Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

др.).

Расшифровка

сложных

рентгенограмм

белков

нуклеино-

вых

кислот

трудная

длительная

работа,

которую

проводят

с ис-

пользованием

ЭВМ.

КОНТРОЛЬНЫЕ

ВОПРОСЫ

Какие биофизические методы анализа биосистем можно отнести к конформа-

ционно-чувствительным?

Дайте определение понятию "свободный радикал". Приведите

примеры

неорга-

нических свободных радикалов и свободных радикалов органических соединений.

Напишите структурные формулы катион-радикалов и анион-радикалов арома-

тических аминокислот.

Дайте подробную характеристику супероксид-радикалу кислорода.

Назовите методы изучения свободных радикалов.

Напишите уравнение, определяющее условие резонанса в методе

ЭПР.

Охарактеризуйте

главные

направления применения ЭПР-спектроскопии в ис-

следовании биологически важных структур и процессов.

Что понимают под химическим сдвигом? С помощью какого уравнения и с ка-

кой целью он определяется?

В чем заключается сущность метода импульсного (флеш) фотолиза? Нарисуйте

блок-схему

установки для импульсного фотолиза.

10.

Каковы особенности лазерной спектроскопии по сравнению с обычной?

11.

Происхождение ИК-спектров: основные характеристики спектра ИК-погло-

щения.

12.

В чем сущность эффекта

Мсссбауэра?

Назовите области применения

гамма-

резонансной

спектроскопии.

13.

Что такое дисперсия оптического вращения? Напишите уравнение

Моффита-

Янга.

14.

Какие сведения (информацию) можно

получить

с помощью аномальной дис-

персии оптического вращения?

15.

Эффект

Коттона: определение степени

спиральное™

белков и полипептидов.

16.

Принцип метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Ка-

кие биологические процессы изучаются с помощью этого метода?

17.

Рентгеноструктурный анализ как одни из самых

точны»

методов исследова-

ния

структуры

вещества.

18.

В чем заключается

главная

идея рентгеноструктурного анализа? Основные на-

правления применения этого метода анализа в биохимии и медицине.

СПИСОК

РЕКОМЕНДУЕМОЙ

ЛИТЕРАТУРЫ

Волькенштейн

М.В.

Биофизика. М.,

1988.592

с.

Биофизика/

Под ред. П.Г.Костюка. Киев,

1988.504

с.

Современные методы биофизических исследований/ А.Л.Булычев,

В.Н.Верхотуров,

Б.А.Гуляев и др.; под ред. А.Б.Рубина. М., 1988. 359 с.

281

ГЛАВА

ОСНОВНЫЕ

ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ

ПРЕВРАЩЕНИЯ

БИОСИСТЕМ

Фотохимические и фотофизические процессы имеют огромное

значение для жизни на Земле. Как известно, природные фотохими-

ческие явления влияли на эволюцию жизни и продолжают оказы-

вать влияние на ее нынешнее существование на Земле. Энергия

Солнца утилизируется в процессе фотосинтеза, при этом из атмос-

ферного углекислого газа и воды образуются

углеводы

и выделяется

кислород.

Образование из простейших элементов сложных биоорганиче-

ских соединений, а затем и возникновение самой жизни тесно свя-

заны с фотохимическими процессами. Важнейший для жизнедея-

тельности человека и многих

других

существ

процесс - зрение - так-

же имеет фотохимическое происхождение. Многогранны и разнооб-

разны пути воздействия фотохимических процессов на нашу жизнь:

применения

фотохимии простираются от фотографии до фототера-

пии.

В этой

главе

мы приведем ограниченное число примеров из об-

ласти прикладной фотохимии и более подробно проанализируем

фундаментальные процессы фотохимии биосистем.

1. Классификация фотобиологических реакций

Фотобиологические процессы можно систематизировать как с

энергетической, так и с биологической стороны. В первом

случае

го-

ворят об эндергонических и экзергонических фотобиологических

реакциях. С биологической, функциональной стороны фотобиоло-

гические реакции можно подразделить на собственно физиологиче-

ские и деструктивно-модифицирующие.

