Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

вых генераторов (лазеров) позволяет стимулировать квантовые пе-

реходы

между

вполне определенными уровнями энергии атомов и

молекул. В отличие от лазерной спектроскопии, в спектроскопии,

использующей нелазерные источники света, получают спектры,

возникающие

результате

переходов

между

громадным числом

квантовых состояний атомов и молекул.

Создание достаточно мощных лазеров видимого диапазона, излу-

чение которых имеет фиксированную

частоту,

позволило присту-

пить

к проведению серьезных экспериментов в области лазерной

спектроскопии.

Принципиально новые возможности лазерной спек-

троскопии

открылись с появлением лазеров с перестраиваемой час-

тотой; это дало возможность решать важные задачи, перед которы-

ми

спектроскопия обычных источников света практически бессиль-

на.

Так, благодаря высокой монохроматичности излучения лазеров

с перестраиваемой частотой удается измерять истинную форму

спектральных линий вещества, не искаженную аппаратной функ-

цией

спектрального прибора. Из-за высокой монохроматичности и

когерентности излучение лазера переводит значительное число ча-

стиц из основного состояния в возбужденное, что повышает

чувст-

вительность регистрации атомов и молекул. В 1см вещества

удает-

ся

регистрировать включения, состоящие из 10

атомов или 10

молекул. Успешно разрабатываются методы регистрации отдель-

ных атомов и молекул. Лазерная спектроскопия

дает

возможность

изучать быстропротекающие (<**10 - 10" с) процессы возбужде-

ния,

девозбуждения и передачи возбуждения в веществе, а также

исследовать спектры рассеяния и флуоресценции атомов и молекул

атмосфере на расстоянииЧОО км и получать информацию о ее со-

ставе, осуществлять контроль загрязнения окружающей среды. Ла-

зерная

спектроскопия позволяет анализировать состав малых коли-

честв веществ, имеющих размеры порядка длины волны.

Приборы,

применяемые в лазерной спектроскопии, принципи-

ально отличаются от обычных спектральных приборов. В них ис-

пользуются лазеры с перестраиваемой частотой, поэтому отпадает

необходимость в разложении оптического излучения в спектр с по-

мощью диспергирующих элементов (призм, дифракционных реше-

ток

- основных частей обычных спектральных приборов).

Лазерная спектроскопия широко внедряется в биологию, химию

медицину, особенно для исследования короткоживущих продук-

тов, химических и биологических реакций.

271

Инфракрасная

спектроскопия

Инфракрасная

спектроскопия (ИК-спектроскопия) - раздел

спектроскопии,

задачу

которого

входит

получение, исследование

применение спектров люминесценции, поглощения и отражения в

инфракрасной

области спектра. Инфракрасная спектроскопия зани-

мается преимущественно анализом молекулярных спектров, так

как

в ИК-области расположено большинство колебательных и вра-

щательных спектров молекул.

В ИК-диапазоне поглощается свет именно тех частот, которые

равны

частотам колебаний атомов в молекуле. В инфракрасной

спектроскопии

наиболее широкое распространение получило изу-

чение ИК-спектров поглощения, возникающих в

результате

погло-

щения

ИК-излучения при прохождении его через вещество. Проис-

хождение ИК- спектров обусловлено главным образом колебаниями

атомов в молекуле. ИК-спектр состоит из большого числа полос,

причем для молекулярного анализа важно то, что часть полос по-

глощения

может быть приписана колебаниям отдельных атомов

группировок, более или менее сохраняющих свойства в разных мо-

лекулах.

Исследования в области инфракрасной спектроскопии

обычно проводятся в интервале длин волн от 1 до 25 мк

(10000

- 400

см"

Основные характеристики спектра ИК-поглощения: число полос

поглощения

в спектре, их положение, которое определяется часто-

той v (или длиной волны Д), ширина и форма полос, величина по-

глощения.

