Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

ные")

воспроизводимые

экспериментальных условиях искусст-

венные

мембраны, создаваемые

водной среде.

Метод получения

БЛМ был

предложен американским ученым

П.Мюллером

в 1962 г. Он

состоял

нанесении

при

помощи кисточ-

ки

капли раствора липида

на

отверстие диаметром

1-2 мм в

гидро-

фобном

материале

тефлоне, полиэтилене (рис.

4.13).

Самопроиз-

вольно идет формирование мембраны толщиной

от

100-600

нм до

4-9 нм

за

счет сил поверхностного натяжения

течение нескольких

минут. Вследствие малой толщины мембрана

не

отражает падаю-

щий

свет

кажется черной. Органический растворитель выдавлива-

ется

краям отверстия

может содержаться

средней области бис-

лоя

виде микролинз (рис.

4.14).

Время жизни таких мембран колеблется

пределах

от

несколь-

ких минут

до 1-3

часов. Липидный бислой обладает высокой проч-

ностью. Под действием механического

или

осмотического давления

Раствор

липида^

Водная

фаза

Водная

фаза

Отраженный

сеет

Бимолекулярная

(черная)

липидная

мембрана

Рис.

4.13. Схема

эксперименталь-

ной

установки для

получения бислой-

ной

липидной мем-

браны

Перегородка

Толстая

пленка

Тонкая

пленка

Бимолекулярная

мембрана

Рис.

4.14. Про-

цесс

формирования

бислойной

липид-

ной

мембраны

191

можно получить полусферу. Липидный бислой можно проткнуть

волосом, стеклянным микроэлектродом

извлечь

их без

наруше-

ния

мембраны,

что

свидетельствует

об

их

способности

самовосста-

новлению, самосборке.Однако

БЛМ

легко разрушают

следующие

факторы: примеси

липидах,

их

окисление, колебания

температу-

ры,

вибрация, загрязнение посуды

и т.д.

Для получения

БЛМ

используют широкий набор природных

синтетических липидов

различные органические растворители,

но

наиболее стабильные мембраны

получают

при применении н-де-

кана

н-тетрадекана.

Метод

"сухих"

бислойных липидных мембран

был

впервые пред-

ложен японским ученым М.Такаги

сотрудниками

1965

г. и

позд-

нее

1972-1974

гг. был

усовершенствован М.Монталом. Сущность

данного

метода

состоит

механическом соединении (соприкоснове-

нии)

двух

мономолекулярных слоев

на

границе раздела вода-воз-

дух. Таким способом

получают

асимметричные мембраны

из ли-

пидных слоев разного липидного состава.

БЛМ оказалась удобной моделью,

при

помощи которой

был ис-

следован

ряд

электрических характеристик липидного бислоя:

мем-

бранный потенциал, потенциал пробоя, электрическая емкость,

проводимость.

Эта

модель оказалась полезной

и для

изучения

про-

ницаемости различных веществ

при

различных модификациях

пу-

тем включения белков (переносчиков, каналообразователей, анти-

биотиков)

В табл.

4.8

приводятся данные

ряде свойств БЛМ

биомембран.

Таблица

4.8

Сравнение некоторых свойств искусственных бислойных

и биологических

мембран

Свойства

Толщина,

нм

Электрическое сопротивление,

Ом-

см

Электрическая емкость, мкФ

•

см

Потенциал пробоя, В /см

Поверхностное натяжение,

мН

Проницаемость,

мкм

с -10

вода

мочевина

глицерин

эритрит

Мембраны

бислойные

0,33-1

-10

0,5-2

31,7

4,2

4,6

0,75

биологические

10*-10

0,5-1,3

-10

0,03-1

0,37-400

0,015-280

0,003-27

0,007-5

192

На

базе БЛМ созданы первые биосенсорные устройства, что от-

крывает новые перспективы их практического применения.

Липосомы

В 1965 г. А.Бэнгхем описал процесс самопроизвольного образова-

ния

сферических частиц при набухании фосфолипидов в воде. Они

представляли собой множество замкнутых бислоев фосфолипида,

разделенных слоями воды.

По

числу липидных бислоев и размера частиц липосомы делятся

на:

- многослойные (мультиламеллярные диаметром 5-10 мкм) - от

десятков до сотен слоев;

- крупные монослойные (моноламеллярные) с диаметром от 50 до

200 нм;

- малые монослойные с диаметром от 20 до 50 нм.

