Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

Квантовый

выход

фотолиза цистнна в растворе в

100-1000

раз

выше, чем триптофана, и составляет~0,13 (см. табл. 7.2). В белках

квантовый

выход

фотолиза цистина еще больше и колеблется от

0,18 в инсулине до 0,75 в химотрипсиногене. Фотолиз -S-S-связи

может происходить при поглощении квантов УФ-излучения как са-

мим цистином, так и ароматическими аминокислотами. Разрывы

дисульфидной связи цистина, входящего в активный центр белка,

приводят к его фотоинактивации, под которой понимают потерю

ферментативной, регуляторной, гормональной, транспортной, им-

мунологической и

других

видов активностей белковых макромоле-

кул. На рис. 7.1 приведена

схема

процессов фотопревращения ами-

нокислотных остатков белков при УФ-облучснии.

Выявлено, что существенное влияние на фоточувствительность

белков оказывает конформация их молекул. Показано, что самые

различные физические и физико-химические воздействия (повы-

шение температуры, сдвиги значений рН, присутствие в растворах

Нативный белок

Ароматические

аминокислоты

АО, <-= А + Н* «- АН* + о

-S-S- + hv,,

Радикалы

цистина

Рекомбинация

хемилюминесценция

Димеры

ДОФА,

формилкинуренин,

тирозин

ры

Реакции

без участия

О,

Фотолиз

S-S-

C-S -связей

Нарушения конформации или

повреждения активного центра

Инактивация

Рис.

7.1. Схема процессов

фотонпактпници"

белкоиых молекул

291

мочевины,

гуанидина, детергентов), вызывающие структурные пе-

рестройки белковых макромолекул, приводят к значительным из-

менениям

квантовых

выходов

фотоинактивации белков.

УФ-облучение индуцирует повышение функциональной актив-

ности

некоторых белков (карбоксипептидазы А, цитохрома с). Так,

например,

мы исследовали влияние УФ-свста

(240-390

нм) в интер-

вале доз

(1,51-30,2)

-10 Дж/м на каталитические свойства су-

пероксиддисмутазы при различных значениях рН. При этом был

выявлен эффект фотоактивации молекул фермента, наиболее вы-

раженный

при экстремальных для проявления активности СОД

значениях рН.

УФ-облучение в

дозе

151 Дж/м растворов оксигемоглобина че-

ловека приводило к

сдвигу

кривых диссоциации гембелка в область

меньших значений парциального давления кислорода, что свиде-

тельствует

о повышении сродства гемоглобина к кислороду.

Нами

изучены закономерности и особенности фотохимических

превращений

гемопротеидов (гемоглобина, цитохрома с, каталазы)

условиях различного микроокружения их молекул. Выявлено, что

главная особенность действия УФ-свста в области

250-400

нм на ге-

мопротеиды состоит в том, что ароматические аминокислоты апо-

белков фотосенсибилизируют простетические группы, а 'фотомоди-

фикация

простетических групп (гемов) индуцирует локальные кон-

формационные

перестройки апобелков. Причем первичные фотохи-

мические реакции, приводящие к фотоокислению, фотовосстанов-

лению и фотодиссоциации лигандов (Ог, СО, CN"), протекают

только в ароматических аминокислотах белковых компонентов ге-

мопротеидов: названных фотореакций не наблюдается при УФ-об-

лучении растворов гембелков в области евстопоглощения их желе-

зопорфириновых

частей.

Действие УФ-излучения на нуклеиновые кислоты

Фотохимические реакции нуклеиновых кислот - совокупность

типов фотохимических реакций, приводящих к различным повреж-

дениям

нуклеиновых кислот и прежде всего ДНК. Это - образова-

ние

фотодимеров тимина, урацила, цптозинл, смешанных димеров;

гидратация цитозина и урацила; внутримолекулярные и межмоле-

кулярные сшивки ДНК; сшивки ДНК-белок; разрывы сахарофос-

фатного остова нуклеиновых кислот.