Эндергонические

фотобиологические реакции - это такие реак-

ции,

при протекании которых образуются фотопродукты, обладаю-

щие большими запасами свободной энергии, чем исходные вещест-

ва (например: фотосинтез у растений). Основной биологический

смысл эндергонических фотобиологических реакций - превращение

световой энергии в химическую.

Экзергоничсские

фотобиологиче-

ские реакции - это реакции, идущие с уменьшением (или без суще-

ственного изменения) свободной энергии системы. Большинство

фотобиологических реакций относится к экзергоническим реакци-

ях

ям,

поэтому роль света, как отмечалось выше, по

существу

сводится

преодолению активационного барьера этих химических реакций.

Теперь проанализируем

собственно

физиологические,

или фун-

кционально-физиологические,

фотобиологические реакции, в кото-

рых только световым путем образуются фотопродукты, необходи-

мые для выполнения некоторых естественных функций клетки (ор-

ганизма).

Это означает, что определенные стадии сложной сетки

процессов обмена веществ и энергии осуществляются под действием

света.

Функционально-физиологические

фотобиологические реакции

могут

быть разделены на энергетические, информационные и фото-

биосинтетические. В

ходе

энергетических

фотобиологических реак-

ций

в АТФ запасается световая энергия (фотосинтез). При протека-

нии

информационных фотобиологических реакций кванты света

посредством образования фотопродуктов триггируют (запускают)

специализированные

усилительные механизмы, в

результате

чего

организм получает нужную ему информацию о ситуации в окружа-

ющей среде. Примеры

информационных

реакций: таксисы, зрение

у животных; тропизмы у растений; периодизмы у растений, живо-

тных, человека. К

фотобиосинтетическим

реакциям относятся

отдельные (промежуточные) фотохимические стадии последова-

тельных реакций биосинтеза некоторых органических соединений

(витамина

О, хлорофилла). Свет может активировать также фер-

ментативную систему синтеза пигментов (индукция биосинтеза).

случае

деструктивно-модифицирующих

фотобиологических

реакций

свет повреждает молекулы биообъекта, индуцирует раз-

личные химические превращения их. Основным результатом дан-

ных фотобиологических реакций является повреждение или гибель

клетки

(организма), но наряду с этими эффектами наблюдаются и

эффекты

противоположного рода, т.е. стимуляция и (или) модифи-

кация

жизненных процессов. Большинство реакций, вызываемых

УФ-излучением, относится к деструктивно-модифицирующим. Од-

нако

в ряде случаев и видимый свет способен индуцировать проте-

кание

указанных типов реакций: речь идет о фотохимическом дей-

ствии больших (лазерных) интенсивностей света и о фотодинами-

ческом эффекте. Фотодинамическое действие - поражение клеток

видимым светом в присутствии сенсибилизатора (кислорода или

красителя).

Таким

образом, деструктивно-модифицирующие фотобиологи-

ческие реакции можно подразделить на летальные, мутационные,

патофизиологические.

В дальнейшем мы сконцентрируем свое вни-

283

мание

на анализе биологических эффектов УФ-света. Почему из

оптического излучения мы выбрали только биологическое действие

УФ-лучей? Во-первых, действие видимого света на животные и рас-

тительные объекты изучается соответственно в курсе физиологии

человека и животных и курсе физиологии растений. Во-вторых, ме-

ханизм биологического действия УФ-излучения привлекает к себе

большое внимание широкого круга исследователей. Это связано: а)

с все возрастающим использованием УФ-света в биологии, медици-

не,

сельском хозяйстве, промышленной микробиологии и

других

областях народного хозяйства; б) с интересом к УФ-лучам в связи с

началом освоения космического пространства, где интенсивность

естественной УФ-радиации Солнца несоизмеримо выше, чем на по-

верхности Земли; в) в связи с возможными и ожидаемыми послед-

ствиями

научно-технического прогресса в развитии общества.