Эти характеристики ИК-спектра определяются

структу-

рой

и химическим составом поглощающего вещества и зависят от

его агрегатного состояния, а также от температуры, давления и дру-

гих факторов. Следовательно, методы инфракрасной спектроскопии

позволяют определять

структуру

молекул, их химический состав,

моменты инерции молекул, величины сил, действующих

между

атомами в молекуле, проводить качественный и количественный

анализ

смесей различных веществ (полимеров, полупроводниковых

материалов, биологических соединений). С помощью быстродейст-

вующих спектрофотометров регистрируют ИК-спектры поглоще-

ния

за доли секунды, что необходимо при изучении быстропротека-

ющих химических и биохимических реакций. Инфракрасная спек-

троскопия

играет большую роль в создании и изучении молекуляр-

ных оптических квантовых генераторов, излучение которых лежит

ИК-области спектра.

Широкое

распространение инфракрасная спектроскопия получи-

ла для выяснения структурного состояния биополимеров, в частно-

272

сти белков и полипептидов. При изучении полимеров обычно иссле-

дуют

пленки, полученные осаждением из раствора или расплава. В

случае

необходимости макромолекулы белка в исследуемом препа-

рате подвергают ориентации разными способами (растяжением,

прокатыванием, волочением, размазыванием высыхающего раство-

ра).

Для получения более богатой (глубокой) информации измеряют

не просто поглощение ИК-излучения, а так называемый инфрак-

расный дихроизм. Сущность метода ИК-дихроизма заключается в

измерении разности поглощения света, поляризованного вдоль оси

ориентации и перпендикулярно этой оси ориентации молекулы.

Так,

с помощью измерения ИК-дихроизма можно установить, как

направлены важнейшие группы белка (>О0 и -NH) по отношению

оси его макромолекулы. Необходимыми для определения частота-

ми

пептидной связи белков являются следующие:

3330

см" для ва-

лентного колебания -NH-группы, 1660 см"

для валентного колеба-

ния

>СО-группы и 1550 см" для деформационного колебания -NH-

группы. Анализ смещения этих полос поглощения, изменения их

ширины,

формы, величины поглощения позволяет судить о состоя-

нии

вторичной структуры белков и полипептидов.

Гамма-резонансная спектроскопия

Гамма-резонансная (мсссбауэровская) спектроскопия основана

на

эффекте Мессбауэра, состоящем в резонансном поглощении

атомным ядром монохроматического у-излучения, испускаемого

радиоактивным атомом.

В 1958 г. немецкий

физик

Р.Л.Мсссбауэр обнаружил, что для

ядер, входящих в состав твердых тел, при малых энергиях у-пере-

ходов

может происходить испускание и поглощение у-квантов без

потери энергии на

отдачу,

т.е. не сопровождающееся изменением

внутренней энергии тела; В спектрах испускания и поглощения на-

блюдаются несмещенные линии с энергией, равной энергии у-пере-

хода,

причем ширины этих линий равны (или весьма близки) есте-

ственной ширине линий. В этом

случае

линии испускания и погло-

щения

перекрываются, что позволяет наблюдать резонансное по-

глощение у-квантов. В соответствующих условиях эксперимента

флуоресцентное у-излученис характеризуется предельной резко-

стью линий. Так, например, резонансное у-излучение Zn имеет

полуширину всего лишь

4,8-10"

эВ, что составляет примерно

2- 10" % энергии у-кванта,равной 93 кэВ. Для сравнения необхо-

димо подчеркнуть, что для рентгеновского излучения К-линии Zn

273

ее полуширина составляет 4,7 • 10" эВ при энергии фотона 8,6 кэВ,

т.е. линия в

10000

раз шире.чем для /-излучения.

Наиболее часто с помощью гамма-резонансной спектроскопии

изучают соединения железа в силу благоприятного расположения

ядерных энергетических уровней в изотопе Fe. Этот изотоп имеет

метастабильный уровень, лежащий на 14,4 кэВ выше основного, и

переход

между

этими уровнями

даст

у-излучение, которое легко

поглощается ядрами Fe, находящимися в основном состоянии. Во

всех

природных соединениях железа содержится 2,2% изотопа

Fe,

что позволяет изучать Fe-содержащие белки (гемоглобин, ми-

оглобин, цитохромы и др.) методом гамма-резонансной спектроско-

пии.

