Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 311

где S

− площадь пика, см

; V − шкала самописца, мВ·cм

–1

; F

− скорость газа-

носителя, мл·с

–1

; q − масса соединения, мг; F − скорость движения ленты са-

мописца, см·с

–1

. Размерность чувствительности в этом случае – мВ·мг·мл

–1

Чувствительность потоковых детекторов (мВ·мг·с

-1

)

= S

V / Fq. (6.28)

В последние годы чаще всего определяют предел детектирования. Для

оценки минимально обнаруживаемой концентрации необходимо, кроме чув-

ствительности, знать уровень флуктуаций (шума) нулевой линии. Мини-

мальным сигналом, поддающимся измерению, обычно принято считать сиг-

нал, высота которого в несколько раз (2–5) превышает уровень шумов d:

min

= 2δ / A

. (6.29)

Величина с

min

– предел детектирования – определяет предельные возможно-

сти прибора.

Под линейностью детекторов понимают диапазон концентраций, в пре-

делах которых наблюдается линейность зависимости сигнал – концентрация.

Для определения величины линейности строят соответствующий график. Обыч-

но диапазон линейности расположен от предела детектирования до концентра-

ций, в которых уже наблюдается отклонение от линейности на 5–10 %.

Под инерционностью (быстродействием, постоянной времени) подра-

зумевается скорость реагирования детектора на быстрое изменение концен-

трации на выходе из колонки. Детектор должен иметь такое быстродействие,

чтобы при регистрации не искажать формы полосы соединения, выходящего из

колонки. В современных, особенно ионизационных детекторах постоянная

времени – менее 0,1–0,01 с. В некоторых катарометрах, чаще всего устаревших

конструкций, постоянная времени может составлять около 1 с и даже выше.

Быстродействие сильно зависит от величины эффективного объема

ячейки.

Уровень шума нулевого сигнала детектора определяется кратковре-

менными флуктуациями. Дрейф – это монотонное смещение нулевой линии.

Величину смещения оценивают в течение 1 часа. Обычно требования к этим

показателям таковы: шум 0,5 % рабочей шкалы и дрейф не более 3 % в час.

Механизм работы детекторов

Пламенно ионизационный детектор (ПИД) основан на ионизации ор-

ганических соединений в пламени водорода. Точный механизм ионизации не

выяснен. С использованием масс-спектрометрометрии проведено исследова-

ние и обнаружено, что механизм ионообразования связан с термодеструкци-

ей и последующей хемоионизацией. В ПИД одним из электродов служит го-

релка, второй электрод − коллектор − располагается над горелкой. Малые то-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 312

ки (1·10

–9

–10

–12

А) усиливаются, так как шумы самого детектора малы. Из-за

высокой чувствительности, большого диапазона линейности ПИД стал наи-

более распространенным детектором

Детектор по теплопроводности (ДТП) − катарометр. Чувствительны-

ми элементами в ДТП являются нагретые нити (филаменты) из ряда металлов

(платина, вольфрам, сплав вольфрам–рений и др.), помещенные в специаль-

ные камеры, продуваемые газом-носителем. Филаменты включены в плечи

моста Уинстона. Через сравнительную камеру проходит поток чистого газа-

носителя, через рабочую камеру − газ-носитель с примесями разделяемых со-

единений. Сопротивление нитей зависит от температуры. При изменении со-

става газа в рабочей камере теплопроводность его изменяется, изменяется

теплопередача от нити к стенкам камеры, температура нити и, следовательно,

сопротивление нити по сравнению с сопротивлением нити в сравнительной

камере. Происходит разбаланс моста, возникает сигнал на нулевой линии.

Электронно-захватный детектор (ЭЗД) предназначен для анализа ве-

ществ, обладающих электронным сродством, в частности галогенно-

органических соединений. Полезный сигнал детектора − это уменьшение на-

чального тока, однозначно связанного с количеством анализируемого соеди-

нения. В ионизационной камере ЭЗД помещается радиоактивный источник

(например,

Ni). Под воздействием радиации молекулы газа-носителя (азот,

аргон, гелий) ионизируются с высвобождением электрона. В камере между

электродами приложено напряжение, фоновый ток создается в основном

электронами, так как их подвижность на три порядка выше, чем подвижность

ионов. Кроме того, большая часть ионов рекомбинирует, не доходя до элек-

тродов. При попадании в ячейку детектора соединений, обладающих сродст-

вом по отношению к электрону, происходит захват ими свободных электро-

нов, что приводит к снижению начального фонового тока. ЭЗД обладает вы-

сокой ионизационной эффективностью. В газе-носителе недопустимо при-

сутствие кислорода, влаги и других соединений, снижающих количество

электронов или их подвижность. Предел детектирования ЭЗД на два-три по-

рядка ниже ПИД, он сильно зависит от числа и положения атомов галогенов

в молекулах.