Рассмотрим более подробно причины, обусловившие необходи-

мость глубокого исследования закономерностей и особенностей био-

логического действия УФ-лучей различных длин волн. УФ-лучи

обладают мощным бактерицидным, антимитотическим, мутаген-

ным,

канцерогенным, терапевтическим (лечебным) и профилакти-

ческим действием. УФ-излучение широко привлекают для разра-

ботки ряда актуальных проблем биологии:

структура,

функции и

метаболизм нуклеиновых кислот и белков, физиология митоза,

роль цитоплазматических и ядерных

структур

в жизнедеятельности

клетки,

молекулярный и клеточный механизм

лучевого

поражения

пострадиационного восстановления.

Следовательно, УФ-излучение может использоваться в качестве

тонкого и специфического инструмента для решения проблем самой

клетки,

ее строения и функции. Так, были изучены строение и

функции

отдельных компонентов клеток млекопитающих в

культу-

ре (ядерных, ядрышковых и цитоплазматических

структур)

путем

их локального облучения УФ-микролучом.

Фотохимия широко применяется в медицине. УФ-облучение ис-

пользуется для дезинфекции, стерилизации и очистки воды, флуо-

ресценция

-для диагностики в дерматологической и стоматологиче-

ской

практике, УФ-свет - для отверждения полимерных материалов

стоматологии. С помощью фотополимеризации получают легкие

ортопедические фиксирующие повязки. Задачей фототерапии, как

области медицины, является лечение заболевания. Незначительные

кожные заболевания часто быстро проходят под действием УФ-све-

та, а такая серьезная кожная болезнь, как псориаз, поддается фото-

химиотерапии, т.е. УФ-облучение дополняется применением фото-

284

сенсибилизирующего лекарства типа 8-метоксипсоралена. Послед-

нее принимается больным за несколько часов до облучения. В обыч-

ных условиях пребывания на солнечном

свету

хватает

для синтеза

достаточного количества антирахитического витамина D3, который

необходим для образования здоровых костей. Специальное облуче-

ние

искусственным УФ-светом может защитить больных, вынуж-

денных находиться в помещении, от развития хрупкости костей и

рахита.

В настоящее время в хирургических, акушерско-гинекологиче-

ских и терапевтических клиниках для лечения ряда заболеваний

широко

используется метод аутотрансфузии УФ-облученной крови

(АУФОК). Эффективность этого метода была убедительно проде-

монстрирована на больных с островоспалительными процессами,

хронической артериальной недостаточностью конечностей, с

неко-

торыми сердечными заболеваниями, при сепсисе и др. Лечебный

эффект

метода АУФОК связывают с усилением оксигенации крови,

купированием гипоксических состояний, повышением бактерицид-

ных и нормализацией реологических свойств УФ-облученной кро-

ви,

а также стимуляцией факторов клеточного и гуморального им-

мунитета.

Далее представляется целесообразным проанализировать послед-

ствия загрязнения атмосферного

воздуха,

явившегося результатом

научно-технического прогресса, на условия жизни на Земле. Вы-

свобождая каталитически активные материалы в

ходе

своей дея-

тельности, человек может неумышленно изменить концентрации

озона,

который интенсивно поглощает коротковолновую часть

спектра УФ-излучения Солнца, защищая живые системы от ле-

тального (смертоносного) действия УФ-лучей.

Из-за

высокой вертикальной стабильности в

результате

темпера-

турной инверсии внесенные в стратосферу загрязнители

могут

су-

ществовать там несколько лет, прежде чем

будут

физически

удале-

ны

путем переноса. Поэтому они

могут

накапливаться до уровней

глобального разрушения, уменьшая концентрацию озона (Оз) в

стратосфере с биологическими последствиями на поверхности Зем-

ли.

