Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 331

Потенциалы ионизации лежат в пределах 3,98 эВ (Fr) − 24,58 эВ (Не),

для большинства органических соединений – 7–11 эВ. Используя моноэнер-

гетические пучки электронов и снижая их энергию до пороговых значений,

можно определять потенциалы ионизации вещества и потенциалы появления

ионов − критическую энергию электронов, при которой в спектре появляют-

ся линии соответствующих осколочных ионов. При ионизации электронным

ударом происходит перераспределение энергии возбуждения по колебатель-

ным степеням свободы иона, прежде чем этот ион распадается. Предполо-

жение о квазиравновесном распределении энергии возбуждения позволяет

полуэмпирическим путем рассчитать масс-спектры некоторых веществ, со-

гласующиеся с экспериментальными данными. Однако во многих случаях,

особенно для длинных молекул, эта теория не подтверждается.

Для двухатомных молекул изменения колебательного состояний объ-

ясняют, исходя из принципа Франка − Кондона. При взаимодействии низко-

энергетических электронов (менее 10 эВ) с веществом могут осуществляться

процессы резонансного захвата электронов молекулами с образованием от-

рицательно заряженных ионов. Масс-спектр электронного удара − высок о-

чувствительный метод анализа, он позволяет анализировать пикомольные

количества вещества, его предпочитают использовать для исследования

структуры соединений. Существуют «библиотеки» масс-спектров, содержа-

щие спектры более 350 000 органических соединений, по которым можно

проводить их идентификацию с применением ЭВМ. Недостатки метода: мо-

лекулярные ионы образуются лишь у 20 % органических соединений; метод

применим только для определения легколетучих термически стабильных со-

единений; в значениях полного ионного тока на ионы с большими значения-

ми m/z, дающими информацию о молекулярной массе и наличии функцио-

нальных групп, приходится меньшая часть; отрицательно заряженные ионы,

имеющие большое значение в структурном анализе, образуются в очень не-

большом количестве и в ограниченном числе органических соединений.

Для решения части проблем применяют метод химической ионизации,

которая осуществляется при столкновении молекул исследуемого вещества с

ионами реагентного газа, в качестве которого используются индивидуальные

вещества или их смеси. Реагентный газ находится в источнике под давлением

65–130 Па, парциальное давление исследуемого вещества – 0,1–0,01 Па. При

бомбардировке такой смеси электронами с энергией 70–500 эВ преимущест-

венно ионизируются молекулы реагентного газа. Образовавшиеся положи-

тельно заряженные ионы в результате ионно-молекулярных столкновений с

неионизированными молекулами реагентного газа преобразуются в реак-

тантные ионы, которые, в свою очередь, взаимодействуют с молекулами ис-

следуемого вещества и ионизируют их, образуя ионы МН

. Наиболее исполь-

зуемые реагентные газы и их характеристики приведены в табл. 6.3. Химиче-

ская ионизация с образованием положительно заряженных ионов может

осуществляться также в результате переноса заряда с реактантных ионов, на-

пример, Не

' , Ar

' , N

', СО

', NO

' на молекулы исследуемого вещества; при

этом образуется молекулярный ион М

. Масс-спектры химической иониза-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 332

ции с реагентными газами Ar и N

напоминают спектры электронного удара.

Метод химической ионизации позволяет оценивать кислотно-основные свой-

ства органических соединений в газовой фазе. Химическая ионизация с обра-

зованием отрицательно заряженных ионов осуществляется в результате

взаимодействия исследуемых молекул с ионами NH

, OH

, CH

(сродство к

протону, соответственно, 1682, 816 и 778 кДж/моль).

