих в ограниченном числе клеток.

Радиоактивный

распад атомных ядер является самопроизволь-

ным

процессом, зависящим от нескомпенсиронности ядерных сил,

протекает в естественных условиях с постоянной скоростью для

данного вида изотопа.

Из

нескольких типов ядерных реакций наибольшее значение для

биологических исследований имеют радиоизотопы, испускающие

/?-частицы (электроны) и

у-лучи

(фотоны).

В любой момент времени число атомов радиоактивного вещества,

распадающихся за единицу времени, пропорционально общему

числу имеющихся радиоактивных атомов:

dN/df^No,

где-dN - число атомов, распадающихся за отрезок времени dt;

-по-

стоянная

радиоактивного распада; No - число радиоактивных ато-

мов при t - 0.

166

Легко определить число оставшихся радиоактивных атомов

через время

Обычно постоянную распада

выражают через период полурас-

пада *1/г

время,

течение которого скорость распада (радиоактив-

ность) самопроизвольно уменьшится

два раза

составит половину

от исходной:

г-1п2/А=0,693Д.

Через время, равное

двум

периодам полураспада, остается одна

четверть исходной радиоактивности, трем периодам полураспада

одна восьмая,

т.д.

Если

учесть,

что биологические объекты,

будучи

предметами

хи-

мической

эволюции, построены

основном из легких элементов,

то

набор радиоактивных изотопов, применяемых

биологических исс-

ледованиях, весьма ограничен,

чем

дает

представление табл. 4.3.

Таблица

4.3

Характеристика

используемых

биологии

радиоактивных

изотопов

Изотоп

131j

131

Испускаемая

Емакс.

МэВ

0.018

0,155

1,39

1.7; 2.75

1,7

0,167

1,33;

1,46

0,254

0,335;

0,608

0,284;

0,364;

0.637

Период

полураспа-

да

12,3

года

5568

лет

14.974

14,974

14,2

дня

дней

1,25-

лет

164

дня

8,1

дня

Принцип

метода радиоактивных меток состоит

подборе соот-

ветствующего иона, молекулы вещества, введении препарата

сре-

ду, клетку, организм

регистрации скорости его поступления, рас-

пределения

объеме, выведении радиоактивной метки. Трактовка

полученных результатов базируется

на

положении,

что

радиоак-

тивный

ион, меченая молекула

ведут

себя идентично стабильному

изотопу, входящему

природное соединение или органическое

ве-

щество, ион. Изотопные эффекты, связанные

наличием радиоак-

тивности,

отсутствуют

или существенно

не

влияют

на

протекание

биохимических реакций, биологических процессов.

167

Для количественной регистрации радиоактивного распада ис-

пользуют

ряд методик:

- методики, основанные на ионизации газов в

детекторах

(счет-

чики

Гейгера-Мюллера), в том числе и торцевого счетчика для под-

счета

а-распадов;

- методики, основанные на измерении радиоактивности жидкими

сцинтилляционными

счетчиками. Энергия ионизирующих частиц

или

гамма-квантов поглощается растворителем, с добавлением

флуоресцирующего вещества (флуоресцента), которое высвечивает

фотоны

от возбужденных молекул. Фотоны, испускаемые флуорес-

центом,

регистрируются фотоумножителем. Иногда комбинируют

два флуоресцента, второй флуоресцент

улавливает

фотоны от пер-

вого, испускает более длинноволновые фотоны, к которым чувстви-

телен данный фотоумножитель. Основная часть энергии ионизиру-

ющего излучения поглощается молекулами растворителя, мигриру-

ет на флуоресцент, который работает как преобразователь энергии.

Энергия

излучаемой частицы превращается в пучок фотонов за ин-

тервал времени 10~

с.

Эффективность

регистрации радиоактивного распада атомного

ядра сцинтилляционными счетчиками

будеть

зависеть от способно-

сти молекулы растворителя поглощать энергию и переходить в воз-

бужденное состояние и передавать энергию на первичный флуорес-

цент;

от числа фотонов, испускаемых первичным и вторичным

флуоресцентами; от геометрии трубки умножителя; от цикла пре-

образования

заряда на фотоумножителе в напряжение; от соотно-

шения

сигнал/шум фотоумножителя.

В мембранологии

метод

радиоактивных меток в основном ис-

пользуют

для решения проблем мембранной проницаемости для

ионов,

молекул, изучения кинетики проницаемости мембран в за-

висимости от меняющихся условий и действия ряда факторов (из-

менения

концентрации ионов и веществ, разные значения рН сре-

ды, изменения степени диссоциации молекул и др.).

При

помощи

метода

радиоактивных изотопов было определено

количество ионов и величины ионных потоков через мембрану при

развитии потенциала возбуждения и в состоянии покоя нервного

волокна.