Из-за

быстрого развития сверхзвукового воздушного транспорта,

летающего на высоте 18-30 км, началось разрушение озонового по-

яса

атмосферы. Так, перелеты через Атлантический океан 500 са-

молетов типа "Конкорд" только за летний сезон приводят к сниже-

нию

концентрации озона на 2-5%. Главной причиной разрушения

озонового защитного пояса Земли может явиться попадание в стра-

285

тосферу фторхлоруглеводородов типа дихлордифторметана CF2CI2

(CFC-12)

и трихлорфторметана

GFCI3

(CFC-11). Фторхлоруглево-

дороды имеют важное значение как аэрозольное ракетное топливо,

хладагенты (фреоны), наполнители в производстве пенопластиков

растворители. Все применения фторхлоруглеводородов в конце

концов

приводят к их выделению в атмосферу. Установлено, что в

течение

года

содержание фреонов в воздушной среде ноосферы воз-

растает почти на 10%. Основные негативные последствия загрязне-

ния

атмосферного

воздуха

фреонами связаны с их диссоциацией в

пределах стратосферы с выделением атомов хлора, вызывающих

каталитическое разложение озона.

В Антарктике было обнаружено новое явление - "озоновая дыра":

ежегодное резкое падение уровня озона в октябре. Высказана гипо-

теза, что "дыра" связана с возрастанием количества фторхлоругле-

водородов в атмосфере.

Уменьшение содержания озона обусловлено также увеличением

количества N2O в биосфере вследствие интенсивного применения

удобрений. Удвоение концентрации N2O должно привести (соглас-

но

проведенным оценкам) к снижению концентрации озона на 9-

16%, хотя столь большое увеличение концентрации N2O мало ве-

роятно

в ближайшем

будущем.

Из

вышеизложенного

следует,

что возникает опасность резкого

повышения

на Земле интенсивности биологически наиболее актив-

ной

компоненты солнечного излучения, к которой живые организ-

мы эволюционно не приспособлены.

Если

общая концентрация озона атмосферы уменьшится на 10%,

то интенсивность коротковолнового УФ-света на поверхности Зем-

ли

возрастет на 2-4 порядка. В

результате

этого УФ-излучение бу-

дет оказывать вредное влияние на живой мир: возрастет частота по-

явления

рака кожи у светлокожих людей,

будет

проявляться разру-

шительное воздействие УФ-радиации на растения, в том числе и на

сельскохозяйственные культуры, ряд

сухопутных

и морских орга-

низмов.

Все сказанное диктует необходимость систематического и

разностороннего исследования биологических эффектов УФ-излу-

чения,

и в первую очередь его коротковолнового диапазона с ис-

пользованием биообъектов различной сложности организации.

Первые данные о действии УФ-излучсния на живые системы от-

носятся

к 1877 г., когда А.Даунси Т.Блант обнаружили, что оно вы-

зывает инактивацию бактерий. Однако интенсивная эксперимен-

тальная работа развернулась только в 50-е гг. после открытия в

1949 г. явления фоторсактивации (снятия или ослабления видимым

286

светом последствий УФ-облучения клеток). Установление факта

фотореактивации вызвало быстрое исследование эффектов УФ-све-

та на клеточном уровне. Расшифровка же молекулярных механиз-

мов фотопроцессов в основном началась в 60-е гг. За последние 30

лет исследователям удалось выявить и изучить как ключевые ста-

дии сложного фотобиологического процесса в отдельности, так и их

взаимоотношения

в биосистемах.

Особенности

УФ-излучения

как

биологического

фактора

УФ-излучение относится к группе излучений электромагнитной

природы. В спектре электромагнитных колебаний УФ-область рас-

полагается

между

рентгеновскими лучами и видимым светом, зани-

мая

диапазон длин волн

^2-400

нм с энергией кванта 125-ь 3 эВ

ОэВ-

1,6 • 10"

Эрг

23ккал/моль).