Существует

несколько способов получения липосом:

- продавливание липидов через стальные фильтры с определен-

ным

размером пор;

- обработка фосфолипида в

воде

ультразвуком;

- механическое встряхивание смеси фосфолипидов в воде.

Липосомы образуются при

температурах

выше фазового перехо-

да для данного липида, при низкой ионной силе раствора. На при-

мере многослойных липосом, полученных из яичного фосфатидил-

холина, можно составить представление о

структуре

и количествен-

ных характеристиках многослойных липосом. Толщина липидного

бислоя,

по данным рентгеноструктурного анализа, составляет 4 нм;

площадь, занимаемая одной липидной молекулой, около 0,72 нм ,

что

соответствует

давлению сжатия

(2,0-2,5)

10 Н/см. Толщина

водного промежутка колеблется от 2-3 нм в

случае

отсутствия заря-

да бислоев и до 20 нм при наличии его. Объем водной фазы состав-

ляет от 20 до 40% общего объема. Бислои липосом функционируют

как

осмометры, поэтому липосомы

набухают

в гипотонических и

"сморщиваются" в гипертонических растворах.

Малые липосомы осмотически неактивны. Удельный водный объ-

ем у них невелик -

(0,2-1,5)

л/моль, в то время как у многослойных

липосом он составляет от 1 до 4 л/моль воды.

В стенку липосомы легко включаются мембранные белки, обра-

зуя протеолипосомы, которые

могут

моделировать транспортные,

ферментативные и структурные свойства и функции биологических

мембран.

При

образовании липосом вещества, содержащиеся в воде, вклю-

193

чаются во внутреннее пространство липосом. Таким путем включа-

ют в липосомы пептиды, лекарственные вещества, витамины, гор-

моны,

антибиотики, различные белки и т.д.

& 6г. Модели биологических мембран

Притягательная идея о сведении мембран различных клеток жи-

вотных и растений к одной универсальной

структуре

(модели), спо-

собной

объяснить и объединить многочисленные наблюдения, фак-

ты, экспериментальные данные, владела умами многих исследова-

телей в течение столетия. Но сначала надо было доказать, что био-

логические мембраны

существуют,

а затем предлагать и обосновы-

вать их

структуру

и механизмы выполнения ими функций. В мемб-

ранологии смелые гипотезы часто опережали экспериментальные

результаты.

Изучив проницаемость клеточной мембраны для более чем 500

веществ, Э.Овертон в 1899 г. высказал мысль о существовании по-

верхностного липидного слоя клеток, который определяет их про-

ницаемость.

Измерения, проведенные в 1925 г. голландскими ис-

следователями Э.Гортером и Ф.Гренделем на мембранах эритроци-

тов, показали, что площадь липидов в два раза превосходит пло-

щадь эритроцитов. Они сделали вывод о том, что мембрана имеет

двойной

слой липидов. В пользу этого свидетельствовали результа-

ты измерения электрической емкости клеток, проведенные в 1927 г.

Фрике.

Найденную величину 0,81 мкФ/м мог иметь бимолекуляр-

ный

слой липида с углеводородными хвостами, имеющими 16-18

углеродных атомов. Однако измерения поверхностного натяжения

клеток

привели к явно заниженным величинам - около 0,1 дин/см,

тогда

как для поверхности раздела липид/вода должно быть около

10 дин/см, что позволило предположить нахождение белков на по-

верхности клеток.

В 1935 г. Дж.Даниелли и Х.Давсон предложили первую модель

мембраны (принципиально общую для

всех

клеток) как трехслой-

ной

структуры. Между двумя слоями белка лежит двухрядный слой

липидов.

Липидные ряды разделены жироподобным веществом -

липоидом (рис.

4.15).

Эта модель строения мембраны вошла в биологию как бутерброд-

ная

модель или модель сандвича. Связывание белков с липидами

согласно модели происходит за счет полярных взаимодействий.

В 1956 г. Дж.Даниелли и В.Стейн дополнили эту модель допуще-

нием

возможности проникновения гидрофобной части белковой мо-

лекулы в липидный бислой или полным проникновением через тол-

194

оооооо

щу мембраны

образовани-

ем поры, заполненной

во-

дой

способной пропускать

водорастворимые незаря-

женные молекулы

неко-

торые ионы

(см. рис. 4.15,

б).

Модель Даниелли-Давсо-

на

получила многочислен-

ные

экспериментальные

подтверждения

и в

модифи-

цированном

виде использу-

ется

и в

настоящее время.

