Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 301

Чистый удерживаемый объем зависит от количества сорбента в колон-

ке, поэтому для точных физико-химических измерений используют понятие

удельного удерживаемого объема (V

). Величина V

– это чистый удержи-

ваемый объем, отнесенный к массе сорбента g в колонке или к площади по-

верхности адсорбента S

при усредненном давлении в хроматографической

колонке и температуре T колонки:

= V'

j/g; V

= V'

j/ S

. (6.10)

Относительные параметры удерживания. Все рассматриваемые

выше параметры удерживания зависят от случайных небольших колебаний

параметров опыта, в частности расхода элюента и температуры термостата

колонки. Для исключения этих влияний используют относительные парамет-

ры удерживания. При расчете относительного параметра удерживания (вре-

мени или объема) берут отношение чистого объема удерживания исследуе-

мого вещества к чистому объему удерживания стандартного соединения:

отн

= V

/ V

; t

отн

= t'

/ t'

. (6.11)

В газовой хроматографии в качестве стандартных соединений исполь-

зуют н-алканы, с параметрами удерживания, близкими к параметрам удержи-

вания исследуемого вещества. В этом случае при случайных колебаниях рас-

хода или температуры абсолютные параметры удерживания будут изменять-

ся, а их отношения – практически нет.

В качестве относительного параметра широко используют индекс Ко-

вача:

I = 100 [(lg t

)/(lg t

n+1

)] + 100n, (6.12)

где t

, t

n+1

– приведенные времена удерживания н-алканов, с числом атомов

углерода в молекуле n и n + 1; t

– приведенное время удерживания иссле-

дуемого соединения. Индекс Ковача – безразмерная величина и может быть

подсчитана с большой точностью, например в капиллярных колонках –

до сотых долей процента. Индексы Ковача в первую очередь применяют для

идентификации неизвестных веществ (проведение качественного анализа).

Изменения индексов Ковача для соединений, отличающихся природой

функциональной группы, используют для оценки межмолекулярных взаимо-

действий. Индексами удерживания определенного набора стандартных ве-

ществ характеризуют полярность неподвижных жидких фаз и адсорбентов.

Параметры хроматографического пика. Выходной сигнал анализи-

руемого соединения имеет форму треугольника или пика, обычно это уча-

сток нулевой линии, на котором возникает сигнал при выходе анализируемо-

го соединения из хроматографической колонки. Нулевая или базовая линия

соответствует участку нулевой концентрации анализируемого соединения.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 302

Запись пика исследуемого соединения вместе с участками нулевой линии до

и после пика называется хроматограммой. Высота пика – это расстояние от

максимума пика до его основания, измеренное параллельно оси отклика де-

тектора. Ширина пика у основания – отрезок основания пика, отсекаемый

двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нис-

ходящей ветвей хроматографического пика. Ширина пика на полувысоте –

отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной параллельно основанию пика

на середине его высоты. Площадь пика – это площадь части хроматограммы,

заключенной между пиком и его основанием.

Важным параметром пика является коэффициент асимметрии, который

применяется для сравнения различных твердых носителей, адсорбентов и

всей системы хроматографа в целом. В идеальных условиях пик по форме

близок к кривой Гаусса, т.е. симметричен. На практике пики по разным при-

чинам в основном несимметричны. Асимметрия пиков ухудшает разделение

и затрудняет количественную обработку.

Асимметричные пики появляются при разделении на неоднородных

сорбентах, когда концентрации анализируемых соединений соответствуют

нелинейным участкам изотермы сорбции. Кроме того, это может быть вызва-

но в некоторых случаях кинетикой сорбции (замедленный процесс десорб-

ции), наличием непродуваемых полостей. Асимметрию пиков оценивают от-

носительно полуширин пиков на половине высоты (рис. 6.7

) отношением от-

резка БВ к АБ либо на 1/10 высоты пика от основания отношением отрезков

ДЕ к ГД. Точнее пользоваться отношением площадей половин пика – отно-

шением заштрихованной части пика к незаштрихованной части (рис. 6.7

Рис. 6.7. Оценка асимметричности пиков

Асимметрия пиков может быть вызвана размыванием полос в колонке.

