Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 321

Чтобы колонка не «садилась», необходимо производить набивку колонки при

давлении в 3–4 раза выше ее рабочего давления (т.е. 300–400 кгс/см

). Для

хорошей колонки N = 30 000–100 000 т.т./м.

Детекторы. Детектор является преобразователем концентрации ана-

лизируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический

сигнал.

В современном жидкостном хроматографе для детектирования компо-

нентов пробы может быть использовано любое физико-химическое свойство

подвижной фазы (поглощение света, излучение света, электропроводность,

показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней моле-

кул разделяемых соединений (табл. 6.1

). Из существующих 50 физико-

химических методов детектирования в настоящее время активно исполь-

зуется 5–6.

Таблица 6.1

Основные типы детекторов, используемые в ВЭЖК

Детекторы Измеряемые свойства подвижной фазы

Ориентиро-

вочная чувст-

вительность,

мг

Селек-

тивность

1. Фильтровой фо-

тометрический

Оптическая плотность на определенной

длине волны, пропускаемой фильтром

-10

Высокая

2. Спектрофото-

метрический

Оптическая плотность на выбранной

длине волны монохроматора

-9

Высокая

3. Рефрактометри-

ческий

Разность показателей преломления рас-

творителя и раствора с пробой

-6

Низкая

4. Флуорометриче-

ский

Интенсивность излучения молекул про-

бы в элюенте

-11

Очень

высокая

5. Амперометриче-

ский

Ток окисления и восстановления элек-

трохимически активных веществ

-9

–10

-11

Очень

высокая

Кондуктометриче-

ский

Электропроводность пробы в элюенте 10

-6

Низкая

Наибольшей сложностью при конструировании хроматографических

детекторов было сочетание малых объемов ячеек (0,1–10 мкл, менее 10 %

от объема неудерживаемого пика) с высокой чувствительностью (ввиду ма-

лого объема и низкой концентрации пробы). Иллюстрацией достигнутых ус-

пехов является то, что чувствительность фотоколориметров и спектрофото-

метров составляет 10–2 ед. оптической плотности, в то время как чувстви-

тельность фотометрических детекторов – 10–5 ед. оптической плотности,

т.е. в 1 000 раз выше.

Чувствительность − это важнейшая характеристика детектора. Лучше

всего оценивать этот параметр по физической величине. Если определять

чувствительность через двойную амплитуду шума нулевой линии, шум вы-

ражать в физических единицах, то чувствительность фотометрического де-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 322

тектора будет выражаться в единицах оптической плотности, рефрактомет-

рического − в единицах показателя преломления, вольт-амперометрического −

в амперах, кондуктометрического − в сименсах. Для химика, очевидно, инте-

реснее определять чувствительность в минимальном количестве определяе-

мого вещества.

Чувствительность детектора может быть примерно одинаковой ко всем

компонентам пробы (рефрактометр и кондуктометр), а может быть совер-

шенно разной даже для близких соединений. В первом случае говорят о не-

селективном детектировании. Это значит, что измеряется физическое свойст-

во, присущее и пробе и растворителю (показатель преломления, электропро-

водность), их разность. Во втором случае − селективное детектирование. Это

значит, что измеряется физическое свойство, присущее только молекулам

пробы, например, способность флуоресцировать или поглощать свет. Селек-

тивное детектирование, с одной стороны, позволяет повысить чувствитель-

ность определения или исключить те вещества, которые определять не нужно

(предельные углеводороды при определении ароматики), с другой стороны,

допускает возможность не обнаружить нужных нам компонентов (тех же

предельных углеводородов в нефти). Поэтому при исследовании общего со-

става объекта лучше использовать неселективный детектор типа рефракто-

метра, а при определении концентрации отдельных компонентов в сложной

смеси – селективные детекторы.