Исследуемый образец подвергают действию

у-лучей,

испуска-

емых радиоактивным

Fe.

Если сообщить радиоактивному источ-

нику

небольшую скорость движения относительно образца (погло-

тителя) вдоль оси, соединяющей источник и образец, то частота у-

кванта немного изменится вследствие эффекта Доплера. При

неко-

тором значении собственной частоты ядра Fe образца

будут

по-

глощать у-кванты резонансно. Резонансная частота ядра Fe в геме

других

Fe-содержащих группах весьма чувствительна к воздей-

ствию соседних атомов и групп. Это

дает

возможность получать ин-

формацию

об электронной

структуре

Fe-содержащих атомных

групп в различных их состояниях в белках. Эффект может быть

усилен обогащением биополимера изотопом Fe. Наряду с гемо-

протеидами методом гамма-резонансной спектроскопии эффектив-

но

изучаются железосерные белки (ферредоксин, рубредоксин и

т.д.), а также механизмы химических реакций с участием железо-

содержащих биополимеров.

Кроме

абсорбционных гамма-резонансных спектров изучаются и

эмиссионные

гамма-резонансные спектры. Эмиссионным методом

изучено строение ряда порфириновых соединений кобальта (напри-

мер,

витамин В12).

Так

как чувствительность эмиссионного метода очень большая,

то с его помощью удается следить за быстропротекающими биоло-

гическими процессами.

Были

зарегистрированы мсссбауэровские спектры нескольких об-

разцов лунных пород. Путем сравнения со спектрами известных по-

род идентифицированы два минерала железа. Гамма-резонансная

спектроскопия

применяется в геологической разведке для экспресс-

анализа руд, проведения химического анализа веществ, получения

сведений об особенностях взаимодействия атомов в твердых

телах

колебаниях атомов в кристаллической решетке; успешно исполь-

274

зуется для исследования электронных состояний примесных атомов

в металлах и полупроводниках и для решения

других

задач.

Дисперсия оптического вращения (ДОВ)

Дисперсия оптического вращения (оптической активности) - за-

висимость

угла

вращения (поворота) плоскости поляризации света

(<р) или удельной оптической активности (удельного вращения

[а]) от длины волны X оптического излучения, проходящего через

среду:

<р=

[а] 1-е,

где

- толщина слоя активного вещества (или его раствора); с - кон-

центрация этого вещества.

Поворот плоскости поляризации в данной среде происходит либо

по

часовой стрелке

(<р

> 0), либо против часовой стрелки dp < 0),

если смотреть навстречу

ходу

лучей света. В связи с этим оптически

активные вещества, проявляющие естественную оптическую ак-

тивность, т.е. оптическую активность, не вызываемую наличием

внешних полей, разделяют на правовращающие (положительно

вращающие, (d),

<р

> 0) и левовращающие (отрицательно вращаю-

щие,

(1),

<р

< 0). Это условное деление теряет смысл лишь вблизи

полос собственного (резонансного) поглощения среды. Еще Ж.Био

(1815)

установил, что в

случае

чистых жидкостей (скипидара), рас-

творов и паров многих (органических) веществ

угол

вращения пло-

скости поляризации

<р

тем меньше, чем больше X

(<р~Х~

). Такая

ДОВ характерна для нормальной оптической активности - вдали от

длин волн Х

, на которых в оптически активном веществе происхо-

дит резонансное поглощение. Эме Коттон, изучавший оптическую

активность для излучений сД , близкими кД

(212 нм), обнаружил

аномальную оптическую активность - увеличение

<р

с ростом X.

При

анализе оптической активности веществ наиболее удобной

величиной является молярное вращение [М Ji , связанное с

удель-

ным

вращением [а

следующим уравнением:

[М]Я=[аЦ

-М/100.