Таблица 6.3

Реагентные газы и их характеристики

Газ-реагент

Сродство к протону,

кДж/моль

Реактивный ион

Ион исследуемого

вещества

СН

536

724

, MH

(СН

)

СН

828

(СН

)

858

, MNH

Последние образуются при захвате молекулами NH

, H

O и СН

ОН

электронов с пониженной энергией (около 6 эВ) с последующим распадом

образовавшихся молекулярных ионов М

(диссоциативный захват). Ионы OH

образуются в значительном количестве при электронной бомбарди-

ровке смесей N

O с СН

или (СН

)

СН, Н

О и N

O с СН

ОН. Часто метод хи-

мической ионизации более чувствительный, чем метод ионизации электрон-

ным ударом, т. к. практически все имеющиеся в ионизационной камере элек-

троны используются для ионизации. Метод позволяет анализировать про-

странственные и оптические изомеры. Его важное достоинство – большой

выход протонированных молекулярных ионов МН

при малом выходе оско-

лочных ионов.

Другим методом мягкой ионизации является полевая десорбция. Поле-

вая десорбция – это образование ионов в сильном электростатическом поле

(108 В/см) за счет квантово-механического туннельного эффекта. Полевая

десорбция может происходить при низких температурах эмиттера и не со-

провождаться диссоциацией. В результате образуются в основном молеку-

лярные и квазимолекулярные ионы. Так, например, в масс-спектре электрон-

ного удара ацетилсалициловой кислоты преобладают продукты диссоциа-

тивной ионизации с m/z, равным 140 и 120, а в масс-спектре полевой десорб-

ции есть только два пика: молекулярный с М = 180 и квазимолекулярный с

М = 181, образованный путем присоединения протона к молекуле ацетилса-

лициловой кислоты. Однако несмотря на определенные успехи, этот ме-

тод не получил достаточно широкого применения в связи с его избиратель-

ностью.

Далеко не все молекулы отдают поверхности электрон при низких тем-

пературах. Для ионизации труднолетучих соединений в масс-спектрометрии

применяются искровая и лазерная ионизация вещества. Ионизации подверга-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 333

ется твердое вещество. В искровом источнике испарение и ионизация иссле-

дуемого вещества происходят за счет искрового разряда, зажигающегося ме-

жду электродами при разности потенциалов между ними от 3 до 5 кВ. На од-

ном из электродов находится сам образец. Лазерная ионизация производится

путем импульсного лазерного нагрева твердого вещества, и образующийся

плазменный пучок направляется в масс-анализатор. В этих условиях проис-

ходит полное разрушение химических соединений, и в масс-спектре фикси-

руются лишь атомные ионы и определяется элементный состав образца. По-

хожие результаты можно получить, производя испарение и ионизацию твер-

дого вещества ионами или нейтральными атомами с энергией в несколько

киловольт. Эти методы широко применяются для элементного анализа.

Масс-анализаторы – устройства для пространственного или времен-

ного разделения ионов с различными значениями m/z в магнитном или элек-

трических полях или их комбинациях. Различают статические и динамиче-

ские анализаторы. В статических ионы разделяются в постоянных или прак-

тически не изменяющихся за время их движения через анализатор магнитных

полях. Ионы с различным значениями m/z движутся в таком анализаторе по

разным траекториям и фокусируются последовательно на щель детектора в

результате плавного изменения напряженности электрического и магнитного

полей анализатора. В динамических анализаторах разделение ионов проис-

ходит под воздействием импульсных или радиочастотных электрических по-

лей с периодом изменения, меньшим или равным времени пролета ионов че-

рез масс-анализатор. Ионы с различным значениями m/z, как правило, разде-

ляются по времени пролета определенного расстояния. Давление в анализа-

торах должно быть достаточно низким (~10

-5

Па), чтобы избежать рассеяния

ионов на молекулах остаточных газов.

Основные характеристика масс-анализатора – его разрешающая спо-

собность, или разрешающая сила R. Она характеризует способность анализа-

тора разделять ионы с незначительно отличающимися друг от друга массами

и определяется отношением значения массы иона М к ширине его пика ∆М

(выраженной в атомных единицах массы) на определенном уровне высоты

пика (обычно 50 или 10 %): R = М/∆М. Например, R = 10 000 означает, что

масс-анализатор может разделять ионы с массами 100,00 и 100,01. Наиболее

часто применяют статистические масс-анализаторы с однородным магнит-

ным полем (одинарная фокусировка) или комбинацией электрических и маг-

нитных полей (двойная фокусировка). В масс-анализаторах с одинарной фо-

кусировкой ионный луч, сформированный в источнике ионов, выходит из

щели шириной S

в виде расходящегося ионного пучка и в магнитном поле

разделяется на пучки ионов с различным значениями m/z.