Пуриновые азотистые основания более фоторезистентны, чем

пиримидиновые,

поэтому нуклеиновые кислоты повреждаются пре-

292

имущественно в

результате

протекания фотохимических реакций с

участием пиримидиновых оснований.

Димеризация

тимина обнаружена Р.Бейкерсом, В.Берендсом и

др.

(1958)

в экспериментах по УФ-облучению его замороженных

водных растворов. Вскоре было установлено, что фотодимеризация

тимина

играет существенную роль в инактивации бактерий и виру-

сов.

Сущность реакции фотодимеризации состоит в разрыве

5,6-двой-

ной

связи у обеих вступающих во взаимодействие молекул тимина

образовании циклобутанового кольца:

... о .. ., о J

I П I ~ I П II |

н н н

Как

прямая, так и обратная реакции имеют фотохимическую

природу и не

требуют

термической активации. Установлено, что в

замороженных растворах тимина в интервале температур от 0 до

-196 °С скорость реакций не изменяется, т.е. коэффициент 0ю ~ 1,

следовательно, энергия активации равна нулю. Фотодимеры тими-

на

характеризуются максимумом свстопоглощения около 240 нм.

Под

влиянием коротковолнового УФ-излучения

(235-239

нм) диме-

ры тимина мономеризуются: расщепляются на исходные мономеры

(рис.

7.2). Квантовый

выход

реакции фотодимеризации тимина

сильно

зависит от концентрации и степени взаимоориентации мо-

номеров тимина в момент возбуждения одного из них. При идеаль-

ном

стереометрическом соответствии мономеров (кристаллы моно-

гидратов тимина) квантовый

выход

образования димеров составля-

ет

е*>

1. По мере нарушения этого соответствия квантовый

выход

ре-

акции

фотодимеризации снижается для политимидиловой кислоты

до 0,02, а для тимидил-тимидина - до

0,003.

Фотодимеры тимина циклобутанового типа образуются в однони-

тевых полинуклеотидах и в ДНК. Квантовый

выход

фотодимериза-

ции

тимина изменяется при любых воздействиях, оказывающих

влияние

на пространственную

структуру

ДНК (изменение влажно-

сти,

температуры, значения рН, ионной силы, присутствие химиче-

ских агентов).

293

100

Рис.

7.2. Спектры

действия димериза-

ции тимина (1) и фо-

томономеризации

димеров (2) в поли-

тимидиловой кислоте

220

240 260 280 300

нм

Известны

убедительные экспериментальные доказательства

триплетного механизма образования тиминовых фотодимеров.

Дру-

гими словами, предшественником фотодимеров тимина

свободном

состоянии

и в

составе

ДНК

является триплетное возбужденное

со-

стояние

его

молекул.

Тем не

менее

научной литературе

обсужда-

ется вопрос

возможности протекания реакции фотодимеризации

тимина

через синглетное возбужденное состояние азотистого

ос-

нования.

Вероятность осуществления этой реакции через синглет-

ное

состояние тимина, особенно

при

благоприятных физических

физико-химических условиях, остается достаточно высокой.

Вызвать мономеризацию димеров нагреванием

или

химическими

реагентами

не

удается: есть только фотохимическая реакция моно-

меризации

димеров.

Фотодимеризация

урацила происходит

при

УФ-облучении

ура-

цила

или его

производных

замороженных

водных растворах

урацилсодержащих динуклеотидов, РНК вируса табачной мозаики,

транспортной

рибосомной РНК. При этом также возникают фото-

димеры урацила

циклобутановым кольцом:

,н

294

Квантовые выходы прямой и обратной реакций зависят от длины

волны действующего света.

Фотодимеры цитозина обнаружены после УФ-облучения цитози-

на,

цитидил-цитидина, ДНК. Фотодимеры цитозина неустойчивы и

темноте

могут

мономеризоваться или дезаминироваться с превра-

щением

в димеры урацила через стадию образования смешанного

димера Ц - У.