В химии белков и полипептидов в качестве молекулярной массы

М применяют среднюю массу М аминокислотного остатка из числа

остатков, составляющих полипептидную цепь.

Для

учета

показателя преломления растворителя пХ используют

скорректированное вращение среднего аминокислотного остатка

[m'u: _

[т']И = 3[а]А

•

М/100 (пА

+ 2) град- см

-дмоль"

275

В зарубежной литературе вместо

[т*Ц

чаще применяют обозначе-

ние

]х

честь Рэлея.

Кривые

ДОВ и

кругового дихроизма

(см.

Дихроизм)

области

эффекта

Коттона,

где

поглощение обусловлено основной полипеп-

тидной цепью, тонко отражают вторичную

структуру

белковых

мо-

лекул. Изучение

анализ кривых

ДОВ и

кругового дихроизма

для

таких конформации, как а-спираль,

/3-структура,

неупорядоченная

клубкообразная конформация, проводятся

на

основании результа-

тов

по

синтетическим полипептидам (например,

для

полиглутами-

новой

кислоты

полилизина),

также

по

экспериментальным

дан-

ным

для

белков,

структура

которых установлена методом рентгено-

структурного анализа.

Кривая

ДОВ

поли-Ь-лизина

а-спиральной конформации обна-

руживает минимум

при 233 нм,

пересекает

ось

абсцисс около

220 нм, имеет плечо при

215

нм

острый пик при

198 нм

(рис.

6.2).

Кривая

ДОВ

полипептида поли-Ь-лизина

/9-структурой харак-

теризуется минимумом при

<»

230

нм, имеет точку пересечения

при

220

нм и

положительный

пик при 205 нм. При

сравнении

кривой

«0

*°

2,0

-1О

-20

ISO

200 210 220 230 240 250

Рис.

6.2. Кривые дисперсии оптического вращения поли-Ь-лизина в

трех

конфор-

мациях: 1 - а-спираль; 2 -^-структура; 3 - неупорядоченный клубок

276

ДОВ для а-спирали выявляется, что в данном

случае

глубина мини-

мума почти в 2 раза меньше, пик сдвинут на 6-7 нм в область более

длинных волн, а плечо

отсутствует.

Кривые ДОВ полипептидов в неупорядоченной конформации су-

щественно отличаются от аналогичных кривых для а-спирали, fi-

структуры. В качестве стандартных образцов полипептидов с пол-

ностью неупорядоченной структурой используются щелочные и

нейтральные растворы полиглутаминовой кислоты и нейтральный

раствор полилизина.

В интервале длинных волн в отсутствие эффекта Коттона (см.

Дихроизм) для изучения вторичных

структур

применяют ДОВ.

Кривая

ДОВ описывается уравнением Моффита-Янга:

[m'h

-(а

До

/ А

- До

) + bo До

/ (А

-А^)

где коффициенты Моффита а

и b

являются параметрами, связан-

ными

с вторичной структурой биополимера. (В большинстве

случа-

ев До - величина постоянная, равная 212 нм.) Коэффициент bo в

случае

а-спирали (правой) принимает значение -630, а в

случае

конформации

неупорядоченного клубка Ьо£ 0. В водных растворах

абсолютная величина bo значительно меньше, чем в органических

средах.

Коэффициенты Ь

для /5-структуры и конформации неупо-

рядоченного клубка близки к нулю. Значение коэффициента ао за-

висит от условий среды и аминокислотного состава полипептида и

не может быть ( в противовес коэффициенту Ьо) использовано для

идентификации конформации макромолекул.

Таким образом, с помощью аномальной ДОВ удается получать

ценные сведения о конформациях биополимеров и их изменениях

(например,

переход спираль-клубок) под действием различных фи-

зико-химических факторов.