Обычно выделяют три вида размывания полос:

– размывание, связанное с различной скоростью движения по слою

сорбента зон с разной концентрацией (зависит от формы изотермы сорбции);

– диффузионные размывания (молекулярная диффузия, вихревая диф-

фузия, динамическое размывание, стеночный эффект);

– кинетическое размывание, связанное со скоростью внешнего и внут-

реннего массообмена.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 303

Первый вид размывания наблюдается в том случае, когда концентрация

вещества соответствует нелинейному участку изотермы сорбции. На рис. 6.8

показано размывание полос для различных типов изотерм. В случае нели-

нейности изотермы сорбции линейная скорость перемещения зоны вещества

по слою сорбента

= U/a/c, (6.13)

где U – линейная скорость элюента.

При линейной изотерме сорбции (изотерма Генри) отношение а/с по-

стоянно во всем диапазоне концентраций, поэтому искажение формы зон не

происходит, следовательно, зарегистрированный пик будет симметричным. В

случае нелинейной изотермы сорбции отношение а к с изменяется с концен-

трацией. Для выпуклой изотермы (изотермы Лэнгмюра) с повышением кон-

центрации величина а/с уменьшается, а скорость продвижения участков зон с

большими концентрациями возрастает. В случае вогнутой изотермы

(рис. 6.8, в

), наоборот, скорость продвижения участков зон с меньшими кон-

центрациями будет больше. Это единственный вид размывания, который

можно полностью исключить. Для этого нужно выбрать адсорбент с одно-

родной поверхностью с линейной изотермой для анализируемых концентра-

ций.

а б в

Рис. 6.8. Размывание полос для различных типов изотерм: а – ли-

нейная изотерма; б – изотерма Лэнгмюра (выпуклая изотерма); в –

вогнутая изотерма

Молекулярная диффузия. В хроматографических колонках это размы-

вание рассматривают вдоль колонки, размывание в других направлениях ог-

раничено стенками колонки, поэтому в этом случае часто используют термин

«продольная диффузия».

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 304

Вихревая диффузия имеет место только в набивных колонках и опре-

деляется неоднородностью набивки, разным сопротивлением потоку в раз-

ных частях сечения колонки. Общий поток элюента при попадании в колонку

распадается на отдельные микропотоки между зернами. Если сопротивление

по сечению неоднородно, то там, где сопротивление меньше, микропоток бу-

дет продвигаться быстрее; наоборот, там, где сопротивление больше, микро-

поток будет двигаться медленнее. Это приведет к дополнительному размы-

ванию. Чтобы уменьшить вклад вихревой диффузии, нужно уменьшать раз-

мер зерен, использовать более узкий фракционный состав зерен, исключать

пыль и заполнять колонку с максимальной плотностью.

Динамическое размывание наблюдается в пустых незаполненных

(т.е. капиллярных) колонках, оно связано с профилем скоростей по сечению в

пустых трубках. В центре скорость потока больше, чем у стенок, в результате

происходит искажение формы полосы и имеет место дополнительное размы-

вание.

Стеночный эффект. Плотность набивки на единицу объема около

стенок всегда меньше, а доля пустот больше, чем в центре колонки, особенно

при использовании зерен крупного размера. Это приводит к тому, что ско-

рость элюента около стенок больше, чем в центре колонки. В результате воз-

никает дополнительное размывание, так называемый стеночный эффект.

Стеночный эффект может вносить большой вклад, когда диаметр колонок

значительно больше высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ),

т.е. в препаративной хроматографии. В аналитических колонках небольшого

диаметра (внутренний диаметр 2–4 мм) размывание за счет стеночного эф-

фекта мало и им пренебрегают.

Кинетическое размывание. Задержка массообмена с поверхностью

адсорбента вследствие медленности процессов адсорбции и десорбции также

приводит к размыванию полосы. Задержка при адсорбции приводит к про-

движению компонента вперед, т.е. к размыванию переднего фронта полос, а

задержка при десорбции приводит к размыванию заднего фронта. В том слу-

чае, когда скорости адсорбции и десорбции неодинаковы, такое размывание

может быть несимметричным.

Все перечисленные причины искажения хроматографических пиков

можно описать математическими зависимостями, а их суммарное действие

выразить уравнением Ван-Деемтера:

H = A + B/U + cU, (6.14)

где каждое из трех слагаемых по порядку соответствует ранее описанным

факторам: А – степень неоднородности структуры упакованного в колонку

сорбента; В – коэффициент, учитывающий вклад диффузии данного сорбата

в подвижной и неподвижной фазах; с – константа, определяющая массооб-

мен сорбата между сорбентом и элюентом; U – линейная скорость потока

элюента.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 305

Рис. 6.9. График зависимости H от U

(уравнение Ван-Деемтера)

На графике зависимости Н (высота эквивалентной теоретической та-

релки) от U (рис. 6.9

) можно в общем виде оценить величины А, В и с. Обра-

щает на себя внимание несимметричность ветвей кривой, следовательно,

превышение оптимальной скорости потока ведет к меньшей потере эффек-

тивности, чем работа колонки со скоростью потока ниже оптимальной.