NH,

+ШГ

НН

Квантовый

выход

фотодимеризации цитозина резко (примерно в

9 раз) возрастает при повышении значения рН от 3,0 до 6,5.

Реакция

гидратации урацила и цитозина протекает под действи-

ем УФ-света в области

260-270

нм. Фотогндраты образуются в рас-

творах урацила и цитозина, их ди- и полпнуклеотидах (нуклеози-

дах), РНК и ДНК. Сущность реакции фотогидратации заключается

присоединении молекулы воды к пиримидиновому кольцу у 5,6-

двойной

связи с ее разрывом:

Видно, что эта реакция фотонсобратима: гидраты разрушаются в

темноте при повышении температуры образцов, при сдвигах рН как

щелочную, так и в кислую области, при возрастании ионной силы

295

раствора. Квантовый

выход

фотогидратации урацила в растворе до-

стигает значения

0,002,

а в полиуридиловой кислоте - 0,01.

Разрывы полинуклеотидной цепи ДНК выявляются при воздей-

ствии больших доз УФ-излучения с квантовым выходом порядка

10 -10 . Разрывы сахарофосфатного остова ДНК в

результате

УФ-

облучения можно наблюдать под электронным микроскопом.

В ряде работ получены данные, указывающие на образование

внутримолекулярных ковалентных сшивок

между

двумя компле-

ментарными цепями ДНК в растворе. Так, показано, что УФ-облу-

ченная

ДНК неспособна "расплетаться" на отдельные полинуклео-

тидные цепи при денатурационных воздействиях - разрыве водо-

родных и

других

нековалентных связей.

Квантовый

выход

образования межмолекулярных

ДНК-ДНК

сшивок

(связей) составляет ~10~ . Предполагают, что за появление

этих сшивок, как и внутримолекулярных, ответственны тиминовые

димеры.

Макромолекулы нуклеиновых кислот под влиянием УФ-света

претерпевают денатурационные изменения. Фотоденатурация ДНК

является следствием разрушения кооперативной системы слабых

нековалентных связей (водородных, гидрофобных) и частичным

(локальным) или полным нарушением ее двуспиральной

структу-

ры.

После УФ-облучения растворов ДНК наблюдается уменьшение

вязкости,

снижение сродства к метиловому зеленому, повышение

чувствительности ее макромолекулы к тепловой денатурации, что

связывают с разрывом водородных связей и нарушением нативнои

конформации

ДНК. Разрыв водородных связей в двойной спирали

молекулы ДНК был показан В.Зауэрбиром

(1960)

и другими иссле-

дователями в опытах с использованием формальдегида. Известно,

что последний реагирует со свободными аминогруппами азотистых

оснований.

Поэтому разрыв водородных связей можно определить,

измеряя

кинетику связывания формальдегида сразу после прекра-

щения

облучения образцов ДНК. При увеличении доз УФ-излуче-

ния

количество связываемого формальдегида возрастает, что ука-

зывает на разрыв- водородных связей с освобождением свободных

аминогрупп азотистых оснований в составе макромолекулы ДНК.

Разрыв

водородных связей зарегистрирован также по понижению

точки "плавления" ДНК, т.е. перехода спираль-клубок.

помощью методов вискозиметрии, электронной микроскопии,

седиментации, светорассеяния В.М.Жильцовой

(1967)

было показа-

но,

что вязкость растворов ДНК тимуса теленка падает с увеличе-

нием

времени УФ-облучения по экспоненциальному закону. Кон-

296

станта скорости уменьшения вязкости растворов биополимера ока-

залась равной 5,4- 10" мин" . Оптическая плотность растворов

ДНК

возрастала по мере увеличения времени УФ-облучения. Кон-

станта скорости увеличения гиперхромного эффекта составляла

5,8- 10" мин" . Совпадение величин названных констант свиде-

тельствует

о том, что снижение вязкости обусловлено разрывом во-

дородных связей. Молекулярная масса УФ-облученных образцов

ДНК

заметных изменений не претерпевала, что является аргумен-

том в пользу представления о конформационных превращениях мо-

лекулы ДНК вследствие УФ-облучения. К.Е.Кругляковой и сотр.