Исследована кинетика превращений, протекающих при

участии мембранзависимых ферментов. Изучены локальные фер-

ментативные реакции, протекающие в различных компартментах

клеток, скорости распределения ряда веществ в компартментах и

вовлечение их в процесс метаболизма, выведение продуктов распа-

да из клеток.

168

5з. Метод моделирования мембран

Моделирование - это исследование каких-либо явлений, процес-

сов,

систем

путем

построения и изучения их моделей, это одна из

категорий научного познания. На моделировании базируется любой

научный метод, который можно разделить на построение теорети-

ческих (идеальных) моделей и вещественных предметных (экспе-

риментальных). Модель в широком смысле понимания - любой ана-

лог мысленный (идеальный) или предметный, вещественный (ре-

альный) какого-либо объекта, процесса, явления, максимально уп-

рощенный,

с сохранением основных параметров, свойств, использу-

емый в качестве заместителя оригинала.

В мембранологии

метод

моделирования использовали еще на

ранних

этапах изучения, когда только постулировали наличие мем-

браны на поверхности клеток (наружная мембрана). Представле-

ние

о клетках как осмометрах, использование кожи лягушки, стен-

ки

мочевого пузыря как полупроницаемой мембраны - это примеры

моделирования в мембранологии.

Мембрану рассматривали как монослой липидов на водной по-

верхности. В 1962 г. П.Мюллер и Д.Рудин разработали способ пол-

учения больших двуслойных мембран (диаметром до 1 мм), исполь-

зуя тефлоновую пластинку, разделяющую две водные фазы. На от-

верстие кисточкой или петлей наносили смесь фосфолипидов. Про-

исходило самопроизвольное формирование бислойной мембраны,

на

которой можно было изучать ряд свойств и параметров (электри-

ческий

пробой, модификацию мембраны белками, ионную прони-

цаемость и др.).

Примером

моделирования биомембраны являются липосомы -

замкнутые мембранные пузырьки, содержащие

водную

фазу

внут-

ри

и находящиеся в водной среде. Липосомы формируют из липида

(например,

фосфатидилхолина, фосфатидилсерина) в водной

среде

путем

обработки ультразвуком, быстрого смешения раствора липи-

да в этаноле с водой или пропуская через тонкую

иглу

раствор ли-

пида. Липосомы имеют почти правильную сферическую форму диа-

метром около 50 нм.

Метод моделирования, получения искусственных мембран много

дал для количественных измерений, изучения электрических пара-

метров и свойств, исследования мембранной проницаемости для

ионов,

атомов, молекул, изучения биоэлектрогенеза

возбудимых

мембран, исследования воздействия факторов внешней среды (тем-

пературы, ионной силы, концентрации различных катионов, в том

числе иона водорода, и

других

факторов).

169

$ 5и. Метод рентгеновского рассеяния нейтронов

В мембранологии метод рассеяния нейтронов под малыми углами

позволяет определить толщину бислоя и расстояние

между

слоями.

Изменение

рассеивания нейтронов под большими углами характе-

ризует упаковку молекул в кристаллографической ячейке. Этим

методом можно определить переходы

между

гексагональной, куби-

ческой,

ламеллярной, аморфной и т.д. структурами, фазовые пере-

ходы

от жидкокристаллического к твердокристаллическому состоя-

нию.

Метод сложен, применяется для анализа относительно про-

стых систем, имеющих кристаллографическую

структуру.

Этот ме-

тод имеет преимущество перед методом сканирующей микрокало-

риметрии,

так как он не только характеризует фазовые переходы,

но

и позволяет определить упаковку бислоя до и после температур-

ных переходов.

5к. Методы обнаружения фазовых переходов в мембранах

Липиды в экспериментальных условиях

могут

находиться в жид-

ком,

жидкокристаллическом и твердокристаллическом состояниях.

Фазовое состояние липидов

будеть

зависеть от концентрации веще-

ства, температуры системы и природы липида (наличия ненасы-

щенных связей, длины углеводородной цепи и др.).

Фазовые диаграммы отражают различные фазовые состояния си-

стемы в зависимости от концентрации компонентов при изменении

температуры. Для обнаружения и регистрации фазовых переходов

липидных систем используют методы:

- дифференциального термического анализа (ДТА);

- дифференциальной сканирующей микрокалориметрии

(ДСК);

- рентгеновского и нейтронного рассеяния;

- ЯМР-спектроскопии;

- ЭПР-спектроскопии;

- флуоресцентной спектроскопии.

Поясним

области применения каждого метода. С помощью ДТА

ДСК регистрируют изменения скорости теплового потока при по-

степенном повышении или понижении температуры. В точках фа-

зового перехода происходит резкое пикообразное увеличение по-

глощения

или выделения потока тепла, что и регистрируется.

Подобную информацию получают с помощью ЭПР, ЯМР или

спектрофлуориметрии при условии введения в эти системы спино-

вых или флуоресцентных зондов.

Метод дифракции рентгеновских лучей или нейтронов наряду с

определением фазовых переходов в липидных системах позволяет

170