Размывание приводит к уширению пика, что отражается на эффектив-

ности, которая выражается числом теоретических тарелок N и вычисляется

по формуле

N = 5,54(t

/Δt

)

, (6.15)

где t

– время удерживания данного компонента; Δt

– время выхода пика от

половины его высоты на подъеме, до половины высоты на спаде.

Отношение длины колонки к ее эффективности называется высотой

эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) – Н. Обе эти величины имеют

конкретный смысл: для N – число актов сорбции-десорбции, произошедших с

веществом при его движении по колонке; для Н – высота слоя сорбента в ко-

лонке, на котором происходит единичный акт сорбции-десорбции. Следова-

тельно, эффективность прямо пропорциональна длине колонки.

Как уже отмечалось выше, газовая хроматография (ГХ), вид хромато-

графии, в которой подвижной фазой служит газ (пар). Разделение компонен-

тов в ГХ основано на различии скоростей движения и размывания концен-

трационных зон исследуемых веществ, движущихся в потоке газовой фазы

относительно слоя неподвижной фазы, причем эти вещества распределены

между обеими фазами. Газ-носитель (воздух, Не, N

, Аr, СО

и др.) должен

обычно иметь небольшую вязкость и обеспечивать высокую чувствитель-

ность детектирования. Далее приводятся основные характеристики ГХ.

Основные уравнения, используемые в газовой хроматографии, приве-

дены ниже.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 306

Коэффициент распределения – отношение концентраций исследуемо-

го соединения в неподвижной и подвижной фазах в равновесных условиях:

K = C

. (6.16)

Фазовое отношение – это отношение объемов подвижной и непод-

вижной фаз в колонке:

β = V

. (6.17)

Фактор удерживания (фактор емкости) – это отношение приведенных

времен удерживания к мертвому времени:

k = t

. (6.18)

Фактор разделения – величина, характеризующая селективность раз-

делительной системы, равная отношению факторов удерживания или приве-

денных времен удерживания двух соседних пиков на хроматограмме:

2/1

= K

= t

/ t

. (6.19)

Эффективность колонки – характеристика степени размывания полос

в колонке, определяется числом теоретических тарелок N или H,

N = 5,545 (t

0,5

)

, (6.20)

где W

0,5

– ширина пика на половине высоты;

H = L / N, (6.21)

где L – длина колонки; N – безразмерная величина; Н имеет размерность

длины, обычно мм.

Разрешение R

– это отношение расстояния между максимумами ис-

следуемых соседних пиков к сумме их полуширин, выраженных в одних и

тех же единицах измерения:

= 2 (t

– t

) / (W

+ W

). (6.22)

Связь степени разрешения с фактором

разделения α, фактором удержива-

ия k и эффективностью N отражена в соотношении

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 307

= ¼ ((α − 1)/α)(k/(k + 1)) √N . (6.23)

Число тарелок, необходимое для полного разделения при R

= 1:

N = 1/16 (α/ (α − 1))

((k + 1)/k)

, (6.24)

при k > 10 это уравнение можно упростить:

N = 16 (α/ (α−1))

. (6.25)

Влияние экспериментальных параметров на хроматографическое

разделение (на величины α, R и N).

Влияние природы сорбента. Природа сорбента играет решающую роль

в разделении компонентов. Разделение происходит за счет различий межмо-

лекулярных взаимодействий разделяемых молекул с сорбентом. Селектив-

ность разделения определяется природой сорбента. В большинстве случаев

селективность разделения (величина α) уменьшается с повышением темп е-

ратуры.

Длина колонки. Степень разделения пропорциональна квадратному

корню от длины колонки, эффективность прямо пропорциональна длине ко-

лонки.

Сечение колонки. С уменьшением сечения колонки (диаметра) возрас-

тает эффективность и степень разрешения колонки.

Размер зерен сорбента. Размывание хроматографических полос, эф-

фективность в значительной степени зависят от размера зерен сорбента. Вих-

ревая диффузия и внешний массообмен сильно зависят от диаметра зерен

сорбента.

Толщина жидкой пленки на носителе. С увеличением толщины пленки

жидкой фазы (в случае газожидкостной хроматографии) увеличиваются вре-

мена удерживания, затрудняется внутренний массообмен и уменьшается эф-

фективность:

= V

+ KV

, (6.26)

где V

− мертвый объем; K − коэффициент распределения; V

− объем жид-

кой фазы.