Термоионный детектор (ТИД) селективен к N- и P-содержащим со-

единениям за счет введения в пламя водорода паров солей щелочных метал-

лов (К, Na, Rb и Cs). Скорость введения паров щелочных металлов должна

быть стабилизирована. ТИД чувствителен к стабильности поддержания ско-

рости водорода, воздуха и газа-носителя. Селективность ТИД к N- и P-органичес-

ким соединениям по сравнению с ПИД − порядка 10

–10

Пламенно-фотометрический детектор (ПФД) селективен к S- и

P-содержащим соединениям, при сжигании которых в пламени, обогащенном

водородом, по сравнению с ПИДом, излучаемый свет от этих элементов на-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 313

правляется в фотоумножитель через специальные фильтры (394 нм для S

и 526 нм для Р).

В фотоионизационном детекторе (ФИД) ионизация анализируемых

соединений происходит за счет УФ-излучения в специальной камере с двумя

электродами. При фотоионизации молекулы анализируемых соединений дис-

социируются на ион и электрон. Образуемые ионы собираются электродами.

Ионизируются только те соединения, потенциал которых ниже энергии фотонов.

В зависимости от лампы, энергия фотонов может быть 9,5; 10,2 и 11,7 эВ. ФИД,

как и ПИД, обладает высокой чувствительностью ко всем органическим со-

единениям. К ароматическим соединениям ФИД имеет в 10–50 раз большую

чувствительность, чем ПИД. В отличие от ПИД, ФИД может регистрировать

S, PH

, NH

, AsH

Масс-спектрометрический детектор (МСД). В последние годы дос-

тигнут прогресс в создании небольших настольных МСД для газовых хрома-

тографов. В настоящее время этот высокочувствительный детектор − самый

совершенный прибор для идентификации неизвестных веществ.

Колонки для газовых хроматографов подразделяются на насадочные

(НК): препаративные, аналитические, микронасадочные и капиллярные (КК).

В насадочных, микронасадочных колонках сорбент находится внутри трубки

и имеет форму цилиндра. Набивка должна быть плотной и однородной, без

пустот. Чем плотнее и однороднее набивка, тем меньше размывание полос и

больше эффективность колонки. В КК слой сорбентов наносится на внутрен-

нюю поверхность капилляра в виде слоя жидкой неподвижной фазы или в

виде слоя адсорбента. Технология капиллярных колонок и хроматографиче-

ского оборудования в целом находится в постоянном развитии.

Разработка программного обеспечения и совершенствование хромато-

графического оборудования существенно расширили область применения га-

зовой хроматографии в науке и промышленности. Имеющаяся в Сибирском

Федеральном университете аналитическая приборная база позволяет решать

ряд биотехнологических задач. Например, поиск углеводородсинтезирующих

штаммов среди одноклеточных водорослей показал принципиальное отличие

состава углеводородов природного штамма

Botryococcus, выделенного из

озера Шира, и музейного Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950

H-252, полученный из коллекции культур одноклеточных водорослей Инсти-

тута физиологии растений РАН (IPPAS). На рис. 6.10

представлена хромато-

грамма углеводородов музейного штамма, выделенных из биомассы водо-

рослей и гидрированных для идентификации наличия ненасыщенных связей.

Углеводороды, синтезируемые природным Botryococcus, принципиально от-

личаются от музейного штамма и представлены диенами и триенами с чис-

лом атомов углерода от 23 до 29 .