Под действием поля, силовые линии которых направлены перпендику-

лярно направлению движения ионного пучка, ионы двигаются по круговой

траектории с радиусом

r = (2Vm

/zH

)

1/2

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 334

где V – напряжение, ускоряющее ионы; m

– масса иона; z – заряд иона; H –

напряженность магнитного поля.

Ионы с одинаковой кинетической энергией, но с разными массами или

зарядами проходят через анализатор по различным траекториям. Обычно

развертка масс-спектра (регистрация ионов с определенными значениями

m/z) осуществляется изменением Н при постоянном V. Разброс ионов, выле-

тающих из ионного источника, по кинетическим энергиям, а также несовер-

шенство фокусировки по направлениям приводят к уширению ионного пуч-

ка, что сказывается на разрешающей способности. Для статического масс-

анализатора

R = r/(S

+ S

+ δ),

где S

и S

– соответственно, ширина входной и выходной щелей; δ – ушире-

ние пучка в плоскости выходной щели.

Уменьшение размера щелей для увеличения разрешающей способности

прибора трудно осуществимо технически и, кроме того, приводит к очень

малым ионным токам, поэтому обычно конструируют приборы с большим

радиусом траектории ионов (r = 200–300 мм). Разрешающая способность мо-

жет быть повышена также при использовании масс-анализаторов с двойной

фокусировкой. В таких приборах ионный пучок пропускают сначала через

отклоняющее электрическое поле специальной формы, в котором осуществ-

ляется фокусирование пучка по энергиям, а затем через магнитное поле, в

котором ионы фокусируются по направлениям.

Существует более 10 типов динамических масс-анализаторов: квадру-

польный, время-пролетный, циклотронно-резонансный, магнитно-резонансный,

радиочастотный, фарвитрон, омегатрон и др. Наиболее широко применяемый

масс-анализатор – квадрупольный. Этот масс-анализатор представляет собой

квадрупольный конденсатор (рис. 6.16

), к парам параллельных стержней ко-

торого приложены постоянное напряжение V и переменное высокочастотное

cos ωt (ω– частота; t – время); их суммы для каждой пары равны по вели-

чине и противоположны по знаку.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 335

Рис. 6.16. Схема квадрупольного масс-анализатора: 1 – высокочастот-

ный генератор; 2 – генератор постоянного напряжения; 3 – генератор

развертки; 4 и 5 – источник и детектор ионов

Ионы, вылетевшие из ионного источника, движутся в камере анализа-

тора вдоль оси z, параллельной продольным осям стержней, по сложным

объемным спиралевидным траекториям, совершая поперечные колебания

вдоль осей x и у. При фиксированных значениях частоты и амплитуды пере-

менного напряжения ионы с определенными значениями m/z проходят через

квадрупольный конденсатор, у ионов с другими значениями m/z амплитуда

поперечных колебаний достигает такой величины, что они ударяются о

стержни и разряжаются на них. Развертка масс-спектра производится путем

изменения постоянного и переменного напряжения или частоты. Для совре-

менных квадрупольных масс-спектрометров R = 8000. Первый квадруполь-

ный прибор построен В. Паули и X. Штайнведелем (ФРГ, 1953).

Время-пролетный масс-анализатор представляет собой эквипотенци-

альное пространство, в котором дрейфуют ионы, разделяясь по скоростям

движения. Ионы, образующиеся в ионном источнике, очень коротким элек-

трическим импульсом «впрыскиваются» в виде «ионного пакета» через сетку

в анализатор. В процессе движения исходный ионный пакет расслаивается на

пакеты, состоящие из ионов с одинаковыми значениями m/z. Скорость дрей-

фа отслоившихся ионных пакетов и, следовательно, время их пролета через

анализатор длиной L вычисляется по формуле

t = L

, (6.32)

гд

е V – напряжение.