Подвижные фазы (ПФ). Элюирующая сила и эффективность

Подвижная фаза в ЖХ выполняет двоякую функцию: с одной стороны,

она обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке. Для этого

химические свойства подвижной фазы не играют существенной роли, более

важны их физические свойства: вязкость, летучесть. С другой стороны, под-

вижная фаза в ЖХ играет активную химическую, по существу, роль. Моле-

кулы подвижной фазы взаимодействуют с другими компонентами системы:

молекулами разделяемых веществ и молекулами неподвижной фазы. Поэто-

му вторая и более важная функция подвижной фазы сводится к регулирова-

нию констант равновесия, к регулированию удерживания. Возможности ре-

гулирования удерживания с помощью подвижной фазы необычайно велики.

Нередко заменой одного растворителя на другой, можно изменить коэффи-

циент емкости К' в 1 000–10 000 раз, однако для практической хроматогра-

фии пригоден лишь довольно узкий диапазон величин значение К' − пример-

но 1–20. Слишком малые значения К' непригодны, т.к. в этой области резко

возрастает вероятность взаимного перекрытия пиков. Наоборот, если К'

слишком велико, для разделения требуется слишком много времени, к тому

же увеличивается риск не обнаружить более прочно сорбирующиеся компо-

ненты смеси.

Таким образом, для решения каждой конкретной задачи состав как

подвижной, так и неподвижной фазы должен быть тщательно подобран по

физическим и химическим свойствам ее компонентов. Основными характе-

ристиками подвижных фаз являются их элюирующая сила и селективность.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 323

Один из элюентов способен смыть с колонки лишь слабосвязанные

сорбаты, другие же вызывают десорбцию почти любых молекул. Молекулы

подвижной фазы могут взаимодействовать с молекулами разделяемых ве-

ществ. При этом образуются ассоциаты, которые взаимодействуют с непод-

вижной фазой, сила этого взаимодействия отличается от силы взаимодейст-

вия молекул пробы. В результате сорбция может стать более или менее проч-

ной. С другой стороны, молекулы подвижной фазы могут конкурировать на

поверхности сорбента с молекулами разделяемых соединений, вытесняя по-

следние с активных центров и способствуя смещению равновесия в сторону

десорбции. Для характеристики влияния подвижной фазы на удерживание

используют понятие элюирующей силы.

Элюирующая сила подвижной фазы − это ее свойство вступать в такие

межмолекулярные взаимодействия с компонентами системы, которые спо-

собствуют десорбции разделяемых соединений, более быстрому перемеще-

нию хроматографических зон.

Один подходящий растворитель подобрать трудно. Зато смесь раство-

рителей очень увеличивает гибкость ВЭЖХ. Принцип составления таких

смесей прост. Необходимо взять два индивидуальных растворителя, один из ко-

торых имеет заведомо недостаточную элюирующую силу (А1, А2), другой −

заведомо избыточную (В1). Из этих двух растворителей можно приготовить

множество различных подвижных фаз. Часть из них будет обязательно обла-

дать подходящей элюирующей силой (А2, В1). Сила растворителя является

экспериментально определяемым интегральным параметром. Когда мы гово-

рили, что растворитель имеет подходящую силу, под этим имеется ввиду, что

на данном сорбенте данный сорбат будет иметь приемлемое значение К'.

В то же время ясно, что для разделения уже двух соединений подойдет

не любая из подвижных фаз, имеющих необходимую силу. Вещества могут

иметь хорошее удерживание, но часть пиков перекрывается. В таких случаях

мы говорим, что селективность системы недостаточна. Селективность опре-

деляется селективностью подвижной фазы, что связано со специфическими

взаимодействиями с сорбатами. Селективность, как и элюирующая сила би-

нарной подвижной фазы, определяется в первую очередь природой более

сильного ее компонента. В составе почти любой ПФ можно найти компонент

сорбционно менее активный, выполняющий преимущественно транспортную

функцию (растворитель А), и сорбционно активный, который служит для ре-

гулирования равновесия (растворитель В). Роль одного и того же компонента

в различных подвижных фазах и в зависимости от характера НФ, может быть

различной. Например, в ПФ гексан-хлороформ последнее соединение высту-

пает в качестве растворителя В (активного), а в системе хлороформ − мет а-

нол оно же играет роль растворителя А (транспортного). С целью повышения

селективности часто используют подвижные фазы более сложного состава,

чем бинарные. Во многих случаях это приводит к улучшению разделения.

