Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

провождается батохромным (длинноволновым) сдвигом его полосы

поглощения

в зеленую область с образованием основного максиму-

ма около 500 нм. Таким образом, спектр поглощения родопсина ха-

рактеризуется четырьмя максимумами: а-полоса (~500 нм), /3-по-

лоса (350 нм), у-полоса (278 нм) и <5-полоса (231 нм). а- и/3-полосы

спектре родопсина обусловлены поглощением ретиналя, а у- и 5-

полосы - поглощением опсина (рис. 5.8). Молярные коэффициенты

экстинкции

имеют

следующие

значения: при 500 нм -

43250,

при

350 нм -

10600

и при 278 нм -

71300.

1.0

0.6

0.2

Рис.

5.8. Спектр погло-

щения

родопсина

300

400 500

600

НМ

результате

поглощения энергии видимого света происходит

обесцвечивание родопсина и сдвиг максимума в спектре поглоще-

ния

хромофора с 500 нм в коротковолновую область, что связано с

процессом фотоизомеризации 11-цис-ретиналя в полностью-транс-

конформацию

и депротонированием шиффова основания.

Образование транс-формы ретиналя вызывает нарушение стери-

ческого соответствия хромофора и опсина, а это, в свою очередь,

приводит к целой серии конформационных перестроек в молекуле

белка, которые сопровождаются изменениями в спектре поглоще-

ния

зрительного пигмента. Такие перестройки молекулы родопсина

были впервые изучены

Г.Уолдом,

получившим за эти исследования

Нобелевскую премию в 1966 г. На конечной стадии фотолиза родо-

псина

разрывается альдиминная ковалентная связь и высвобожда-

ется свободный ретиналь в транс-конформации.

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и его восстановленная

форма

(НАДН) играют

важную

роль в процессах переноса электро-

241

на

в биологических системах. НАД в УФ-области спектра характе-

ризуется полосой поглощения с Дшах " 260 нм, а НАДН - с

Атах

при

260 и 340 нм (рис. 5.9). На основании спектральных исследований

водных растворов НАДН были получены кривые зависимости опти-

ческой плотности его образцов от температуры и с помощью урав-

нения

Вант-Гоффа оценена энтальпия конформационного перехода

динуклеотида от "открытой" к "свернутой" форме. Величина АН

этого перехода имела значение

33-69

кДж/моль. Максимум погло-

щения

никотинамидной части Д-НАДН сдвигался с 340 до

338,5

нм

при

повышении температуры его растворов от 0 до 38 °С.

1,0г

0,5

0,0

200

250 300 350 400

Рис. 5.9.

Спектры

поглоще-

ния НАД и

НАДН:

1 -

окис-

ленная

форма;

2 -

восстанов-

ленная

форма

динуклеотида

НМ

Спектры

поглощения НАД(Н) регистрировались и для анализа

действия

других

физико-химических факторов на структурно-фун-

кциональное

состояние молекул динуклеотида (рН, ионная сила,

УФ-

и ионизирующая радиация, химические агенты).

4. Пути дезактивации электронно-возбужденного

состояния

молекулы

Мы

рассмотрели первую стадию фотобиологического процесса -

поглощение биологически активного света хромофором и образова-

ние

электронно-возбужденных состояний молекул биосистемы.

242

Энергия

возбуждения, приобретенная молекулой

при

поглощениии

кванта света, реализуется различными путями.

На

рис.

5.10

схема-

тически изображены

все

возможные процессы фотофизической

дез-

активации

электронно-возбужденной молекулы. Прямые стрелки

между

уровнями

излучательные переходы, волнистые

безызлу-

чательные.

При

поглощении молекулой кванта света происходит

переход одного электрона

заполненного уровня

(So) на

один

из не-

заполненных

уровней. Молекула

при

этом оказывается

синглет-

ном

(Si, S2)

электронно-возбужденном состоянии.

При

переходе

Рис.

