Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

Последний окисляется кислородом в присутствии фермента лю-

циферазы: разрывается ацил-аденилатная связь и карбоксильная

группа отщепляется в виде СОг (см. химическую реакцию). Лю-

цифераза представляет собой белок с молекулярной массой около

50 кД, не содержащий какого-либо кофактора. Энергия квантов

света, испускаемых при биолюминесценции, значительно превос-

ходит

энергию,

выделяемую

при расщеплении АТФ. Сказанное

подтверждается тем, что свет, испускаемый светляками, имеет при

560 нм энергию 214 кДж на моль квантов, а это на порядок больше

энергии,

выделяемой при расщеплении молекулы АТФ.

Систему люциферин-люцифераза используют в качестве весьма

чувствительного индикатора АТФ: по интенсивности люминесцен-

ции

можно

судить

о количестве АТФ, так как она необходима для

свечения.

Реакция

окисления люциферина идет, вероятно, через образова-

ние

свободных радикалов, рекомбинация которых сопровождается

выделением квантов видимого света. В то же время синяя биолюми-

несценция

медузы

Aeguorea

aeguorea

происходит без участия моле-

кулярного кислорода. Этот вид

медузы

содержит фотобелок

экво-

рин,

который испускает Свет при добавлении ионов кальция. Роль

Са состоит, по-видимому, в модификации конформации эквори-

на.

Биолюминесценция бактерий происходит с

участием

восстанов-

ленного флавинмононуклеотида (ФМН

•

Ш).

Эффективность хемилюминесценции в

случае

биолюминесцен-

ции

некоторых светляков приближается к 100%, в то время как при

реакциях окисления пероксидом водорода эфиров щавелевой кисло-

ты - к 25%, а в остальных

случаях

- к 1% или гораздо ниже. Это

диктует

необходимость использования для обнаружения хемилю-

минесценции

высокочувствительной фотоэлектронной аппаратуры.

Исследование хемилюминесценции позволяет решать вопросы

перераспределения энергии в

продуктах

реакции, строения моле-

кул, определять скорости реакций или концентрацию реагирующих

веществ.

Исследование хемилюминесценции биологических систем

дает

возможность изучать механизм запасания и утилизации энергии

кванта света при фотобиологических реакциях, выяснить роль воз-

бужденных

состояний молекул в темновых (нефотобиологических)

процессах, а также механизм ферментативных реакций, сопровож-

дающихся высвечиванием квантов.

Одним из путей дезактивации электронно-возбужденного состо-

яния

молекулы является

миграция

энергии.

Это самопроизвольная

251

безызлучательная передача энергии от одной частицы (атома, мо-

лекулы) к

другой

на расстояния, значительно превышающие меж-

атомные, происходящая без растраты на тепловые колебания и без

кинетических соударений донора и акцептора энергии:

M*l+M2-Ml+M*2,

где M*i - донор энергии - электронно-возбужденная частица (моле-

кула) ; Мг - акцептор энергии - молекула в основном состоянии.

Миграция энергии - чисто физический процесс, не сопровождаю-

щийся

химическими изменениями вещества. Она происходит в га-

зах, жидкостях и твердых

телах

как

между

одинаковыми (М* -*

-* М), так и

между

разными (M*i -» M2) частицами в направлении

от более высокого к более низкому или одинаковому энергетическо-

му уровню. Известно несколько механизмов миграции энергии: ин-

дуктивно-резонансный, обменно-резонансный, экситонный и полу-

проводниковый (зонная проводимость). Мы рассмотрим только три

первые вида миграции энергии, так как зонная проводимость под-

робно излагается в курсе

физики.

Индуктивно-резонансная

миграция

энергии

изучалась на краси-

телях. Передача энергии по этому механизму осуществляется за

счет диполь-дипольных взаимодействий

между

молекулами Mi и

Мг без переноса каких-либо частиц вещества или световых квантов.