Растворители. Растворители должны быть очищены от механических

примесей. Примеси вызывают плохую работу клапанов, способствуют износу

плунжеров и уплотнений, забивают входные фильтры колонок. Поэтому рас-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 324

творители нужно фильтровать через материал с порами 0,5 мкм, при отборе

растворителя из резервуара тоже нужен фильтр. Если температура кипения

растворителя низкая (ниже 60 °С) − ацетон, метиленхлорид, пентан, эфир и

т.д., то при всасывании могут образоваться паровые пузыри, препятствую-

щие работе клапанов. У менее летучих растворителей больше вязкость, что

ведет к увеличению сопротивления колонки и к повышению давления на

входе при сохранении расхода. Вязкость более 1,5 сП не желательна.

В зависимости от метода детектирования, к растворителям предъявля-

ются определенные требования (табл. 6.2

). При УФ, работающем при

190–220 нм, применимы вода, ацетонитрил, метанол, этанол, гексан, гептан,

циклогексан и т.д. Поглощают обычно примеси, поэтому надо использовать

не ХЧ, а «для ЖХ» или «для спектроскопии».

Таблица 6.2

Элюотропный ряд − перечень растворителей

в порядке возрастания элюирующей способности

Растворитель

Элюирующая сила на силикагеле

Гексан

0,01

Бензол

0,10

Бутилхлорид

0,20

Хлороформ

0,26

Метиленхлорид

0,32

ИП эфир

0,34

Этилацетат

0,38

Тетрагидрофура

0,44

Ацетонитрил

0,50

Метанол

0,70

Перечень наиболее часто используемых растворителей:

– Вода (лучше бидистиллят, еще лучше деионизованная и очищенная

от органики).

– Спирты (метанол, этанол, изопропанол) − годятся и ХЧ. Для обраще-

но-фазовой хроматографии лучше использовать метанол – у него меньше

всего вязкость (0,54 сп), для НФ − изопропанол, неограниченно смешива ю-

щийся с углеводородами.

– Ацетонитрил − удобен для ОФХ (низкая вязкость 0,34 сп) и хорошая

растворимость.

– Ароматика − поглощает в УФ и токсична.

– Алканы − гексан в НФ (недостаточно растворяет).

Специфические модификаторы ПФ вводятся для изменения свойств

сорбента в лучшую сторону, улучшения разделения. Уксусная кислота

0,5–2,0 % − используется для аммоний-ацетатных буферных растворов, по-

глощает ниже 230 нм. Фосфорная кислота − в ОФХ д ля буферных растворов

или для создания кислой среды. Аммиак − буферы в ОФХ и ИОХ. Алки л-

сульфаты натрия (от С2 до С12) − добавки для перевода в ион -парный ре-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 325

жим, рН 2–5. Величина удерживания оснований растет. Тетра и триалки-

ламмоний − ион -парный вариант определения кислот (с ростом концентра-

ции ТБА растет удерживание анионов). Аммиак − буферы в ОФХ и ИОХ.

Алкилсульфаты натрия (от С2 до С12) − добавки для перевода в ион -парный

режим, рН 2–5.

Выбор условий разделения. Распределение молекул сорбатов между

неподвижной и подвижной фазами определяется, в первую очередь, сравни-

тельным сродством этих молекул к полярным или неполярным растворите-

лям (или поверхностям). Это сродство является главным фактором, влияю-

щим на величины удерживания, выбор неподвижной и подвижной фаз. Так,

при использовании неполярных НФ (обращенно-фазная хроматография)

удерживание ряда сорбатов уменьшается с увеличением их полярности, а

удерживание данного сорбата на данной НФ уменьшается с уменьшением

полярности ПФ, т.е. при добавлении органических растворителей. В проти-

воположность этому, при хроматографии на полярных сорбентах (нормаль-

но-фазная хроматография) удерживание растет с ростом полярности сорбатов

и уменьшением полярности ПФ. То есть «подобное притягивается подоб-

ным».