5.10. Электронные переходы в биомолекулах: So - основное (невозбужден-

ное)

состояние; S

T, , Т

- возбужденные соответственно синглетные и трип-

летные состояния; около каждого уровня показано направление спина возбужденно-

го электрона по отношению к спину оставшегося электрона; жирные горизонтальные

линии - чисто электронные уровни энергии, топкие (0, 1,2 ... или 0, 1,2...^колеба-

тельные уровни;

прямые

стрелки - поглощатсльные и излучательные переходы, вол-

нистые - безызлучательные переходы; ВК - внутренняя конверсия (переходы элект-

рона без обращения спина); ИК - интеркомбинационная конверсия (переходы элект-

рона с обращением спина)

243

между

уровнями So, Si, S2 спины электронов не изменяются (анти-

параллельны). Время жизни молекул в состоянии Si составляет

Ю"

- 10'

с. За время порядка 10"

' - 10~

с возбужденная молеку-

ла безызлучательным путем

отдает

избыток электронной и колеба-

тельной энергии окружающей среде. Этот процесс в спектроскопии

получил название

внутренней

конверсии.

результате

внутренней

конверсии все молекулы вещества, независимо от того, в какое

электронно-колебательное состояние они были переведены погло-

щенным фотоном, переходят на низший колебательный подуровень

первого синглетного возбужденного состояния (Si). От этого состоя-

ния

берут

начало все последующие, конкурирующие

между

собой

фотофизические процессы, в конечном счете приводящие к дезак-

тивации возбужденной молекулы.

определенной вероятностью

могут

реализоваться следующие

пути превращения энергии возбужденного состояния Si: 1) в тепло

(тепловая диссипация вследствие безызлучательного перехода

АЛЛ/—•

So; 2) испускание кванта флуоресценции: Si-* S

+ hv фл5

3) фотохимическая реакция: Si •* фотопродукт; 4) передача (миг-

рация) энергии возбуждения

другой

молекуле; 5) переход молеку-

лы в триплетное электронно-возбужденное состояние Ti с обраще-

нием

спина электрона:

Si-vW—»Ti.

Переход из триплетного состо-

яния

в основное запрещен, так как спины электронов одинаковы

(параллельны). Поэтому в состоянии Ti молекула находится зна-

чительно дольше (10" - 10 с), чем в состоянии S i.

Известны несколько путей дезактивации триплетного возбуж-

денного состояния молекулы: 1) безызлучательный переход в ос-

новное синглетное состояние с обращением спина электрона:

So; 2) испускание кванта фосфоресценции в соответствии с пере-

ходом Ti -• So + hv фос; 3) фотохимическая реакция с образова-

нием

соответствующего фотопродукта; 4) передача энергии воз-

буждения

другой

молекуле. Излучательные переходы в молекуле

(флуоресценция и фосфоресценция) имеют общее название - лю-

минесценция.

Понятие люминесценции относится как к излучению

видимого света, так и к излучению в ближнем ультрафиолетовом и

инфракрасном

диапазонах. По виду возбуждения различают фото-

люминесценцию (возбуждение светом), радиолюминесценцию

(возбуждение ионизирующей радиацией), электролюминесценцию

(возбуждение электрическим полем), триболюминесценцию (воз-

буждение механическими колебаниями - деформациями), хемилю-

минесценцию (возбуждение в

результате

химических реакций).

Способность к люминесценции обнаруживают различные вещества.

244

Твердые и жидкие вещества, которые люминесцируют под действи-

ем различного рода возбуждений, называются

люминофорами

(на-

пример, ZnS

•

Си).

Необходимым условием люминесценции является превышение

вероятности излучательных переходов над вероятностью

безызлу-

чательных. Повышение вероятности безызлучательных переходов

приводит к тушению люминесценции, и эта вероятность увеличи-

вается при повышении температуры (температурное тушение),

концентрации

люминесцирующих молекул (концентрационное ту-

шение) или примесей (примесное тушение). Люминесценция ряда

биологических объектов (некоторые виды бактерий, грибов, некото-

рые беспозвоночные животные, рыбы) позволила получить

инфор-

мацию о процессах, происходящих в клетках на молекулярном

уровне.

Спектры

люминесценции

(испускания) - это зависимость интен-

сивности люминесценции образца от длины волны (частоты) изме-

ряемого света. Интенсивность люминесценции выражается обычно

в единицах энергии или в числе высвечиваемых квантов.