В этом

случае

энергия взаимодействия обратно пропорциональна

третьей степени межмолекулярных расстояний R, а вероятность

миграции энергии обратно пропорциональна R . Для осуществле-

ния

индуктивно-резонансной миграции энергии необходимо, чтобы

молекулы Mi и Мг имели одинаковые ДЕ

между

определенными

энергетическими уровнями (условие резонанса) и чтобы взаимо-

действия

между

ними были достаточно интенсивны (условие индук-

ции).

Миграция энергии по индуктивно-резонансному механизму

может происходить в

случае

выполнения

трех

правил Ферстера:

1. Донор энергии (M*i) должен обладать способностью к флуо-

ресценции.

2. Спектр флуоресценции донора (M*i) должен перекрываться со

спектром поглощения акцептора (Мг). Эффективность миграции

энергии прямо пропорциональна площади перекрытия указанных

спектров.

3. Донор (M*i) и акцептор энергии (Мг) должны быть сближены

на

определенные расстояния (R).

Расстояния,

при которых осуществляется миграция энергии меж-

ду донором и акцептором, принято характеризовать так называе-

мым критическим радиусом Ro. Значение его колеблется для раз-

252

личных пар молекул от 1 до 10 нм и определяется временем жизни

возбужденного состояния донора (10" - 10 с), площадью (интег-

ралом) перекрытия вышеназванных спектров и величиной мигри-

рующих порций энергии.

Константа скорости переноса энергии (к

) от донора (D) к акцеп-

тору (А) по индуктивно-резонансному пути описывается уравнени-

ем Ферстера:

90001nlQyflfr,

L ,

, ,dv

где% - ориентационный фактор: донор и акцептор энергии должны

быть удачно ориентированы относительно

друг

друга;

Вфл - кванто-

вый

выход

флуоресценции; п - показатель преломления раствори-

теля; N - число Авогадро; TD - время жизни возбужденного

состояния молекул донора в отсутствие переноса энергии; RDA -

межмолекулярное расстояние

между

донором и акцептором;

FD(

- интенсивность флуоресценции донора в относительных единицах;

ел (У) - молярный коэффициент поглощения акцептора как функ-

ция

частоты v.

Если дипольные моменты излучения донора и поглощения ак-

цептора перпендикулярны

друг

другу,

то перенос энергии осущест-

вляться не

будет

=Qt).

Если направление моментов совпадает с

направлением радиуса-вектора, соединяющего молекулы D и А, то

вероятность переноса энергии максимальна (х - 4). В растворах

при

хаотической ориентации молекул и их быстром вращении %

-2/3.

Индуктивно-резонансная миграция энергии может протекать как

в рамках одной молекулы, от одних групп ее к другим (внутримоле-

кулярная миграция), так и

между

отдельными молекулами (меж-

молекулярная миграция энергии). Для обнаружения этого вида пе-

редачи энергии применяют следующие экспериментальные методы:

1) спектры действия (возбуждения) или измерения квантовых вы-

ходов

процесса при различных длинах волн возбуждающего света

(будут

рассмотрены ниже); 2) поляризационные спектры люминес-

ценции

(флуоресценции) системы из

двух

молекул (Mi + Мг); 3)

измерения кинетики затухания флуоресценции Мг при возбужде-

нии

ее в полосах поглощения молекул Мг и Mi.

Для большого числа донорно-акцепторных пар зарегистрирована

внутримолекулярная миграция энергии по индуктивно-резонансно-

му механизму: ароматические аминокислоты

белка-»

фикобилины

(фикоэритрин

фикоцианин);

тирозин-* триптофан; триптофан-»

253

триптофан; ароматические аминокислоты -» краситель в ковалент-

ных или абсорбционных комплексах белок-краситель; адениновое-»

никотинамидное кольцо в НАД*; тиазоловое-» пиримидиновое

кольцо в молекуле витамина Bi и др. Примеры межмолекулярной

миграции энергии: фикоэритрин -» фикоцианин -• хлорофилл а

(водоросли); хлорофилл b -» хлорофилл а (высшие растения).

Индуктивно-резонансная миграция энергии возможна как

между

синглетными уровнями донора и акцептора, так и

между

синглет-

ным

уровнем донора и триплетным уровнем энергии акцептора.