Поверхности Земли УФ-свет достигает в диапазоне

287-400

нм с

энергией

квантов ^"3-4 эВ. Коротковолновая часть спектра УФ-из-

лучения Солнца, как отмечалось выше, полностью поглощается

озоновым

слоем атмосферы. В биологических исследованиях в на-

стоящее время изучается преимущественно УФ-излучение в диапа-

зоне

120+ 400 нм.

Весь спектр УФ-излучения принято делить на четыре участка:

315-400

нм - длинноволновое УФ-излучение (ДУФ);

280-315

нм - средневолновое УФ-излучение (СУФ);

200-280

нм - коротковолновое УФ-излучение (КУФ);

4. < 200 нм - вакуумный ультрафиолет.

Выявление биологических эффектов вакуумного УФ-излучения

затруднено тем, что его кванты поглощаются кислородом

воздуха,

также кварцем и стеклом (последнее пропускает только ДУФ).

Работ, выполненных с применением вакуумного УФ-излучения,

явно

недостаточно, чтобы судить о механизме его биологического

действия. Эксперименты проведены главным образом на бактери-

альных спорах. Вместе с тем интерес к изучению биологических эф-

фектов

вакуумного УФ-излучения постоянно возрастает л в настоя-

щее время в этих исследованиях происходит переход на молекуляр-

ный

уровень, т.е. изучаются фотохимические изменения нуклеино-

вых кислот, белков, нуклеотидов, нуклеозидов, азотистых основа-

ний,

аминокислот и др.

Важнейшая особенность УФ-излучения состоит в том, что УФ-

лучи разной длины волны поглощаются различными по химическо-

му составу и строению (конформации) биологическими молекула-

ми

(см. гл. 5). УФ-лучи отличаются небольшой проникающей спо-

287

собностью, что объясняется малой энергией квантов и интенсивным

поглощением УФ-света биомолекулами. При облучении многокле-

точных организмов или их тканей область первичных фотохимиче-

ских эффектов ограничивается только поверхностными слоями кле-

ток:

ДУФ проходит в ткани примерно на 1 мм, а СУФ - примерно на

0,5 мм. Напомним, что в спектре УФ-излучения Солнца, достигаю-

щего поверхности Земли, на долю ДУФ приходится 96%, а на долю

СУФ-лишь 4%.

Совокупность вышеприведенных особенностей УФ-излучения

как

биологического фактора и является причиной его высокой ак-

тивности и того многостороннего действия, которое оно оказывает

на

живые организмы и биообъекты.

Установлено, что, с одной стороны, УФ-лучи стимулируют рост и

размножение клеток, способствуют синтезу высокоактивных биоло-

гических веществ типа витаминов и антибиотиков, вызывают в ко-

же человека загар и эритему, увеличивают устойчивость клеток к

различным повреждающим агентам и повышают сопротивляемость

организма к ряду заболеваний. С

другой

стороны, наиболее сильное

повреждающее (модифицирующее) действие на клетки (микроор-

ганизмы) оказывает УФ-свет, поглощаемый нуклеиновыми кисло-

тами. Уже в середине 30-х гг. стало

ясно,

что каждый биологиче-

ский

эффект инициируется строго определенной областью длин-

волн УФ-лучей, т.е. имеет свою спектральную характеристику

(табл. 7.1).

Таблица

7.1

Спектральная

характеристика

основных

биологических

эффектов

УФ-излучения

Биологический

эффект

Загар

Эритема

Антирахитическое действие

Канцерогенное

действие

Летальное, антимитотическое действие на клетки

Мутагенное действие на клетки и вирусы

Диапазон длин волн, нм

280-400

250-320

260-310

260-320

200-320

Эритема (покраснение кожи) вызывается главным образом СУФ.

Канцерогенным

действием обладает КУФ. В

результате

неумелого

применения

этой части спектра УФ-излучения из-за недостаточно-

го знания механизма его действия УФ-лучи

могут

вызывать рак ко-

жи.