Ряд правил, которые надо помнить при выборе условий разделения:

1. Адсорбционная хроматографическая система обладает удерживаю-

щей способностью только в тех случаях, когда условная полярность ПФ и

НФ различается в достаточной степени. Величины удерживания тем больше,

чем больше разница в полярности, химической природе фаз.

2. Приемлемые величины удерживания достигаемы только в таких слу-

чаях, когда полярность сорбата является промежуточной по сравнению с по-

лярностью ПФ и НФ. Поэтому основной способ влияния на удерживание на

данном сорбенте − изменение полярности подвижной фазы.

3. При хроматографии на силикагеле удваивание концентрации поляр-

ного компонента в ПФ ведет к уменьшению удерживания в 2,0–2,5 раза. При

хроматографии на алкилсиликагелях (С2, С8, С18) уменьшение концентра-

ции растворителя в 1, 2 раза приводит к 2,0–2,5 кратному уменьшению удер-

живания сильно сорбирующихся веществ (К' > 10) и 1,2–1,5 кратному

уменьшению для слабо сорбирующихся (К' < 2).

4. При хроматографии ионогенных соединений, если рН среды такое,

что допускается одновременное существование сорбата в нейтральной и ио-

низированных формах, степень ионизации в сорбированном и десорбирован-

ном состоянии различна. Следствие − снижение эффективности разделения,

нарушение формы пика. Поэтому надо использовать ПФ на основе буферных

растворов. Без этого трудно добиваться воспроизводимости и качественного

разделения. В общем с понижением рН T

оснований падет, а кислот растет.

Выбор хроматографической системы. Под термином «тип хромато-

графической системы» понимают сочетание: сорбента того или иного хими-

ческого класса, подвижной фазы на основании водных или органических

растворителей, характеризующейся интервалом рН, наличием специфических

добавок кислого, основного или поверхностно-активного характера и т.д. Вы-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 326

бор типа системы основывается в первую очередь по оценке полярности и

кислотно-основных свойств компонентов изучаемой системы. Условная

оценка полярности анализируемых веществ, понимаемой в данном случае

как относительное количество полярных и неполярных структурных фраг-

ментов, представленных в их молекулах, может быть основана на шкале уп-

рощенного критерия гидрофобности Н. Этот критерий рассчитывается

по формуле

Н = n

−4

, (6.30)

где n

− суммарное число атомов углерода и галогенов; n

− число функцио-

нальных групп в молекуле сорбата

Чем больше Н, тем меньше полярность, выше гидрофобность (водоот-

талкивание). При хроматографии неполярных сорбатов средней полярности

очень часто оказываются пригодными как нормально-, так и обращенно-

фазные системы. Для сорбатов с низкой (ароматика) или высокой (органиче-

ские кислоты, спирты) полярностью пригодны ОФХ. Силикагель (НФХ) се-

лективнее при разделении изомеров (о, м, п), а также сорбатов, различаю-

щихся по функциональности (производные бензола, фенола и т.д.). При раз-

делении гомологов (пентан − декан), спиртов , кислот лучше применять ал-

килсиликагели (ОФХ). Если в анализируемой смеси предполагаются компо-

ненты разной химической природы: витамины, лекарства, наркотики, токси-

ны, гормоны начинать разработку метода лучше с ОФХ.

Выбор элюирующей силы и селективности подвижной фазы

При работе в ОФХ выбор элюирующей силы сводится к выбору кон-

центрации органического компонента подвижной фазы. В первичном случае

может быть использован подход на зависимости удерживания от Н. Если из-

вестны принадлежность сорбата к определенному классу веществ и модель

удерживания этого класса в ОФХ, то задача упрощается. Для такого расчета

концентрации элюента есть уравнение:

1, 4 (1, 4 lg )(lg 0,7)

lg 0,7

′

−− +

′

, (6.31)

где K′ − коэффициент емкости при концентрации растворителя С, С

− кон-

центрация растворителя, необходимая для получения желаемого K′

В НФХ для наименее полярных фаз (15 > H > 10) используют гексан:ИПС

(95:5) или гексан:хлороформ (1:1). Для среднеполярных (10 > H > 5) – гексан-

ИПС (80:20) или хлороформ:метанол (95:5). Для полярных (5 > H > 0) – хлоро-

форм:метанол (80:20).