Совокупность таких пакетов, поступающих в детектор, образует масс-

спектр. Для современных приборов R = 5 000–10 000. Первый прибор создан

А. Камероном и Д. Эгтерсом (США, 1948), а в СССР – Н.И. Ионовым (1956).

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 336

Детекторы (приемники) ионов помещают на выходе прибора. Для де-

тектирования используют электрометрические усилители, позволяющие из-

мерять ионные токи до 10

-14

А, электронные умножители и сцинтилляцион-

ные детекторы с фотоумножителем, которые обеспечивают счет отдельных

ионов (ток 10

-19

А) и имеют малую постоянную времени. Обработка данных

на современных приборах идет на компьютере.

Применение масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия широко при-

меняют в различных областях науки и техники. Большие успехи достигнуты

при анализе биологически важных продуктов биотехнологии; показана воз-

можность структурного анализа полисахаридов с молекулярной массой до

15000, белков – до 45 000 и т.д.

Большие принципиальные возможности масс-спектрометрии появля-

ются при сочетании её с другими методами. Сочетание методов значительно

расширяет возможности каждого из них, позволяя получать больше инфор-

мации об объекте исследования. Созданы тандемные масс-спектрометры,

позволяющие двукратное, трехкратное, четырехкратное и т.д. разделение по

массам.

Хромато-масс-спектрометры – одни из наиболее распространенных

современных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жид-

костных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предва-

рительное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и изме-

рение их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому масс-

спектрометры в хромато-масс-спектрометрах большей частью имеют дело не

со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями.

Весьма плодотворным, но далеко не в полной мере реализованным,

оказалось совместное применение лазеров и масс-спектрометрии, которое

может идти по двум – трем направлениям: применение лазеров в масс-

спектрометрии, применение масс-спектрометрии для диагностики и изучения

работы лазеров, масс-спектрометрический контроль работы установок по ла-

зерному разделению изотопов.

Более распространенным и относительно простым является применение

масс-спектрометрии в аналитических целях. Условия ионизации в этих слу-

чаях, как правило, либо остаются неизменными, либо контролируемым обра-

зом переключаются между несколькими значениями. Масс-спектрометрия

как область аналитических измерений требует довольно сложных приборов,

основательного методического и метрологического обеспечения. Она объе-

диняет и согласует длинную цепочку объектов, методов и процессов: объект

исследования; подготовку эталонов, поверочных смесей или образцов срав-

нения; метод отбора и подготовки проб; ионизацию вводимого вещества;

разделение ионов по массам; их детектирование; обработку и представление

полученной информации; её анализ и последующие выводы. Работы по осу-

ществлению этой цепочки требуют использования разнообразных систем и

узлов масс-спектрометров. Эти методы обладают хорошей наглядностью,

большой универсальностью и информативностью, позволяют достигать вы-

сокой чувствительности, разрешающей способности и точности, что спо-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 337

собствует их широкому распространению в различных отраслях науки и

технологии.

Масс-спектрометрия в сочетании с газовой хроматографией активно

используется в СФУ для решения ряда биотехнологических задач.

Рис. 6.17. Масс-спектры основных диеновых углеводородов

изолята Botryococcus озера Шира: а – 29:2; б – 29:3 [3, 22]

Так, например, с помощью масс-спектрометрии были идентифициро-

ваны углеводороды двух представителей Botryococcus – музейного штамма и

изолята озера Шира. На рис. 6.17

представлены масс-спектры основных уг-

леводородов, выделенных из природного штамма Botryococcus braunii.

На данных спектрах четко видны основные молекулярные ионы, характер-

ные для доминирующих диенового и триеного углеводородов С

29:2

29:3

а фрагментация молекул соответствует углеводородным цепям с двумя и

тремя ненасыщенными связями.