Она

была обоснована

ре-

зультатами, полученными

при

помощи поляризацион-

ной

микроскопии, опреде-

ления

электрических пара-

метров клеток,

их

проница-

емости, методом дифракции

рентгеновских

лучей

др.

6 Однако

убедительные

до-

Рис.

4.15.

Модель

биологической мембраны

казательства

пользу

ЭТОЙ

Даниелли-Давсона

(а) и

модель

Стена-ДаниеллиМОДели

были получены

(б)

только методом электрон-

ной

микроскопии

с ее

мно-

гочисленными разновидностями (метод темного

светлого поля,

метод

замораживания-скалывания,

метод

сканирующей электрон-

ной

микроскопии

др.). Исследователи перешли

детальному

вы-

яснению

структуры

мембран субклеточных образований, клеток ор-

ганов

тканей многоклеточных растительных

животных организ-

мов.

Были опубликованы многочисленные данные

мембранах

микроорганизмов.

Мембранология пережила настоящий

бум

и в

на-

стоящее время

претендует

на

оформление

самостоятельную науч-

ную дисциплину. Накопленный обширный материал требовал

сис-

тематизации, обобщения, гипотез

теорий, позволяющих

в их

мно-

гообразии

найти

единство;

результате

был

предложен

ряд

новых

моделей биомембран, позволяющих объяснить новые факты,

не

ук-

ладывающиеся

прокрустово ложе

старых

представлений.

Трехслойное строение биомембран наблюдали многие ученые

при

электронно-микроскопических исследованиях клеток.

В 1959-

195

1960 гг. Д.Робертсон предложил унитарную (единообразную) мо-

дель строения биомембран. В классическую модель Даниелли-Дав-

сона

он внес дополнение о том, что на наружной поверхности мемб-

ран

лежит слой фибриллярного гликопротеида в развернутой кон-

формации.

Мембрана обладает структурной асимметрией

(рис.4.16,а).

Но

на ряде микрофотографий исследователи получали изображе-

ние

мембраны в виде системы глобулярных частиц. При помощи де-

тергентов выделяли глобулы и вновь собирали их них фрагменты

мембран. Это привело к созданию Шёстрандом

(1963)

Дж.А.Люси

(1964)

глобулярной модели (рис.4.16, б и 4.17, а).

Рис. 4.16.

Модель

биологической

мембраны

Робертсона

(а) и

Шестранда

(б)

Модель С.Шестранда предусматривала образование липидных

мицелл, с которыми молекулы белка взаимодействуют различными

способами. По представлению Дж.А.Люси, мицеллы включают в

свой состав липиды и белки, образуя белково-липидный комлекс, и

поэтому мембрана состоит из белковых

глобул

и липидных мицелл

(рис.

4.17, а).

А.А.Бенсон

(1966)

предложил модель мембраны, получившую

название

модели "ковра". В его модели полярные головки липидов и

полярые части белков находятся на наружной и внутренней поверх-

ностях, а внутри мембраны располагаются неполярные хвосты ли-

пидов,

которые переплетаются с неполярной частью белка за счет

гидрофобных взаимодействий (рис.4.17, б).

Примерно

в это же время Д.Е.Грин предлагает модель внутрен-

196

ней

мембраны митохондрий в виде повторяющихся элементов, на-

поминающих конторскую печать, имеющих основание, шейку и го-

ловку (рис. 4.17, в).

Рис. 4.17.

Модель

биологических

мембран

Люси

(а),

Бенсона

(б) и

Грина-Пердью

После

обоснования идеи молекулярной подвижности липидов и

белков в модельной мембране и биомембране (Л.Д.Фрай и М.Эди-

дин,

1970; Г.М.Мак-Коннел, 1971) С.Дж.Синджер и ГЛ.Николсон

1972 г. предложили жидкомозаичную модель биомембраны, осно-

ву которой составляют фосфолипиды, находящиеся в жидкокри-

сталлическом состоянии, в которые погружены в разной степени

молекулы белков (рис.4.18 и

4.19).

Динамическая

жидкокристаллическая мозаичная модель био-

мембраны общепринята. Она предусматривает возможность свобод-

ного движения молекул липидов и белков, но многие белки (интег-

ральные) и часть липидов (аннулярных) находятся в фиксирован-

ном

состоянии с резко ограниченной подвижностью. Необходимо

указать на

структурную

и функциональную асимметричность био-

мембран, их мозаичность, высокую лабильность мембранных ком-

понентов,

зависимость их состояния от физико-химических показа-

телей микроокружения,

отсутствие

сильных связей (ковалентных и

электростатических)

между

молекулами, входящими в состав мем-

197

Липидный

бислой

Молекула'

липида

Молекула

белка

Рис.