Интенсивность люминесценции (1

) возрастает с увеличением

интенсивности

возбуждающего

света do), способности вещества по-

глощать энергию света и его способности испускать кванты люми-

несценции:

где I - интенсивность вышедшего из образца света;

<р

- квантовый

выход

люминесценции, представляющий собой отношение числа

излученных квантов к числу поглощенных квантов и рассчитывае-

мый по формуле

<р

" 1л / do - I); с - молярный коэффициент погло-

щения;

с - концентрация вещества; 1 - толщина образца (длина

оптического пути).

Измерение спектров люминесценции проводят с помощью прибо-

ров, называемых спектрофлуориметрами. Высокая

чувствитель-

ность, точность и быстродействие обусловили широкое распростра-

нение

люминесцентных методов исследования в биологии, медици-

не,

сельском хозяйстве, химии и

других

областях знаний. Регистра-

цию люминесценции используют для качественного и количествен-

ного анализа, а также для изучения

структуры

и функции биоси-

стем различной сложности организации: от макромолекул и мемб-

ран до целых органов и организмов.

Наряду со спектрами люминесценции часто для решения специ-

альной задачи приходится регистрировать

спектры

возбуждения

люминесценции, под которыми понимают зависимость интенсивно-

245

сти люминесценции (1

) объекта от длины волны возбуждающего

света (Авозб):

Wio-f

Ывозб) или

ijio~<p

а -т) -

<р

а -ю~

еЫ

где Т - светопропускание образца.

В разбавленных растворах 1

пропорциональна концентрации

индивидуальных веществ, поэтому в данном

случае

спектры воз-

буждения люминесценции по форме соответствуют спектрам погло-

щения

люминесцирующих веществ. В

случае

концентрированных

растворов чистых веществ, т.е. при полном поглощении возбуждаю-

щего света, величина (1 - Т) - 1 и спектры возбуждения люминес-

ценции

представляют собой прямую линию, параллельную оси

длин волн. Спектры возбуждения люминесценции измеряют в био-

логических исследованиях с целью установления спектра поглоще-

ния

вещества, ответственного за флуоресценцию объекта в данной

спектральной области. Это важно для идентификации флуоресци-

рующих веществ. Измерение спектров возбуждения люминесцен-

ции

в сочетании с измерением спектров люминесценции - один из

основных методов изучения миграции энергии возбуждения

между

молекулами в биообъекте. Если спектр возбуждения люминесцен-

ции

полностью совпадает со спектром поглощения смеси

двух

ве-

ществ, то это свидетельствует о 100 %-ной эффективности мигра-

ции

энергии от одного из компонентов системы к ее

другому.

Как

отмечалось выше, возбужденная молекула может перехо-

дить из состояния Si в основное состояние с испусканием кванта

флуоресценции. Зависимость интенсивности флуоресценции от

длины волны (частоты) света называется спектром флуоресценции,

отношение количества высвеченных (пфл) квантов к числу погло-

щенных (п

) - квантовым выходом флуоресценции (В): В - пфл/ п

Отсюда

следует,

что квантовый

выход

флуоресценции отражает ве-

роятность дезактивации синглстного возбужденного состояния по

излучательному пути.

Квантовый

выход

флуоресценции триптофана в растворе состав-

ляет

~0,17:

в составе белков величина его варьирует от 0,02 до 0,4.

Тирозин

в водном растворе флуоресцирует с квантовым выходом,

равным 0,2. Квантовый

выход

флуоресценции тирозина в белках

очень низок из-за различных эффектов тушения свечения.

Квантовый

выход

флуоресценции фенилаланина в растворе со-

ставляет <•» 0,04: флуоресценция его молекул в белках обычно не

проявляется.

В отличие от белковых систем нуклеиновые кислоты, азотистые

основания,

нуклеозиды и нуклсотиды при комнатных температурах

246

нейтральных значениях рН практически не флуоресцируют. Аде-

нин,

гуанин, цитозин, тимин и ДНК при физиологических услови-

ях среды имеют очень низкие квантовые

выходы

флуоресценции

(около 10" ). Интенсивность флуоресценции нуклеиновых кислот и

азотистых оснований значительно возрастает при экстремальных

значениях рН, а также при низких

температурах.