Идентификацию ацетиленовых кислот, синтезируемых водным мхом,

проводили также по масс-спектрам. Но положение двойных и тройных свя-

зей в ненасыщенных кислотах определяли после получения диметилоксазо-

линовых производных фракции жирных кислот (ДМОК) и последующего

хроматографирования их в тех же условиях, что и метиловые эфиры жирных

кислот. На рис. 6.18

приведены масс-спектры метиловых эфиров двух ацети-

леновых кислот и их ДМОК.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 338

Рис. 6.18. Масс-спектры метиловых эфиров основных ацетиленовых кислот липидов

Fontinalis antipyretica: а – 6a, 9, 12–18:3 (А1); б – 8a, 11, 14–20:3 (А5) и их димети-

локсазолиновых производных: в – 6a, 9, 12–18:3 (А1); г – 8a, 11, 14–20:3 (А5). Точ-

ками отмечены диагностические фрагменты, молекулярный вес которых отличается

на 10 или 12 ам [12]

Совершенная масс-спектрометрическая техника позволяет изучать по-

лимерные молекулы, синтезируемые бактериями – полигидроксиалканоаты.

На рис. 6.19

приведены две ионные хроматограммы 4- и 5-компонентных по-

лимеров и масс-спектры соответствующих мономеров, из которых состоят

полимеры.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 339

Рис. 6.19. Ионные хроматограммы полимеров, выделенных из биомассы Ralstonia eutrophа В5786 с добавкой геп-

таноата (верх) и добавкой октаноата (зеркально внизу) и масс-спектры соответствующих мономеров – ГБ – β-

гидроксибутират с временем удерживания 7,37; ГВ – β-гидроксивалерат – 8,42; ГГ – β-гидроксигексаноат – 9,48;

ГГеп – β-гидроксигептаноат – 10,75; ГО – β-гидроксиоктаноат – 11,95 [5]

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 340

Масс-спектры β -гидрокси-кислот характеризуются наличием базового

иона 103 m/z . Следовательно, все отмеченные на хроматограмме пики отно-

сятся к β-гидроксикислотам, а их длина определена по их временам удержи-

вания.

Фундаментальные физические законы, передовые научные и инже-

нерные разработки, высокотехнологичные вакуумные системы, самые

лучшие материалы, высочайшее качество их обработки, современнейшая

быстродействующая цифровая и аналоговая электроника и компьютерная

техника, а также программное обеспечение – основы современных масс-

спектрометров.

Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распро-

странением наркотических и психотропных средств, криминалистический и

клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ. С ее

помощью стала возможным разработка новых лекарственных средств, кон-

троль их производства. Она дала существенное продвижение в области ген-

ной инженерии, биохимии и протеомике.

Целый ряд техногенных (т.е. не существующих в природе, а появив-

шихся в результате индустриальной деятельности человека) веществ являют-

ся супертоксикантами (имеющими отравляющее, канцерогенное или вредное

для здоровья человека действие в предельно низких концентрациях). Приме-

ром является хорошо известный диоксин. Существование ядерной энергети-

ки немыслимо без масс-спектрометрии. С ее помощью определяется степень

обогащения расщепляющихся материалов и их чистота. Конечно, и медицина

не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия угле-

родных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфици-

рованности человека Helicobacter pylori и является самым надежным из всех

методов диагностики.

Таким образом, масс-спектрометрия в настоящее время является од-

ним из наиболее информативных, чувствительных и надежных аналитиче-

ских методов. Любая крупная физическая, химическая или биологическая

лаборатория имеет в своем распоряжении масс-спектрометр, ориентирован-

ный на те или иные специфические исследования. Совершенствование тех-

ники позволило создать приборы, способные исследовать молекулы с ог-

ромными массами порядка 100 000 а.е.м. и выше, что, несомненно, откры-

вает просторы для изучения таких сложных биологических молекул, как

белки и нуклеиновые кислоты. Масс-спектрометрия способна обнаруживать

примеси на уровне 0,0001 % и ниже, что актуально при контроле синтеза

высокочистых веществ, например в микроэлектронике и медицинской био-

технологии.