Обменно-резонансная,

или

триплет-триплетная

миграция

энергии

была впервые обнаружена А.Н.Терениным и В.Л.Ермолае-

вым в 1952 г. В данном

случае

энергия переносится с триплетного

возбужденного уровня донора (О) на триплетный уровень акцеп-

тора (

А) в соответствии со схемой

D + А -» *D +

A из-за прямого

перекрывания "триплетных" электронных облаков за

счет

электро-

статических взаимодействий электронов донора и акцептора. Чем

больше объем перекрывания электронных орбит (облаков), тем ве-

роятнее перенос, при котором донор и акцептор взаимно обменива-

ются своими электронами.

Отсюда

возник и сам термин "обменно-

резонансный перенос", для которого необходимо большее сближе-

ние

молекул (Ro < 2 нм), чем для индуктивно-резонансного пере-

носа энергии

между

донором и акцептором. Эффективность обмен-

но-резонансной

миграции энергии обратно пропорциональна шес-

той степени межмолекулярного расстояния (1 /R ). Скорость пере-

носа энергии по этому механизму значительно превышает

таковую

для индуктивно-резонансной миграции энергии и

достигает

значе-

ния

™ 10' с. Для обнаружения обменно-резонансной миграции

энергии используют явление сенсибилизированной фосфоресцен-

ции.

Подбирают

такую

донорно-акцепторную пару молекул, у ко-

торой синглетныи уровень донора располагается ниже синглетного

уровня акцептора (это исключает синглет-синглетный перенос), а

триплетный уровень донора, наоборот, лежит выше триплетного

уровня акцептора. Если при данных условиях свет, поглощаемый

донором,

возбуждает

фосфоресценцию акцептора и одновременно

наблюдается тушение собственной фосфоресценции донора при не-

значительных сокращениях его длительности, то это является дока-

зательством триплет-триплетного переноса энергии в изучаемой

системе.

Теория

экситонной

миграции

энергии

была впервые разработана

Я.М.Френкелем, им же в 1931 г. введено представление об эксито-

не.

Экситонный перенос энергии возникает вследствие электриче-

254

ских, диполь-дипольных взаимодействий

между

молекулами или

ионами.

Экситон

- квазичастица, представляющая собой электронное

возбуждение в диэлектрике или полупроводнике, мигрирующее по

кристаллу и не связанное с переносом электрического заряда и мас-

сы.

Описано несколько типов экситона. В молекулярных кристал-

лах образуется экситон Френкеля - элементарное возбуждение

электронной

системы отдельной молекулы, распространяющееся

(благодаря межмолекулярным взаимодействиям) по кристаллу в

виде волны. В полупроводниках образуются экситоны Ваннье-Мот-

та, представляющие собой связанную пару: электрон проводимо-

сти-"дырка". Экситоны Френкеля проявляются в спектрах поглоще-

ния

и люминесценции молекулярных кристаллов. Экситон Ваннье-

Мотта можно рассматривать как квазиатом, движущийся в

вакуу-

ме.

Искажения

структуры

кристалла, вносимые экситоном или

даже

большим числом экситонов, пренебрежимо малы. Экситоны Ван-

нье-Мотта отчетливо проявляются в спектрах поглощения полупро-

водников

в виде узких линий. Время жизни экситона невелико:

электрон

и "дырка" ("вакансия"), составляющие экситон,

могут

ре-

комбинировать с испусканием фотона. Экситон может распадаться

при

столкновении с дефектами кристаллической решетки. В кри-

сталлических

структурах

наблюдается экситонная миграция

энер-

гии

электронного возбуждения.

Вследствие

делокализации

возбуж-

денных электронных уровней в кристалле возникает возбуждение

коллективных состояний, одновременно охватывающее тысячи мо-

лекул. Это коллективное возбуждение ансамбля молекул возможно

за

счет

быстрого движения экситона. Время "скачка" его ( ~10~ с)

от одной молекулы к

другой

примерно в 10 раз меньше времени

жизни

возбужденного состояния молекулы (

у<>

10 с), поэтому

энергия

возбуждения переносится на расстояние, значительно пре-

вышающее расстояние

между

молекулами.