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 314

Рис. 6.10. Ионная хроматограмма углеводородов музейного штамма Botryococcus braunii

Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252: а – исходный образец; б – после гидрирования [3, 22]

Не менее интересным для биотехнологии представляют ацетиленовые

кислоты, характеризующиеся противовоспалительным эффектом. Источни-

ком таких кислот может быть водный мох Fontinalis antipyretica, обильно по-

крывающий дно реки Енисей. Типичная хроматограмма жирных кислот, со-

держание которых в биомассе может достигать 15–20 % , представлена на

рис. 6.11

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 315

Рис. 6.11. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов Fontinalis

antipyretica. Первая цифра – число атомов углерода в цепи жирных кислот, вторая – чис-

ло насыщенных связей, третья – положение первой двойной связи с метильного конца.

– 6a, 9, 12–18:3; А

– 6a, 9, 12, 15–18:4; А

– 8a, 11, 14–20:3; А

– 8а, 11, 14, 17–20:4 [12]

Рис. 6.12. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов Ralstonia

еutrophа В5786 до и после гидрирования. Первая цифра – число атомов углерода в цепи

жирных кислот, вторая – число насыщенных связей, третья – положение первой двойной

связи с метильного конца [11]

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 316

Как видно, доля ацетиленовых кислот в спектре жирных кислот состав

ляет более 40 %.

Рис. 6.13. Ионные хроматограммы полигидроксиалканоатов, синтезируемые Ralstonia eutrophа;

– β-гидроксибутирата; С

– β-гидроксивалерата; С

– β-гидроксигексаноата [4, 5]

Бактерии Ralstonia eutrophа относятся к наиболее перспективным про-

дуцентам биотехнологичекого продукта − полигидроксиалканоатов (ПГА).

Они синтезирует с высокими выходами полимеры (до 80–90 %) различной

химической структуры на различных субстратах. Технология выделения по-

лимеров предусматривает использование растворителей, которые хорошо

экстрагируют из клеток и липидные компоненты, поэтому основными за-

грязнениями промышленных образцов ПГА могут быть соединения липид-

ной природы. Для того чтобы прогнозировать источник примесей в полиме-

ре, был изучен состава жирных кислот в биомассе водородных бактерий с

помощью хромато-масс-спектрометрии. Кроме того, для идентификации

жирных кислот были использованы методы химической модификации жир-

ных кислот – гидрирование и сравнение хроматограмм до и после гидриро-

вания метиловых эфиров жирных кислот. Результаты проведенных исследо-

ваний показаны на рис. 6.12

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 317

Метод газовой хроматографии используется и для качественного и ко-

личественного анализа полимера. Количественный анализ полимера прово-

дится с внутренним стандартом, в качестве которого используется бензойная

кислота. Качественный анализ позволяет выявить мономерный состав поли-

гидроксиалканоатов. На рис. 6.13

представлена серия хроматограмм полимеров с

разным соотношением мономеров – β-гидроксибутирата, β-гидроксивалерата и

β-гидроксигексаноата.

ВЭЖХ – это жидкостная колоночная хроматография, механизмы сорб-

ции в которой могут использоваться самые различные. По существу, ВЭЖХ −

это современная форма реализации классической жидкостной колоночной

хроматографии. Ниже перечислены некоторые наиболее существенные каче-

ственные характеристики ВЭЖК:

– высокая скорость процесса, позволившая сократить продолжитель-

ность разделения от нескольких часов и суток до минут;

– минимальная степень размывания хроматографических зон, что дает

возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по

константам сорбции;

– высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработ-

ки информации, благодаря чему колоночная жидкостная хроматография дос-

тигла нового уровня воспроизводимости и точности.

Интенсивные исследования последних десятилетий, громадный объем

накопленных экспериментальных данных позволяют сегодня уже говорить о

классификации вариантов в рамках метода высокоэффективной жидкостной

хроматографии. Конечно, при этом остается в силе классификация по меха-

низму сорбции, приведенная выше. Распространена классификация, основан-

ная на сравнительной полярности подвижной и неподвижной фаз. При этом

различают нормально- и обращенно-фазовую хроматографию.

Нормально-фазовая хроматография (НФХ) − такой вариант ВЭЖХ,

когда подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, и есть основания

считать, что основной фактор, определяющий удерживание, − это взаимодей-

ствие сорбатов непосредственно с поверхностью либо объемом сорбента.

Обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) − такой вариант ВЭЖХ,

когда подвижная фаза более полярна, чем неподвижная, и удерживание оп-

ределяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью

или объемом сорбента; при этом ионизированные сорбаты не обмениваются

на ионы подвижной фазы, сорбированные на поверхности.