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 327

Масс-спектрометрия − это физико-химический метод измерения отно-

шения массы ионов к их заряду. Приборы, которые используются в этом ме-

тоде, называются масс-спектрометрами или масс-спектрометрическими де-

текторами, они имеют дело с материальным веществом, состоящим, как из-

вестно, из мельчайших частиц − молекул и атомов. Масс-спектрометры уста-

навливают молекулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный состав,

а также пространственную структуру расположения атомов.

Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно

высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества

органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, а также в

биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать

превращения вещества в процессе химической реакции, что существенно для

установления ее механизмов. Значительное отличие масс-спектрометрии от

других аналитических физико-химических методов заключается в том, что

оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излуче-

ние или поглощение энергии молекулами или атомами (например, такие ме-

тоды, как ИК-, УФ-, КР- и ЯМР), а масс-спектрометрия имеет дело с самими

частицами вещества, и в отличие от вышеуказанных методов, является дест-

руктивным методом анализа, т.е. из образующихся при разрушении молеку-

лы ионов исходная молекула регенерироваться не может. Метод масс-

спектрометрии основан на ионизации молекул, разделении ионов в газовой

фазе, которое происходит в зависимости от соотношения их массы и заряда,

и регистрации разделенных ионов.

Для представления масс-спектральных данных часто пользуются гра-

фиками, называемыми масс-спектрами. Масс-спектр − это распределение за-

ряженных частиц по их интенсивностям в соответствии с отношениями их

масс к зарядам. Следовательно, первое, что надо сделать для того, чтобы по-

лучить масс-спектр, перевести нейтральные молекулы и атомы, составляю-

щие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные части-

цы − ионы. Этот процесс называется ионизацией и осуществляется различ-

ными способами.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 328

Рис. 6.14. Масс-спектр диметисульфоксидного производного пальмитолеиновой кисло-

ты из Ralstonia eutropha. Молекулярная масса компонента составляет 362, а идентифи-

цирующими ионами положения двойной связи в молекуле являются 145 и 217 m/z [11]

Следовательно масс-спектрометрия (масс-спектральный анализ) – ме-

тод анализа вещества путем определения массы (чаще отношения массы к

заряду m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации

исследуемого вещества или уже присутствующих в изучаемой смеси. Сово-

купность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представ-

ленная в виде графика или таблицы, называется масс-спектром вещества.

В качестве иллюстрации приведен масс-спектр дисульфидного производного

метилового эфира пальмитолеиновой кислоты, выделенной из бактерий Rals-

tonia eutropha (рис. 6.14

Начало развитию масс-спектрометрии положено опытами Дж. Томсона

(1910), исследовавшего пучки заряженных частиц, разделение которых по

массам производилось с помощью электрического и магнитных полей, а

спектр регистрировался на фотопластинки. Первый масс-спектрометр по-

строен А. Демпстером в 1918 г., а первый масс-спектрограф создал Ф. Астон

в 1919 г.; он же исследовал изотопный состав большого числа элементов.

Первый серийный масс-спектрометр создан А. Ниром в 1940 г.; его работы

положили начало изотопной масс-спектрометрии. Прямое соединение масс-

спектрометра с газо-жидкостным хроматографом (1959) дало возможность

анализировать сложные смеси летучих соединений, а соединение с жидкост-

ным хроматографом с помощью термораспылительного устройства (1983) −

смеси труднолетучих соединений.

Любой масс-спектрометр сочетает комплекс процессов, протекающих в

нем. Так, сначала происходит ионизация молекул с образованием газообраз-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 329

ных ионов, затем идет разделение ионов, регистрация их масс и относитель-

ных количеств.

Каждый ион, который может быть положительным или отрицательным,

характеризуется отношением его массы к заряду (m/z). В соответствии с этим

отношением происходит разделение различных ионов. В масс-спектрометре

исследуемое вещество переводится в газообразное состояние до или в про-

цессе ионизации.