Как

следует

из данных таблицы, загар индуцируется преиму-

щественно СУФ. Летальное, антимитотическое и мутагенное дейст-

вие на клетки и живые организмы оказывает КУФ в диапазоне 250-

288

280

нм

(максимум светопоглощения

ДНК и

других

нуклеиновых

кислот

ДНП

клетке).

Значительный вклад

разработку проблемы выяснения законо-

мерностей воздействия УФ-излучения различных областей спектра

на

клетки внесли отечественные исследователи акад. Г.М.Франк,

К.А.Самойлова, В.Н.Сахаров

и др.

Фотохимические превращения биополимеров

биомембран

Действие

УФ-излучения на белковые системы

Фотохимические реакции белков

совокупность типов фотохи-

мических реакций, приводящих

различным повреждениям белко-

вых молекул

и их

возможной инактивации (активации). Доказано,

что основными хромофорами белков являются остатки ароматиче-

ских аминокислот, главным образом триптофана

и в

значительно

меньшей степени тирозина

фенилаланина.

Эти

аминокислоты,

также цистин ответственны

за

функционально активное поглоще-

ние

квантов света макромолекулами белков.

Об

этом

свидетельст-

вует

совпадение спектров действия фотоинактивации белков

с их

спектрами поглощения.

табл.

7.2

приведены сведения

степени

фотохимической чувствительности ряда аминокислот

при 254 нм.

Таблица 7.2

Фоточувствительность

аминокислот

при 254 нм

Соединение

Цистин

(S-S-связь)

Триптофан

Тирозин

Фенил

аланин

Ацетилаланин

(пептидные связи)

Гистидин

с,

л/моль-

270

2870

140

320

0,2

0,24

Фотохимические свойства

см

Ч>

0,13

0.004

0,013

0.002

0,05

<0,03

,„20

а-10

,см

13,4

4,4

0,69

0,23

0,004

0,0027

Из

данных табл.

7.2

вытекает,

что

наибольшую роль

УФ-инак-

тивации белков играют остатки серосодержащих

ароматических

аминокислот. Причем

при

действии УФ-света

> 285 нм

поглоще-

ние

осуществляется

основном триптофаном

тирозином.

более

коротковолновой области спектра

(240-260 нм)

резко возрастает

роль фотолиза цистина.

Образованию конечных стабильных фотопродуктов ароматиче-

ских аминокислот

предшествует

возникновение ряда первичных

289

(промежуточных) лабильных (неустойчивых) фотопродуктов сво-

боднорадикальной природы. Появление в белковых образцах при

УФ-облучении

(260-280

нм) свободных радикалов ароматических

аминокислот зарегистрировано с помощью методов электронного

парамагнитного резонанса, фотохемилюминесценции и фототермо-

люминесценции. Благодаря использованию низких

температур

(77 К), способствующих накоплению и стабилизации лабильных

фотопродуктов,

удалось

выяснить природу свободных радикалов

триптофана, тирозина, фенилаланина, цистина и др. Установлено,

что основной первичной фоторсакцией ароматических аминокислот

в белке является

фотоионизация

- отрыв электрона от молекулы

аминокислоты (АН) с образованием катион-радикала (АН ) и

сольватированного (захваченного средой, т.е. окруженного молеку-

лами растворителя) электрона (e

) по

следующей

схеме:

AH + hv

-.-АН*-»

+ c

При

распаде (диссоциации) катион-радикала (сильной кислоты)

возникает нейтральный радикал:

•АН

-»

-А + Н .

Ниже приведены структурные формулы свободных радикалов

ароматических аминокислот:

СНч/

COQ"

Радикал триптофана Радикал фенилаланина

Поглощение квантов УФ-свста (254 нм) цистином сопровождает-

ся

образованием свободных радикалов с локализацией нсспаренно-

го электрона на атоме серы. При фотолизе цистина разрываются

-S-S-связи и возникают радикалы типа S-СНг-СН-СООН:

•уупчг

Ы,

* сн

290

СН

COOH