Природа газа-носителя. В газовой хроматографии при небольших дав-

лениях инертные газы-носители практически не адсорбируются, особенно в

газожидкостной хроматографии. Поэтому природа газа-носителя практиче-

ски не влияет на селективность разделения, за исключением некоторых слу-

чаев в газоадсорбционной хроматографии при разделении газов на активных

тонкопористых адсорбентах.

Природа газа-носителя влияет на эффективность колонок особенно при

высоких скоростях. Сопротивление колонки, перепад давления в ней опреде-

ляется вязкостью газа-носителя.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 308

Давление газа-носителя. В большинстве случаев на входе в колонку

используют избыточное давление в пределах от 0,1 до 2 атм (в очень редких

случаях выше). Изменение давления в этих пределах практически не влияет

ни на селективность, ни на эффективность разделения. В ряде работ приме-

нялись пониженные давления на выходе из колонки, т.е. вакуумная хромато-

графия для разделения малолетучих высококипящих соединений. Описаны

варианты газовой хроматографии при повышенных давлениях. При повыше-

нии давления возрастает сорбция газа-носителя и уменьшается сорбция раз-

деляемых соединений, особенно если в качестве подвижной фазы использу-

ются пары жидкостей, в частности воды. Парофазная хроматография расши-

ряет аналитические возможности газовой хроматографии.

Размер пробы. Размер введенной пробы анализируемой смеси должен

быть таким, чтобы не вызывать перегрузку колонки. При введении пробы

больше максимально допустимой изменяются времена удерживания. Осо-

бенно важно не перегружать капиллярную колонку, так как ее эффективность

сильно падает с перегрузкой.

Способ дозирования. Пробу можно ввести быстро, в виде узкой полосы

или медленно, в виде разбавленной полосы. Первый способ введения − «м е-

тод поршня» − идеальный, второй − «способ экспоненциального разбавл е-

ния» может приводить к дополнительному размыванию полосы. Способ до-

зирования в реальных случаях занимает промежуточное состояние между

этими крайними случаями. В общем случае ширина дозируемой пробы

должна быть значительно меньше ширины полосы вещества, получаемого на

выходе из колонки.

Чувствительность, линейность, инерционность и стабильность де-

тектора. Назначение детектора − регистрация выходных кривых в виде сиг-

налов (пиков) достаточной амплитуды, необходимых для количественных

измерений. Для точных количественных измерений необходимо:

– чтобы детектор не искажал истинную форму полосы, образующейся

на слое сорбента, другими словами, детектор должен быть малоинерционен,

постоянная времени – небольшой;

– показания детектора были пропорциональны концентрации или ко-

личеству дозируемых веществ, т.е. детектор должен обладать достаточно

широкой областью линейности;

– запись сигнала была устойчивой, не должно быть флуктуации нуле-

вой линии или же монотонного смещения нулевой линии в течение длитель-

ного времени (дрейфа нулевой линии).

Аппаратура для газовой хроматографии

Функциональная схема газового хроматографа. В аналитических хро-

матографах используют проявительный вариант хроматографии, в этом слу-

чае газ-носитель непрерывно продувается через хроматографическую колон-

ку. Расход газа-носителя создается за счет перепада давления на входе и вы-

ходе колонки.

Для создания перепада давления через колонку хроматограф подсоеди-

няют к источнику со сжатым газом (баллонная или лабораторная линия со

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 309

сжатым газом). Через колонку поток газа-носителя должен проходить с по-

стоянной и определенной скоростью, поэтому на входе в колонку на линии

газа-носителя устанавливают регулятор и стабилизатор расхода газа-

носителя и измеритель расхода газа. Если газ-носитель загрязнен нежела-

тельными примесями, то в этом случае устанавливается еще фильтр. Таким

образом, на входе в колонку подключается ряд устройств, часто объединяе-

мых в один блок (блок подготовки газа), назначение которого − установка,

стабилизация, измерение и очистка потока газа-носителя. В современных

хроматографах используются БПГ с электронным заданием и управлением

расходов газов. Перед входом в колонку устанавливается устройство для

ввода анализируемой пробы в колонку − дозатор -испаритель. Обычно анали-

зируемую пробу вводят микрошприцем через самозатекающее термостойкое

резиновое уплотнение в дозаторе, газовые пробы вводят дозирующим шести-

ходовым краном.