Macс-спектральные приборы. Для разделения ионов исследуемого

вещества по величинам m/z, измерения этих величин и токов разделенных

ионов используют масс-спектральные приборы.

Рис. 6.15. Принципиальная схема масс-спектрометра

Масс-спектральные приборы состоят из системы ввода пробы (система

напуска), ионного источника, разделительного устройства (масс-анализатора),

детектора (приемника ионов), вакуумных насосов, обеспечивающих достаточно

глубокий вакуум во всей вакуумной системе прибора, и системы управления и

обработки данных (рис. 6.15). В современных приборах обработка данных и

контроль задаваемых параметров производятся компьютером.

Превращения нейтрального атома или молекулы в заряженную частицу

путем удаления из них или присоединения к ним одного или нескольких

электронов называется ионизацией. Ионный источник предназначен для об-

разования газообразных ионов исследуемого вещества и формирования ион-

ного пучка, который направляется далее в масс-анализатор. Наиболее уни-

версальный метод ионизации вещества − электронный удар. Впервые этот

метод осуществлен П. Ленардом (1902). Современные источники такого типа

построены по принципу источника А. Нира.

Для ионизации молекул обычно используют электроны с энергиями

70–100 эВ, которые движутся со скоростью 10

см/с и проходят путь, равный

диаметру молекулы органического соединения за 10

-16

с. Этого времени дос-

таточно для удаления электрона из молекулы вещества и образования моле-

кулярного иона − положительно заряженного ион -радикала М

, имеющего

энергию 2–8 эВ.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 330

Молекулярные ионы в зависимости от избытка внутренней энергии на-

ходятся в различных возбужденных состояниях, что обуславливает различ-

ное время их фрагментации или диссоциации. Обычно такой процесс проте-

кает за время 10

-13

с. При этом молекулярные ионы превращаются в осколоч-

ные (фрагментные) ионы с более низкой электронной энергией. Фрагмент-

ные ионы, которые обладают еще достаточным избытком колебательной

энергии, претерпевают дальнейший распад. Этот процесс продолжается до

тех пора, пока не будет израсходован весь избыток внутренней энергии, при-

сущий родоначальному молекулярному иону.

Образование фрагментных ионов характеризуется энергией (потенциа-

лом) появления, т.е. минимальной энергией электронов, при которой начина-

ет детектироваться соответствующий ион. Нетрудно представить, что энер-

гия появления молекулярного иона есть не что иное, как энергия ионизации

молекулы.

При распаде молекулярного иона, который является нечетно-

электронной частицей, образуются фрагментный ион и нейтральная частица,

которая может быть как четно-электронной, так и нечетно-электронной, т.е.

радикалом типа H

•

и т.д. При отщеплении нейтральной частицы возни-

кает новый нечетно-электронный ион-радикал:

+•

→ [Ф

]

+•

+ N,

а при выбросе радикала − четно-электронный ион:

+•

→ [Ф

]

+ N

•

Дальнейшие направления распада этих ионов различны. Нечетно-

электронный ион [Ф

]

+•

способен далее подобно М

+•

элиминировать либо

нейтральную четно-электронную молекулу, либо радикал, в то время как ка-

тион [Ф

]

в подавляющем большинстве случаев может терять лишь четно-

электронную молекулу (четно-электронное правило).

Таким образом, процессы фрагментации молекулярных ионов характе-

ризуются значительным числом последовательных и конкурирующих на-

правлений распада, вероятность которых определяется природой молекулы и

элементов, ее составляющих, энергией разрывающихся связей, внутренней

энергией образующихся ионов, стабильностью ионов и элиминирующихся

нейтральных частиц, а также временным интервалом между образованием

иона и его детектированием. Ионы с минимальным запасом энергии доста-

точно устойчивы и достигают приемника. Ионы с большим запасом внутрен-

ней энергии распадаются на пути движения на ионы с меньшей молекуляр-

ной массой (осколочные ионы), характерные для вещества определенного

строения. Для ионизации молекул энергия электронного пучка должна пре-

вышать некоторую критическую для вещества величину, называемую потен-

циалом ионизации.