В биологических системах, как показано выше, наиболее частой

является миграция энергии электронно-возбужденного состояния

по

индуктивно-резонансному механизму. Как и при индуктивном

резонансе,

при экситонной миграции энергии не отмечается

эффек-

та фотопроводимости или уменьшения электрического сопротивле-

ния

образца при освещении. Это означает, что молекулы обменива-

ются не электронами, а только электронным возбуждением. Эк -

ситонная

миграция энергии возможна как

между

синглетными воз-

255

бужденными, так и

между

триплетными уровнями энергии моле-

кул.

В настоящее время

отсутствуют

убедительные

доказательства

осуществления в биосистемах миграции энергии по экситонному

механизму.

Для обнаружения индуктивно-резонансной миграции энергии

измеряют спектры действия (возбуждения) этого процесса. Под

спектрами

действия

понимают зависимость относительной

эффек-

тивности излучения (света) различных длин волн от длины волны:

Биологический эффект/Число падающих квантов - f (А).

Это же отношение принято выражать и в такой форме:

где -

<р

квантовый

выход

фотобиологического процесса; Т - свето-

пропускание образца. В данной форме спектр действия аналогичен

спектру возбуждения люминесценции, но в противоположность ин-

тенсивности люминесценции величина фотобиологического

эффек-

та не пропорциональна интенсивности света (зависит от нее по

более сложному закону). Спектры действия фотохимической реак-

ции

- зависимость поперечного сечения (вероятности) фотохимиче-

ской

реакции ( а) от длины волны облучения: о =

S<p

, где S -

поперечное сечение поглощения активного света: ^-квантовый вы-

ход фотохимической реакции. S - вероятность поглощения кванта

при

прохождении его через

молекулу

- определяется по формуле

где n - число молекул на 1 см образца; 1 - длина оптического пути;

1о и I - соответственно интенсивность падающего на образец и выхо-

дящего из него света.

Поперечное сечение поглощения (S) связано с молярным

коэф-

фициентом поглощения (с):

- 3,8

•

10"

е(см

Физический

смысл S - эффективное сечение молекулы, при по-

падании в которое происходит поглощение фотона данной длины

волны.

Поперечное сечение (вероятность) фотохимической реакции (а)

численно равно

I/D37»

где D37 - доза облучения (см. ниже), при ко-

торой 63% молекул претерпевают химические изменения, а 37%

молекул сохраняют

исходную

биологическую активность.

Спектры действия широко применяют для выяснения механизма

биологического действия оптического излучения. Анализ их

дает

256

основную информацию о природе акцепторов биологически актив-

ного света. Так, измерение спектров действия инактивации боль-

шого числа белков позволило установить, что акцепторами фото-

нов,

поглощение которых вызывает инактивацию белка, являются

ароматические аминокислоты (главным образом, триптофан) и ци-

стин.

С помощью спектров действия было продемонстрировано, что

нуклеиновые кислоты под влиянием ультрафиолетового излучения

повреждаются в основном через фотохимические превращения пи-

римидиновых азотистых оснований их молекул. Роль пигментов

(хлорофиллов, каротиноидов и фикобилинов) как акцепторов света

доказана многочисленными измерениями спектров действия фото-

синтеза. Спектры действия были использованы для выявления ме-

ханизма протекания и

других

фотобиологических процессов и реак-

ций

(фототаксиса, фототропизмов, фотокинеза, фотоморфогенеза,

фотопериодизмов и др.).

Рассмотрим физический смысл квантового

выхода

фотохимиче-

ской

реакции

(<р),

входящего в уравнение для определения попереч-

ного сечения фотохимической реакции (о) . ^-отношение числа

прореагировавших (химически измененных) молекул (щ) к числу

молекул, поглотивших фотоны (пг): = ni/пг. Величина квантового

выхода

фотохимической реакции определяется отношением кон-

стант скорости фотохимической дезактивации электронно-возбуж-

денного состояния к

сумме

констант скорости

других

процессов дез-

активации: тепловая диссипация, испускание кванта люминесцен-

ции,

фотохимическая реакция и образование фотопродукта, мигра-

ция

энергии,

переход

молекулы в триплетное возбужденное состоя-

ние.