Спектры флуоресценции сдвинуты в длинноволновую область по

сравнению с длинноволновой полосой поглощения (закон Стокса) и

зеркально-симметричны данной полосе поглощения (правило Лев-

шина) . Закон Стокса означает, что энергия кванта флуоресценции

меньше энергии кванта

возбуждающего

света, так как часть погло-

щенной

энергии за время порядка 10 с растрачивается в тепло, и

испускание флуоресценции происходит

всегда

с нижнего

возбуж-

денного энергетического уровня Si.

Форма спектра люминесценции (правило Каши) и квантовый

выход

(закон Вавилова) не зависят от длины волны

возбуждающего

света.

Измерение флуоресценции также проводят с помощью спектроф-

луориметров.

Флуоресцентный

метод

анализа - один из безынерционных, вы-

сокочувствительных методов исследования, с

успехом

применяе-

мых для качественного и количественного анализа смесей веществ,

изучения механизма фотофизических и фотохимических процессов

в биосистемах и конформационных свойств биомакромолекул. Флу-

оресценция - наиболее распространенный экспериментальный ме-

тод обнаружения процесса миграции энергии в системах: хлоро-

филл b -» хлорофилл а; ароматические аминокислоты белка -» фи-

кобилины;

белок -» краситель; тирозин -» триптофан; триптофан-»

триптофан; глобин -» гем в составе гемоглобина и др.

При

освещении раствора поляризованным светом флуоресценция

его

будет

также поляризована, если за время жизни возбужденного

состояния молекулы не

успевают

переориентироваться. В этом слу-

чае измеряют так называемые

поляризационные

спектры

флуорес-

ценции

- зависимость степени поляризации флуоресценции объекта

от длины волны

возбуждающего

света (поляризационные спектры

по

поглощению) или длины волны регистрации при фиксированной

длине волны возбуждения (поляризационные спектры по испуска-

нию).

Степень поляризации флуоресценции (Рдо) - доля поляризо-

ванного света флуоресценции в общей суммарной интенсивности

флуоресценции.

Степень поляризации флуоресценции определяют по формуле

247

ще II и i - интенсивности световых потоков флуоресценции, поля-

ризованных взаимно перпендикулярно ( поляризована аналогично

возбуждающему свету).

Теоретически Рфл может достигать значения 0,5. Практически в

случае

сильно вязких растворов ее величина не превышает 30-

33 %; в

случае

симметричных молекул предельные значения Рфл

составляют 0,14. Реальные значения Рфл зависят от степени релак-

сации

молекулы (вязкости ее ближайшего окружения - микровяз-

кости) за время жизни возбужденного состояния (т). Связь

между

степенью поляризации флуоресценции и вязкостью среды (ф

уста-

новлена Перреном и Яблонским:

l/P-l/3-O/Po- 1/3) <TRT/V>7 + 1),

где Ро - предельные значения поляризации при

T/rj-*-O;

R - газовая

постоянная;

Т - абсолютная температура; V - объем моля флуорес-

цирующих молекул. Этой формулой пользуются для расчета значе-

ния

т.

Варьируя

угол

направления поляризации флуоресценции, можно

установить направление и степень ориентации молекул в анализи-

руемом образце. Исследование поляризации флуоресценции позво-

ляет изучать миграцию энергии в биосистемах, определять размеры

биомакромолекул и время жизни их возбужденного состояния. По-

ляризацию флуоресценции определяют также, чтобы судить о мик-

ровязкости

структур

клетки. Измерив Рфл для флуоресцентного

зонда (например, 1-анилинонафталин-8-сульфоната), введенного в

мембранную систему, можно определить микровязкость мембраны.

Другим излучательным путем дезактивации электронно-возбуж-

денного состояния молекулы, помимо флуоресценции, является

фосфоресценция

- высвечивание кванта света молекулами, находя-

щимися

в триплетном возбужденном состоянии. Зависимость ин-

тенсивности фосфоресценции от длины волны света называется

спектром

фосфоресценции,

отношение числа высвеченных (пфос)

квантов к числу поглощенных (п

) -

квантовым

выходом

фосфо-

ресценции

(А):

Очевидно, что квантовый

выход

фосфоресценции отражает веро-

ятность дезактивации триплетного возбужденного состояния по из-

лучательному пути. Так, триптофан и триптофанилы белков при

низких

температурах интенсивно фосфоресцируют с квантовым

выходом около 0,1.