Ионообменная хроматография − вариант, при котором сорбция осуще-

ствляется путем обмена сорбированных ионов подвижной фазы на ионы

хроматографируемых веществ; полностью аналогично можно определить ли-

гандообменную хроматографию.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 318

Хроматография на динамически модифицированных сорбентах − ва-

риант ВЭЖХ, при котором сорбат не взаимодействует непосредственно с по-

верхностью сорбента, а вступает в ассоциацию с молекулами приповерхно-

стных слоев элюента.

Ион-парная хроматография − такой вариант обращенно-фазовой хро-

матографии ионизированных соединений, при котором в подвижную фазу

добавляется гидрофобный противоион, качественно изменяющий сорбцион-

ные характеристики системы.

Эксклюзионная хроматография − способ разделения соединений по

их молекулярным массам, основанный на различии в скорости диффузии в

порах неподвижной фазы молекул различных размеров.

Для ВЭЖК очень важной характеристикой является величина сорбен-

тов, обычно 3–5 мкм, сейчас до 1,8 мкм. Это позволяет разделять сложные

смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки,

которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведе-

нии анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент)

определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно

отмеренную дозу пробы. Компоненты пробы, введенной в хроматографиче-

скую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по

ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в раз-

ные моменты времени. Таким образом, хроматографическая колонка отвеча-

ет за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая

различные типы колонок, можно управлять степенью разделения анализи-

руемых веществ. Идентификация соединений осуществляется по их времени

удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчи-

тывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помо-

щью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки.

Сорбенты. Становление ВЭЖХ в значительной мере связано с созда-

нием новых поколений сорбентов с хорошими кинетическими свойствами и

разнообразными термодинамическими свойствами. Основной материал для

сорбентов в ВЭЖХ − силикагель. Он механически прочен, обладает знач и-

тельной пористостью, что дает большую обменную емкость при небольших

размерах колонки. Наиболее ходовой размер частиц 5–10 мкм. Чем ближе к ша-

рообразной форма частиц, тем меньше сопротивление потоку, выше эффектив-

ность, особенно, если отсеяна очень узкая фракция (например, 7 + 1 мкм).

Удельная поверхность силикагеля 10–600 м

/г. Силикагель может быть мо-

дифицирован различными химическими группами, привитыми к поверхности

(С-18, CN, NH

, SO

H), что позволяет использовать сорбенты на его основе

для разделения самых различных классов соединений. Основной недостаток

силикагеля − малая химическая стойкость при рН < 2 и рН > 9 (кремнезем

растворяется в щелочах и кислотах). Поэтому в настоящее время идет интен-

сивный поиск сорбентов на базе полимеров, стойких при рН от 1 до 14, на-

пример, на основе полиметилметакрилата, полистирола и т.д.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 319

Сорбенты для ионообменной хроматографии. В силу особенностей

разделения (в кислой или щелочной среде) основной материал сорбентов −

полистирол с дивинилбензолом различной степени сшивки с привитыми к их

поверхности группами SO

-H+ (сильнокислые катионообменники) или

-СОО-Na+ (слабокислые катионообменники), -Н

N+(CH

)

Cl- (сильнооснов-

ные анионообменники) или -N+HR

Cl- (слабоосновные анионообменники).

Сорбенты для гель-проникающей хроматографии. Основной тип − сти-

рол-ДВБ. Используются также макропористые стекла, метилметакрилат, си-

ликагель. Для ионо-эксклюзионной хроматографии используются те же сор-

бенты.

Насосы. Для обеспечения расхода подвижной фазы (ПФ) через колон-

ку с указанными параметрами используются насосы высокого давления. К

наиболее важным техническим характеристикам насосов для ЖХ относятся:

диапазон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость рас-

хода; диапазон пульсаций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной по-

дачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической рабо-

те используется режим постоянного расхода, при заполнении колонок - по-

стоянного давления. По принципу действия насосы делятся на шприцевые и

на плунжерные возвратно поступательные.

Шприцевые насосы. Для насосов этого типа характерно практически

полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы. Недос-

татки насоса: а) большой расход времени и растворителя на промывку при

смене растворителя; б) приостановка разделения во время заполнения насоса;

в) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (ну-

жен мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью

Плунжерные возвратно-поступательные насосы. Насосы этого типа

обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное

время. Максимальное рабочее давление 300–500 атм, расход 0,01–10 мл/мин.