Дихроизм

- различная окраска одноосных кристаллов, обладаю-

щих двойным лучепреломлением, в проходящем свете при взаим-

ноперпендикулярных направлениях наблюдения: вдоль оптической

оси и перпендикулярной к ней. Так, например, кристалл апатита

при

освещении белым светом кажется на просвет светло-желтым,

если смотреть по направлению оптической оси, и зеленым - в пер-

пендикулярном направлении. При

других

направлениях наблюде-

ния

кристалл также виден окрашенным в какой-либо из промежу-

точных цветов. Очевидно, что дихроизм представляет собой част-

ный

случай многоцветности (плеохроизма) - изменения окраски ве-

277

ществ в проходящем через них свете в зависимости от направления

распространения

этого света и его поляризации.

Дихроизм

линейный

- неодинаковость поглощения обыкновенно-

го

необыкновенного лучей в кристаллах.

Дихроизм

круговой

(эффект Коттона) - различие поглощения

для света правой и левой круговых поляризаций. Эффект Коттона -

один

из лучших современных методов характеристики природы

спиральных конформаций и оценки степени спиральности белко-

вых молекул - был предложен в 1961 г. для белков, которые заведо-

мо содержат а-спиральные участки. Этот метод характеризуется

высокой

чувствительностью: его применяют

даже

в тех

случаях,

когда степень спиральности белков довольно мала. С помощью эф-

фекта Коттона была определена степень беспорядочности, создава-

емой в метгемоглобине и миоглобине в окисленной форме при обра-

ботке этих белков различными способами, приводящими к

денату-

рации

биополимеров. Выявлено, что такие процессы приводят к

уменьшению содержания спиральной фракции указанных гембел-

ков

от первоначальных

75-80

до 10-30 % •

Микрокалориметрия

- один из современных информативных ме-

тодов исследования суммарных свойств вещества, в частности, тем-

пературного

хода

теплоемкости. Термодинамические исследования

позволяют получать важную информацию о

структуре

и конформа-

ционных

переходах спираль-клубок в макромолекулах белков и

нуклеиновых кислот. Для этого применяются высокочувствитель-

ные

дифференциальные сканирующие микрокалориметры, разра-

ботанные отечественными (ЭЛ.Андроникашвили, П.Л.Привалов) и

зарубежными (Ю.Итимура, Е.Тэрамото) учеными. Принцип мето-

да дифференциальной сканирующей микрокалориметрии состоит в

том, что измеряется тепло, необходимое для повышения температу-

ры объекта на очень

малую

величину, при непрерывном увеличе-

нии

температуры исследуемого образца. Изменение энтальпии ДН

при

разворачивании макромолекулы под влиянием физико-хими-

ческих агентов определяется путем измерения количества тепла,

необходимого для поддержания одной и той же температуры био-

объекта и образца сравнения (например, буфера) при медленном

повышении

температуры обоих образцов. Присутствие, образца

сравнения

дает

возможность вносить поправку на вклад теплоемко-

сти (С

). Чувствительность микрокалориметра составляет не ниже

значения

16- 10 Дж • моль*

- град"

278

Кривые

плавления (процесса денатурации) молекул биополиме-

ра представляются в виде зависимости теплоемкости Ср от темпера-

туры

образца. Если в белковой макромолекуле имеются структур-

ные

домеиы с различной термоустойчивостью, то на калориметри-

ческой кривой выявляется несколько пиков Ср. Например, для фиб-

риногена

крови

существует

два пика: низкотемпературный с темпе-

ратурой плавления Т

-328 К и высокотемпературный с Т

• 368 К,

принадлежащие соответственно Д и Е - структурно-функциональ-

ным

доменам белковой макромолекулы. Доменное представление

фибриногена

имеет большое значение для понимания тонких

меха-

низмов

образования фибриновых волокон при свертывании крови.

Несколько

структурных доменов имеется и в молекулах иммуног-

лобулина G, плазминогена, тропомиозина, миозина и др.