Спектры фосфоресценции веществ сдвинуты в длинноволновую

248

область по сравнению с их спектрами флуоресценции, так как они

формируются при излучательных

переходах

фотоэлектрона с ниж-

него колебательного подуровня триплетного возбужденного состоя-

ния

на различные колебательные подуровни основного синглетного

состояния.

Например,

тирозин характеризуется спектром поглощения с

максимумами при 217 и 275 нм, спектром флуоресценции с макси-

мумом при 304 нм и спектром фосфоресценции с максимумом при

387 нм.

Регистрацию фосфоресценции используют для решения многих

проблем биологии, химии, медицины, сельского хозяйства и

других

отраслей народного хозяйства (см. спектры люминесценции). Осо-

бенно полезным оказался этот

метод

для изучения механизма пер-

вичных фотофизических и фотохимических процессов, протекаю-

щих в биосистемах (ароматические аминокислоты, белки, хлоро-

филл и родственные соединения, флавины, НАДН, витамины А, Вб,

Е, многие лекарственные вещества).

разновидности люминесценции, сопровождающей химические

реакции,

относится и

хемилюминесценция.

В этом

случае

кванты

света испускают продукты реакции или

другие

компоненты, воз-

буждаемые

вследствие переноса энергии к ним от продуктов реак-

ции.

Хемилюминесценцию можно разделить на две стадии: 1) обра-

зование возбужденного продукта (Р*) из исходных реагентов и 2)

переход

возбужденной молекулы Р* в основное состояние (Р) с ис-

пусканием фотона с энергией (Р*-* Р + h v), т.е. хемилюминесцен-

ция

- пример прямого преобразования химической энергии в свето-

вую. Хемилюминесценция обнаруживается при протекании газо-

фазных, жидкофазных и гетерофазных реакций: ее спектр может

располагаться в ИК-, видимой или УФ-областях. Хемилюминес-

ценция

сопровождает реакции, идущие самопроизвольно при сме-

шивании

реагентов, или реакции, происходящие под влиянием раз-

личных агентов - источников дополнительной энергии (электриче-

ский

разряд, свет, ионизирующее излучение и т.д.). Интенсивность

хемилюминесценции пропорциональна скорости реакции и

эффек-

тивности хемилюминесценции, под которой понимают число кван-

тов хемилюминесценции на один акт реакции.

реакциям, сопровождающимся хемилюминесценцией, отно-

сятся различные процессы окисления (окисление кислородом лк>-

минола, люцигенина, силоксена, белого фосфора).

Частным

случаем

хемилюминесценции является

биолюминес-

ценция

- холодное свечение ряда живых организмов, начиная с бак-

249

терий и кончая рыбами; всем хорошо известны также жуки-светля-

ки

северных широт

(Lampyris

noctiluca) и летающие светляки чер-

номорского побережья Кавказа (L. mingrelica). Механизм биолюми-

несценции

еще полностью не раскрыт,

хотя

и представляет очень

большой интерес. Общепризнано, что биолюминесценция - это хи-

мическая реакция, сопровождающаяся испусканием видимого света

в области

550-595

нм у различных летающих светляков. В основе

данной реакции лежит окисление

субстрата

люциферина (ЬЩ)

кислородом

воздуха

в присутствии фермента люциферазы (Е). Сис-

тема люциферин-люцифераза локализована в мембранах подобно

родопсину. Специальные органы для биолюминесценции называ-

ются

фотофорами.

Реакцию высвечивания квантов биолюминес-

ценции

записывают в таком виде:

ЬНг

АТФ + Ог »Ь=О

АМФ + ФФ + СО2

свет,

где ФФ - пирофосфат.

Люциферин летающего светляка с химической точки зрения -

карбоновая кислота со структурной формулой

,ъ

s s сн

Структуры люциферинов

других

организмов отличаются от та-

ковой летающего светляка.

Указанная карбоновая кислота активируется в

ходе

вышеописан-

ной

реакции, протекающей с

участием

АТФ с превращением в лю-

цифериладенилат:

О Р

~ Н г Л „

250