(1979)

с помощью методов спиновой метки и спиновых зондов были

получены сведения о конформационных изменениях ДНК при УФ-

облучении ее образцов.

УФ-облучение клеток (например,

E.coli)

индуцирует сшивки

нуклеиновая кислота - белок в составе РНП и ДНП. Изучение ме-

ханизма фотохимического образования ковалентных сшивок

между

ДНК

и белком позволило К.Смиту

(1962)

предположить, что ами-

нокислоты

белков (гистонов) через SH- и ОН-группы присоединя-

ются к пятому (или шестому)

углеродному

атому

азотистого осно-

вания

ДНК (прежде всего тимина).

Помимо

фотоповреждения нуклеиновых кислот в клетках проте-

кает

другой

важнейший фотобиологический процесс - фотореакти-

вация,

осуществляющаяся с

участием

фотореактивирующего фер-

мента. Этот фермент выделен как из бактериальных клеток, так и

из

клеток человека. Фотореактивирующий фермент

вступает

во

взаимодействие с циклобутановыми димерами пиримидиновых азо-

тистых оснований с образованием

соответствующего

комплекса. В

таком комплексе видимый

свет

вызывает распад димеров с регене-

рацией

исходных оснований. В лимфоцитах или фибробластах че-

ловека спектр действия фотореактивации располагается в области

300-600

нм с максимумом при 400 нм.

Таким

образом, фотореакцивация ответственна за мономериза-

цию

пиримидиновых димеров, индуцированных УФ-излучением в

нуклеиновых кислотах.

Действие УФ-излучения на липиды и биологические мембраны

Биологические мембраны (см. гл. 4) выполняют в клетке барьер-

ную функцию, основанную на их низкой проницаемости для поляр-

ных молекул и ионов. УФ-облучение биомембран приводит к про-

теканию в них одновременно нескольких фотохимических реакций:

фотоинактивация

белков в

результате

фотолиза ароматических

297

аминокислот

серосодержащих групп, пероксидное окисление

ли-

пидов, фотодеструкция различных коферментов, таких

как

пири-

диннуклеотиды, флавины, кофермент

геминовые соединения,

которые связаны

ферментными системами, встроенными

в био-

мембраны. Фотохимические реакции

участием

любого

из

этих

хромофоров должны отразиться

на

функционировании мембраны.

Пероксидное фотоокисление липидов

основная реакция превра-

щения

молекул липидов

под

влиянием УФ-излучения.

Оно

имеет

важнейшее значение

процессах фотоповреждения биологических

мембран, которые сформированы

из

фосфолипидов

белков.

УФ-свет индуцирует фотоокисление липидов: отмечается прямая

корреляция

между

степенью

их

окисляемости

степенью ненасы-

щенности жирных кислот (RH),

частности олеиновой, линолевой,

линоленовой

арахидоновой.

результате

УФ-окисления молекул

липидов образуются гидропероксиды жирных кислот (ROOH),

ко-

торые относятся

первичным относительно стабильным продуктам

реакции фотоокисления липидов.

Диеновые гидропероксиды жирных кислот имеют максимум

све-

топоглощения при^ЗЗ нм,

триеновые гидропероксиды

при

~270

нм

(рис.

7.3).

1.0

0,5

0,0

Рис.

7.3. Спектры

поглощения про-

дуктов фотолиза

> 239 нм) липи-

дов

из мозга

крыс:

— необлученные

липиды

в гептане;

— УФ-облучение

на воздухе; 3 -

УФ

-облучение в

отсутствие

кислоро-

да;

i i

250

300

»л

Квантовый

выход

реакции образования пероксидов значительно

превышает

(например,

90 для

окисления этиллинолеата).