Квантовый

выход

малоэффективных процессов в макромолеку-

лярных системах может составлять всего 10" , а в

случае

фотохими-

чески инициированных цепных реакций (например, фотохлориро-

вание в газовой фазе)

достигает

величины 10 .

Квантовый

выход

фотохимической реакции - важнейшая коли-

чественная характеристика фотохимической реакции. Расчет вели-

чины

<р

необходимо проводить с целью определения фоточувстви-

тельности биообъектов, выражаемой через значения поперечного

сечения фотохимической реакции.

Квантовые

выходы

фотоинактивации белков характеризуются

достаточно низкими значениями, находящимися для некоторых из

них в

пределах

10" - 10" . Величины квантовых

выходов

фотодиме-

ризации

тиминов колеблются от 1 (кристаллы моногидратов тими-

на) до

0,003

(тимидилтимидин). Квантовый

выход

реакции образо-

257

вания

диеновых

триеновых гидроперекисей

при

ультрафиолето-

вом облучении жирных кислот значительно превышает

(напри-

мер,

для этиллинолеата).

Определенную информацию

физико-химическом

физиологи-

ческом состояниях биосистем (биообъектов) можно получить путем

анализа

их

спектров

отражения,

под

которыми понимают кривые

зависимости отражательной способности

тел от

длины волны изме-

рения.

Отражательная способность

или

спектральный коэффициент

отражения

(р) - это

отношение интенсивности отраженного

от тел

света

(I) к

падающему

на них (1

) :р

—

1/Ь.

Величина/)

тем

боль-

ше,

чем

менее шероховата поверхность тела.

Для

хорошо отполиро-

ванных металлических зеркал

достигает значений

0,89-0,90.

На

основании анализа спектров отражения,

как и

спектров

по-

глощения,

можно проводить количественную оценку содержания

поглощающего свет вещества

образце.

Так,

например, определя-

ют количество гемоглобина

коже. Падающий монохроматический

свет do), проникая

кожу, ослабляется из-за поглощения. Некото-

рая

часть света

(р)

после многократного рассеяния клетками кожи

отражается,

т.е.

выходит обратно. При эритеме (сложном комплек-

се индуцированных ультрафиолетовым излучением биохимических

морфологических изменений

коже),

как

известно, резко усили-

вается микроциркуляция

возрастает уровень гемоглобина

коже,

поэтому уменьшение отражательной способности

области свето-

поглощения

этого гембелка (около

542 и 576 нм)

служит количест-

венным

критерием эритемы.

КОНТРОЛЬНЫЕ

ВОПРОСЫ

Что изучают квантовая биофизика и биофизика фотобиологических процессов?

Назовите области практического использования идей и методов квантовой био-

физики.

Проанализируйте отдельные стадии фотобиологического процесса.

Назовите условия, необходимые для того, чтобы произошло светопоглощение в

биосистеме.

Охарактеризуйте спектры светопропускания и светопоглощения: их примене-

ние для количественного и качественного анализов биосистем.

Назовите

типы

электронных переходов, обусловливающих спектр поглощения

вещества в видимой и УФ-областях.

Сравните спектры поглощения гемоглобина и сывороточного альбумина.

Назовите хромофорные

группы

молекул белков, нуклеиновых кислот, липидов,

хлорофилла,

родопсина, ароматических аминокислот.

Вследствие какого типа электронного перехода иозникает полоса поглощения

полипептидов и белков при 190 нм?

10.

Объясните происхождение спектров поглощения НАД и

НАДИ.

258

11.

Проанализируйте

пути

дезактивации электронно-возбужденного состояния

биомолекул.

12. Как измеряют спектры люминесценции и спектры возбуждения люминесцен-

ции

биообъектов? Какую информацию можно получить при их анализе?

13.

Каковы квантовые

выходы

флуоресценции и фосфоресценции?