Методами микрокалориметрии были изучены и термодинамиче-

ские

характеристики плавления ДНК. Теплота и температура

плавления

этой макромолекулы сильно зависят от значения рН сре-

ды. При возрастании величины рН от 7,0 до 9,7 Т

уменьшается от

84,8 до 66,3 °С, АН - от 40,4 до 29,9 кДж/моль, AS - от 113 до 88

Дж/(моль- К). При убывании рН от 5,4 до 3,2 Т

снижается от 84

до 55 °С, АН - от 39,5 до 10,4 кДж/моль, AS - от 107 до 52

Дж/(моль • К). Значение Т

зависит и от ионной силы образца.

помощью метода микрокалориметрии изучают также фазовые

переходы (кооперативные процессы) при плавлении фосфолипид-

ных бислоев: измеряют теплоемкость С

суспензии фосфолипидов

при

разных температурах в области фазового перехода. Показано,

что в этой области происходит резкое возрастание значения Ср.

Максимум теплопоглощения на кривой зависимости Ср от темпера-

туры

соответствует Т

. Площадь под пиком на указанной кривой

соответствует общему количеству тепла, поглощаемому при пере-

ходе

из твердого состояния липидного слоя в жидкое (фазовый пе-

реход).

Метод рентгеноструктурного анализа

Рентгеноструктурный анализ объединяет методы исследования-

структуры вещества по распределению в пространстве и интенсив-

ностям

рассеянного на анализируемом объекте рентгеновского из-

лучения. Рентгеноструктурный анализ

даст

прямую информацию о

расположении атомов в молекулах и кристаллах. В его основе ле-

жит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами ве-

щества, в

результате

которого возникает дифракция рентгеновских

лучей с длиной волны

<*<

0,1 нм. Последние рассеиваются на элект-

279

ронных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веще-

ством,

приводит к возникновению дифракционной

картины

(реги-

стрируется рентгенограмма). При рассеянии на кристалле можно

рассматривать дифракцию как отражение рентгеновских лучей

плоскостями кристаллической решетки. Дифракция наблюдается,

если

рассеянные волны находятся в

фазе,

т.е. разность

хода

лучей

равна целому числу п волн.

Условие дифракции (отражения)

дается

формулой Брэгга - Вуль-

фа:

пД

- 2dsin6,

где X - длина волны; d - расстояние между кристаллическими пло-

скостями;

в - угол между направлением падающего луча и кри-

сталлической плоскостью.

Главная идея рентгеноструктурного анализа

состоит

в определе-

нии расстояний d на основании дифракционной картины, получае-

мой для рентгеновских лучей с известной X . Дифракционная кар-

тина зависит от длины волны рентгеновских лучей и строения объ-

екта.

Подробные сведения о строении вещества можно получить

только при изучении кристаллов, так как их атомы расположены

периодически. Дифракционные максимумы характеризуются раз-

личными

интенсивностями: их анализ позволяет установить рас-

пределение электронной плотности в кристалле. Эта плотность вы-

ражается

через так называемые структурные амплитуды, которые

зависят от числа электронов в атоме и от направления рассеяния.

Методами

рентгеноструктурного анализа изучают металлы, спла-

вы, минералы, неорганические и органические соединения, поли-

меры, аморфные материалы, жидкости и газы, молекулы белков,

нуклеиновых кислот, пенициллина, витаминов (Bi 2) и т.д. Рентге-

ноструктурный анализ широко используется в медицине для по-

лучения рентгеновского изображения объекта, в промышленности

для обнаружения различных дефектов в материалах и конструкци-

ях,

для выяснения неоднородностей состава неорганических мате-

риалов. Бурному развитию молекулярной биофизики способствова-

ло

применение рентгеноструктурного анализа для исследований

пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот

(ДНК).

Крупнейшие достижения в изучении биополимеров принадлежат

кембриджской научной школе (У. Брэгг, Дж. Кендрью, М.Перутц),

исследовавшей структуру миоглобина и гемоглобина. В настоящее

время рентгенография высокого разрешения (для миоглобина до

0,14

нм) осуществлена примерно для 200 глобулярных белков (пеп-

син,

леггемоглобин, аспартатаминотрансфераза, коллаген, фиброин

280