Анализируемая проба, введенная в дозатор, захватывается потоком га-

за-носителя (если анализируемая проба − жидкость, то она предварительно

переходит в дозаторе-испарителе в парообразное состояние) и направляется в

хроматографическую колонку. За счет различной сорбируемости компоненты

смеси будут с разной скоростью продвигаться по колонке. Вещества, кото-

рые сорбируются слабо, будут продвигаться по колонке с большей скоростью

и выходить первыми. Сильносорбируемые вещества будут продвигаться по

колонке медленнее. Если выбран достаточно селективный сорбент и подоб-

раны оптимальные условия, то на выходе колонки компоненты смеси будут

полностью разделены. Детектор регистрирует присутствие разделенных ком-

понентов в газе-носителе. Эти сигналы в случае необходимости усиливаются

(усилитель) и регистрируются на шкале вторичного самопишущего прибора

или дисплея ПЭВМ в виде выходных кривых (или пиков). Для обеспечения

стабильного режима работы детектора используется блок питания детектора.

Сорбируемость веществ зависит от температуры. Для исключения влияния

колебания температуры на результаты разделения, колонку помещают в спе-

циальную камеру-термостат, температура которой устанавливается и под-

держивается терморегулятором. В случае необходимости температура ко-

лонки в процессе разделения может изменяться по определенной программе

с помощью блока программирования температуры. Высота или площадь пика

пропорциональны количеству или концентрации компонента в смеси. Пло-

щадь пика может быть измерена с помощью электронного интегратора или

ПЭВМ. Значения площадей пиков могут быть отпечатаны на бумажном но-

сителе.

Таким образом, перед хроматографическим анализом необходимо про-

вести следующие операции на приборе:

– открыть вентиль баллона со сжатым газом и установить по маномет-

ру или специальному измерителю определенный расход газа-носителя;

– включить питание детектора;

– установить необходимую температуру в термостате колонок;

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 310

– включить самопишущий прибор, интегратор или ПЭВМ, после выхо-

да прибора на устойчивый режим микрошприцем отобрать и ввести в доза-

тор-испаритель анализируемую пробу.

Все дальнейшие операции проходят без участия оператора: компонен-

ты пробы разделяются на колонке, регистрируются в детекторе, записывают-

ся на диаграммной ленте вторичного прибора, интегратор или ПЭВМ опре-

деляет площадь пика, а в случае применения ПЭВМ с принтером можно сра-

зу получить полный протокол − хроматограмму с рас печатанной рядом таб-

лицей концентраций разделенных компонентов.

Детекторы для газовой хроматографии. Всего для газовой хромато-

графии предложено более 60 типов детектирующих систем. По общеприня-

той классификации детекторы подразделяются на дифференциальные и инте-

гральные по форме зарегистрированного сигнала. Дифференциальные детек-

торы измеряют мгновенное различие в концентрации вещества в потоке газа-

носителя. Хроматограмма, зарегистрированная таким детектором, представ-

ляет собой ряд пиков, площадь которых пропорциональна количеству разде-

ленных соединений. Интегральные детекторы измеряют суммарные количе-

ства соединений, выходящих из колонки. Хроматограмма в этом случае сту-

пенчатая, высота ступеней пропорциональна количеству соответствующих

соединений.

В зависимости от однократной или многократной регистрации молекул

анализируемых соединений, выделяют концентрационные и потоковые де-

текторы. В концентрационных детекторах сигнал пропорционален концен-

трации соединения в подвижной фазе (элюенте). Здесь имеет место много-

кратная регистрация молекул анализируемых соединений. В потоковых (или

массовых) детекторах сигнал пропорционален количеству пробы компонен-

та, достигаемому ячейки детектора в единицу времени. В этом случае проис-

ходит только однократная регистрация.

По селективности детекторы классифицируются на универсальные, се-

лективные и специфические. В универсальных детекторах регистрируются

все компоненты смеси, выходящие из колонки, за исключением подвижной

фазы. Селективные детекторы регистрируют определенные группы соедине-

ний на выходе из колонки. Специфические детекторы регистрируют только

один компонент или ограниченное число компонентов с подобными химиче-

скими характеристиками.

Основные технические характеристики детекторов:

– чувствительность или предел детектирования;

– линейность (динамический диапазон);

– инерционность (постоянная времени, быстродействие);

– стабильность (уровень шума и дрейфа);

– величина эффективного объема чувствительной ячейки.

Чувствительность концентрационных детекторов А

определяется сле-

дующим выражением:

= S

V F

/ qF, (6.27)