14. По какой формуле определяют степень поляризации флуоресценции?

15. Что понимают под эффективностью хемилюминесценции?

16. Биолюминесценция как частный

случай

хемилюминесценции: система люци-

ферин-люцифераза, механизм взаимодействия

между

ними.

17. Миграция энергии - это чисто физический процесс или она сопровождается

химическими изменениями

вещества?

18. Назовите особенности индуктивно-резонансного, акситонного, обменно-резо-

нансного

путей

миграции энергии. Приведите примеры.

19. Какой механизм

(путь)

миграции энергии описывается с помощью уравнения

Ферстера?

20. Что понимают под спектром действия фотобиологического процесса?

21.

Каков физический смысл квантового

выхода

фотохимической реакции? Назо-

вите квантовые

выходы

фотоинактивации белков, фотодимернзации тиминов и об-

разования

гидропероксидов при УФ-облучении жирных кислот.

СПИСОК

РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Арт

юхов

В.Г., Б у ту р л а к и м М.С., Шмелев В.П. Оптические методы ис-

следования биологических систем и объектов. Воронеж, 1980. 116 с.

Бурштейн Э.А. Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследо-

вания)//

Итоги науки и техники. Биофизика. М., 1976, Т.6. 213 с.

Владимиров Ю.А., Рощу и к и н Д.И., Потапе н ко А.Я., Д ее в А.И.

Биофизика.

М., 1983. 272 с.

о н е в СВ., В о л о т о в с к и й И.Д. Фотобиология. Минск, 1979. 378 с.

Рубин А.Б. Биофизика. М., 1987. Кн.2. 303 с,

259

ГЛАВА

НЕКОТОРЫЕ

БИОФИЗИЧЕСКИЕ

(КОНФОРМАЦИОННО-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ)

МЕТОДЫ АНАЛИЗА БИОСИСТЕМ

Свободные радикалы

биосистемах

При

протекании

клетке

и ее

компонентах (например,

в био-

мембранах) некоторых окислительно-восстановительных реакций

после воздействия

на

органические молекулы (биомакромолекулы)

ионизирующей

УФ-радиации образуются свободные радикалы.

Свободные

радикалы

кинетически независимые частицы,

ха-

рактеризующиеся наличием неспаренных электронов. Широко

рас-

пространено представление

том,

что

свободный радикал

- это мо-

лекула

или ее

часть, имеющая неспаренный электрон (свободную

валентность). Свободный радикал обозначают точкой

над

соответ-

ствующей группой химического соединения

или над

условным

обозначением этого вещества. Благодаря наличию неспаренного

электрона,

свободные радикалы легко

вступают

химические реак-

ции:

для них

характерна высокая реакционная способность.

Сво-

бодные радикалы

обладают

парамагнитными свойствами,

так как

они

имеют нескомпенсированные магнитные моменты неспаренных

электронов.

Еще

одна особенность свободных радикалов

- это спо-

собность вести цепные реакции.

неорганическим свободным радикалам, которые имеют

на

внешнем

уровне один^элсктрон; относят атомы водорода

Н ,

щелоч-

ных металлов (Na*,

К и др.) и

галогенов

(СГ, Вг*, F", I*),

молекулы

окиси'ЫО

двуокиси'гЮг азота.

Свободные радикалы органических соединений подразделяют

на

короткоживущиеи долгоживущие (стабильные).

Короткоживущие

алкильные

(R*) и

арильные

(Аг*) свободные

радикалы,характеризующиеся временем жизни менее

0,1 с,

образу-

ются

при

гемолитическом расщеплении различных химических

связей.

этому типу свободных радикалов относятся метил (СНз)

этил

(СН3СН2). Короткоживущие свободные радикалы принимают

участие

главным образом

реакциях рекомбинации

(а),

присоеди-

нения

(б) и

диспропорционирования

(в),

протекающих сочень

вы-

сокими

скоростями:

СН3СН2СН2

CH3CH2CH2

СНз(СН

)4СНз,

(а)

СНзСН2СН2

СНзСН2СН

й,

(б)

260