Воспроизводимость объемной подачи – 0,5 %. Основной недостаток − рас-

творитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, по-

этому существуют пульсации давления и потока. Это является основной причи-

ной повышенного шума и снижения чувствительности почти всех детекторов,

применяемых в ЖХ, особенно электрохимического. Способы борьбы с пульса-

циями: с использованием сдвоенных насосов или двухплунжерного насоса Баг-

лая, применением демпфирующих устройств и электронных устройств.

Величина объемной подачи определяется тремя параметрами: диамет-

ром плунжера (обычно 3,13; 5,0; 7,0 мм), его амплитудой (12–18 мм) и часто-

той (что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).

Дозаторы. Назначение дозатора заключается в переносе пробы, нахо-

дящейся при атмосферном давлении, на вход колонки, находящейся при дав-

лении вплоть до нескольких атмосфер. Важно, чтобы в дозаторе отсутствова-

ли непромываемые подвижной фазой «мертвые» объемы и размывание про-

бы в ходе дозирования. На первых порах дозаторы в ЖХ были аналогичны

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 320

газовым с проколом мембраны. Однако более 50–100 атм мембраны не дер-

жат, химическая стойкость их недостаточна, их кусочки загрязняют фильтры

колонок и капилляры.

В жидкой фазе гораздо меньше скорости диффузии, чем в газовой. По-

этому можно дозировать с остановкой потока − проба не успевает размыться

в дозаторе. На время ввода в дозатор пробы специальный кран перекрывает

поток растворителя. Давление на входе в колонку быстро снижается, через

несколько секунд пробу можно вводить в камеру дозатора обычным микро-

шприцем. Далее дозатор запирается, включается поток растворителя, идет раз-

деление. Давление, которое держит этот кран, до 500–800 атм. Но при останов-

ке потока нарушается равновесие в колонке, что может приводить к появле-

нию «вакантных» дополнительных пиков.

Наибольшее распространение получили петлевые дозаторы. При за-

полнении дозатора под высоким давлением оказываются входы 1,2 и канал

между ними. Входы 3–6, каналы между ними и дозирующая петля оказыва-

ются под атмосферным давлением, что позволяет заполнить петлю с помо-

щью шприца или насоса. При повороте дозатора поток подвижной фазы вы-

тесняет пробу в колонку. Для снижения погрешности петля промывается

5–10-кратным объемом пробы. Если пробы мало, то ее можно ввести в петлю

микрошприцем. Объем петли обычно 5–50 мкл.

Колонки. Успех ВЭЖХ обусловлен не только созданием сорбентов, но

и колонок, учитывающих особенности процесса разделения в ЖХ. Наиболее

важны 2 момента: 1) создание максимально однородного слоя сорбента в ци-

линдрической трубке; 2) сведение к минимуму мертвых объемов в колонке и

соединительных трубках.

Аналитическая колонка представляет собой трубку из нержавеющей

стали, титана или стекла, заполненную сорбентом и закрытую с обеих сторон

фильтрами для предотвращения высыпания сорбента. Фильтры имеют диа-

метр пор 2–5 мкм, что не создает сопротивления потоку.

Для получения высокой эффективности колонок необходимо соблюде-

ние некоторых условий:

1. Внутренняя поверхность колонки должна быть зеркально гладкой;

2. Сорбент должен иметь однородную фракцию (5 + 1 мкм);

3. Переход от большого диаметра колонки к малому диаметру штуцера

должен быть плавный, т.е. нужна конусная выточка в корпусе штуцера.

4. Стенка колонки должна быть достаточно прочной, чтобы выдержать

давление 300–500 атм.

5. Между торцом колонки и фильтром не должно быть мертвого объе-

ма (воздушного зазора), что очень трудно обеспечить в соединениях типа

«свагелок».

Учитывая уникальные свойства сорбентов, сложную конструкцию ко-

лонок, тщательность набивки колонок и их тестирование, стоимость колонок

составляет 1 000–1 500 дол. США (отечественные колонки 1 млн руб.). По-

этому крайне желательно беречь колонки, предохранять от загрязнений с по-

мощью предколонок, заполненных тем же сорбентом, но длиной 30–70 мм.