Это оз-

начает,

что

УФ-окиеление липидов происходит

по

цепному, свобод-

298

норадикальному механизму в соответствии с такой последователь-

ностью реакций:

+ hv - R' +O2

-ДО*2

+ RH -• R + 02 -•

ROOH

->R02 + RH,-> R*+02 -RO2 + RH -R",

ROOH ROOH

где R - первичный свободный радикал; R02 - пероксидный радикал.

Первичной

фотохимической реакцией, приводящей к образованию

радикала R, является отрыв электрона или атома водорода от одно-

го из атомов

углерода

жирной кислоты (RH). Гидропероксиды, воз-

никающие при пероксидном фотоокислении липидов, претерпевают

дальнейшие превращения с образованием ряда стабильных продук-

тов окисления, в том числе альдегидов, например, малонового ди-

альдегида,

способного

давать

окрашенный хромофор (Д - 533 нм) с

тиобарбитуровой кислотой:

с-снг-сС!

от

^^о

Есть также и

другие

продукты разрушения пероксидных соедине-

ний,

сообщающие окисленным липидам

желтоватую

окраску и ха-

рактеризующиеся светопоглощением в видимой области спектра.

Используя различные условия УФ-облучения,

удается

избиратель-

но

накапливать те или иные продукты фотоокисления липидов.

Процесс образования конечных (стабильных) продуктов фото-

окисления

липидов осуществляется в две стадии:

Ненасыщенная

жирная кислота (поглощение при X < 220 нм)

сенсибилизатор, I

УФ-облучение, (Стадия 1)

кислород *

Гидропероксиды (поглощение при X « 233 нм)

УФ-облучение (Стадия 2)

вакууме

Альдегиды

и кетоны (поглощение при

260-280

нм)

Пероксидное фотоокисление липидов является двухквантовым

процессом. Видно, что реакция распада гидропероксидов может

протекать и в

отсутствие

кислорода.

УФ-свет в области 233 нм, интенсивно поглощаемый гидроперок-

сидами, индуцирует образование конечных продуктов (альдегидов

стонов).

299

Фотолиз

фосфолипидов может приводить к серьезным наруше-

ниям

структуры биомембран. Известно также, что продукты перок-

сидного фотоокисления липидов обладают достаточно выраженны-

ми

токсическими свойствами. Пероксиды липидов и продукты их

дальнейших превращений (альдегиды и кетоны)

могут

индуциро-

вать повреждение белковых молекул, в частности, сульфгидриль-

ных групп белков. Повреждение белков может быть обусловлено

как

их окислением, так и образованием стабильных ковалентных

связей

между

молекулами белков и продуктами пероксидного фото-

окисления

липидов. Последние способны инактивировать многие

ферменты,

в том числе и ацетилхолинэстеразу эритроцитарных

мембран. Указанные продукты окисляют также такие биологически

важные соединения, как цистеин, глютатион, нуклеотиды, витами-

ны

А и D, липоевую кислоту и др.

Воздействие УФ-света приводит к повышению проницаемости

биомембран для различных веществ и прежде всего для ионов. Из-

менение

ионной проницаемости клеточных мембран было обнару-

жено у дрожжей, яиц морского ежа, водорослей, простейших и т.д.

Изменение

проницаемости мембран для ионов натрия и калия

было установлено после УФ-облучения безъядерных клеток (эрит-

МЕМБРАНА

липиды

нжк*

Перекисное

фотоокисление

БЕЛКИ

-SH-

группы

-S-S-

мостики

Окисление

Разрыв

Увеличение

проницаемости

для

Н\ К', Na'

Разобщение

окислительного

фосфорилирования

Набухание

лизис

клеюк

и их

органелл

Рис.

7.4. Схема

молекулярного

меха-

низма

повреждения

мембранных

струк-

тур

животной

клетки

под

действием

УФ-

света

(НЖ1^-

нена-

сыщенные

жирные

кислоты)

300