4.18.

Участок

модели биологической мембраны Синджера-Николсона

мм

Липополисахарид

Бело».

формирующий

пору

Растворимый

белок

пери-

плазматическом

пространстве

Транспортный

белое

Рис.

4.19. Клеточная оболочка грамотрицателыюй бактерии

бран.

Стабильность мембранных структур и функций обеспечивают

многочисленные слабые гидрофобные и ван-дер-ваальсовые связи.

Это объясняет как достаточную стабильность биомембран, так и их

высокую подвижность, приспособляемость к выполнению много-

численных функций в меняющихся физико-химических условиях.

Причем

эти изменения

могут

затрагивать как отдельные участки

(мозаичность),

так и мембрану в целом.

7. Мембранный транспорт

Основные понятия

Мембранным

транспортом называют любой переход атомов,

ионов,

молекул веществ через мембрану из среды в клетку или в об-

198

ратном направлении независимо от путей, сил и механизмов пере-

носа.

Проницаемость

мембраны

- это способность мембраны пропу-

скать через себя атомы, ионы, молекулы веществ.

В зависимости от характера связи транспорта данного иона ме-

талла

или молекулы конкретного вещества от переноса

других

ионов

или молекул веществ выделяют:

унипорт

- транспорт ионов или молекул через мембрану незави-

симо от транспорта

других

соединений, например молекул газов,

воды;

симпорт

- одновременный и однонаправленный перенос ионов

или молекул

двух

различных веществ, например перенос ионов на-

трия и глюкозы через мембрану клеток эпителия тонкой

кишки;

антипорт

- одновременный транспорт ионов или молекул веще-

ства через мембрану в противоположных направлениях (рис.

4.20).

Транспортируемая

Котранспортируемый

ион

молекула

УНИПОРТ

СИМПОРТ

АНТИПОРТ

Котранспорт

Рис. 4.20.

Классификация

способов

транспорта

веществ

через

мембрану

Котранспорт

- взаимозависимый транспорт ионов или молекул

веществ через мембрану. К котранспорту относят симпорт и анти-

порт.

Биомембраны являются высокоспециализированными транспор-

тными системами, обеспечивающими избирательную проницае-

мость веществ преимущественно в одном направлении. Транспорт

веществ осущестляют специальные мембранные

структуры:

кана-

лы, переносчики, насосы (рис.

4.21).

Каналы

- образования белковой природы (чаще всего крупные

молекулы белка), имеющие центральную полость для прохождения

преимущественно ионов одного вида (Na

, K

, Са , Н

) и механиз-

мов, обеспечивающих их открытие и закрытие.

199

Транспортируема

молекула

АКТИВНЫЙ

ТРАНСПОРТ

Рис.

4.21. Виды пассивного и активного транспорта веществ через мембрану

Переносчики

- молекулы веществ, осуществляющие транспорт

ионов

или молекул в

результате

временного взаимодействия их с

веществом. На роль переносчиков претендуют ионофоры, сиаловые

кислоты,

белки.

Насосы

- мембранные АТФазы, специализирующиеся на проти-

воградиентном переносе ионов Na

, K

, Са

, Н

за счет энергии

гидролиза АТФ. Активный транспорт

требует

специальных фер-

ментов-АТФаз, утилизирующих энергию гидролиза АТФ для со-

вершения

работы по переносу атомов или молекул веществ чаще

всего против электрохимического градиента (см. рис.

4.21).

По

способам использования энергии выделяют:

пассивный

транспорт

- перенос вещества идет самопроизвольно

по

электрохимическому градиенту с уменьшением свободной

энер-

гии

системы (клетки);

активный

транспорт

подразумевает перенос веществ, как пра-

вило,

против электрохимического градиента с участием АТФаз с

затратой энергии гидролиза АТФ непосредственно в акте переноса

(это

первично-активный

транспорт);

вторично-активный

транспорт

- это перенос соединений за

счет предварительно созданных градиентов, за счет первично-ак-

тивного транспорта. Вторично-активный транспорт обеспечивает

котранспорт глюкозы (Сахаров), аминокислот за счет создания гра-

диента ионов натрия на мембране и его уменьшения во время

транспорта веществ. У низших эукариот для этой цели используют-

ся

градиенты протонов, ионов натрия. Для транспорта одной и той

же аминокислоты

могут

использоваться три-четыре разных пере-

носчика.

200