Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 281

имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому

после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных

вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают

прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток,

имеющих высокую хлебопекарную активность. Использование метода фло-

тирования обеспечивает надежность непрерывного выделения дрожжей из

культуральной жидкости, сокращает число сепараторов и, соответственно,

эксплутационные расходы.

Фильтрация. В этом методе используется принцип задержки биомас-

сы на пористой фильтрующей перегородке. В настоящее время используются

разные фильтры: барабанные, дисковые, ленточные, тарелочные, карусель-

ные вакуум-фильтры, фильтры-прессы различной конструкции, мембранные

фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток, однако при этом

эффективность фильтрации практически не снижается, так как по мере про-

хождения жидкости диаметр капиллярных каналов сужается из-за прилипа-

ния частиц к стенкам. По мере утолщения слоя биомассы на фильтре ско-

рость протока жидкости падает. Для фильтров непрерывного действия, рас-

считанных на длительное действие, предусматривают системы автоматиче-

ского удаления слоя биомассы, забивающего поры. Биомассу сдувают с по-

верхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. Та-

кой способ удаления биомассы характерен для барабанного вакуум-фильтра.

Существуют также фильтры, предназначенные для однократного или

многократного периодического использования. Среди них выделяют мем-

бранные фильтры, через которые возможно проводить фильтрацию очень

разбавленных растворов. Однако проблемой использования таких фильтров

является их закупорка клетками, белками, коллоидными частицами. Приемы

сдувания или срезания для этих фильтров не приемлемы, так как они быстро

разрушаются. Одним из путей преодоления этих проблем является покрытие

мембран гидрофильным слоем. В настоящее время создана целая отрасль по

производству мембранных фильтров и существуют огромное количество

фирм, которые поставляют фильтры для всех задач биотехнологии.

Технологические приемы, используемые для отделения клеток от сре-

ды, зависят от природы продуцента. Например, дрожжи рода Candida, слу-

жащие источником кормового белка, плохо флотируются и фильтруются.

Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты

белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в

несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все

компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному

приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных

препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной

форме (от выделения его из культуральной жидкости отказались в принци-

пе): содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих

жизнеспособность конечного продукта.

Физическое осаждение. При выделении и очистке метаболитов био-

масса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осажда-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 282

ется добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих

клетки или мицелий на дно.

Центрифугирование. Некоторые виды биомассы отделяют центрифу-

гированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием цен-

тробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая)

и культуральная жидкость. Центрифугирование требует более дорогостояще-

го оборудования, чем вышеперечисленные методы сепарации. Поэтому оно

оправдывает себя, если, во-первых, суспензия фильтруется медленно, во-

вторых, необходимо максимально освободить культуральную жидкость от

частиц, в-третьих, необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в

условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодический режим. Цен-

трифугирование и фильтрация могут проходить одновременно, этот процесс

реализован в фильтрационных центрифугах. Наиболее перспективны для

осаждения – центрифуги-сепараторы, в которых биомасса осаждается на

стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой

вставки.

Если продукт содержится в культуральной жидкости, то эта жидкость

далее подвергается переработке. В производствах, где целевым продуктом

являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается

лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и сни-

зить образование сточных вод. Культуральная жидкость перерабатывается

путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и

ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным

размером пор.

Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток про-

дуцента вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция

биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или

комбинированные методы.

К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразву-

ком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами,

продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание заморо-

женной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замора-

живание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким сниже-

нием давления). Физические способы разрушения клеток более экономич-

ные, чем химические и химико-ферментативные. В то же время этим спосо-

бам дезинтеграции клеток присуща неизбирательность: обработка может

влиять на качество получаемого продукта.

Химические и химико-ферментативные методы более избирательны.

Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками,

ферментами. Клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом

в присутствии этилендиаминтерауксусной кислоты или других детергентов,

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 283

клетки дрожжей – зимолиазой улитки или ферментами грибов, актиномице-

тов. Можно использовать автолиз клеток при лимитировании по определен-

ному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагом.

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок.

Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. Од-

нако применяют более высокоскоростное центрифугирование или фильтры с

меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехно-

логических процессов клеточные стенки отбрасывают как балласт, но воз-

можно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целе-

вого продукта.

Выделение целевого продукта из культуральной жидкость или из гомо-

гената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или

адсорбции.

Осаждение может быть физическое (нагревание, охлаждение, разбав-

ление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неор-

ганических веществ). Осаждение органическими растворителями основано

на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых

растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его раз-

рушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ долж-

ны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей

используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах

растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример:

50 %-й этанол осаждает 80 % протеазы и 3-5 % амилазы, 70 %-й спирт осаж-

дает 98 % амилазы.

Высаливание – механизм тот же, что и при действии органических ве-

ществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как

наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют

сульфаты натрия, магния и фосфат калия.

Экстракция – процесс избирательного извлечения одного или не-

скольких растворимых компонентов из твердых тел и растворов с помощью

жидкого растворителя – экстрагента. Различают твердо-жидкостную и жид-

ко-жидкостную типы экстракции. При твердо-жидкофазной экстракции ве-

щество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидко-жидкофазной – из

одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки пе-

реходит в бензин). Жидко-жидкостную экстракцию органическими раствори-

телями часто применяют для извлечения из культуральной среды антибиоти-

ков, витаминов, каротиноидов, липидов. Витамин В

экстрагируют фенолом,

высокоспецифичным экстрагентом является бензиловый спирт. Такие фос-

фолипиды как фосфатидилэтанол и фосфатидилхолин извлекаются хлоро-

формом.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 284

Эффективность экстракции может быть повышена за счет повторной

экстракции свежим экстрагентом, выбором оптимального растворителя, на-

греванием экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкости, пониже-

нием давления в аппарате для экстракции. Экстракция хлороформом исполь-

зуется при выделении из бактериальной биомассы полигидроксиалканоатов

(ПГА). Существует несколько подходов для извлечения ПГА из клеток. Сы-

рую биомассу, собранную центрифугированием, заливают 20 объемами хло-

роформа и оставляют на 15–20 ч в ёмкости при комнатной температуре при

периодическом перемешивании. Далее разделяют биомассу и хлороформ с

полимером в делительной воронке, нижний слой хлороформа собирают, а ос-

таток биомассы еще трижды экстрагируют хлороформом для усиления пол-

ноты экстракции. Второй подход, используемый в лабораторных условиях:

предварительно лиофилизированная биомасса закладывается в патрон аппа-

рата «Сокслет» и полимер экстрагируется хлороформом в течение несколь-

ких часов. В колбу заливается экстрагент, обычно органический раствори-

тель. При нагревании колбы растворитель испаряется, его пары поднимаются

вверх, конденсируются на холодильнике, и растворитель попадает в патрон с

пробой. После заполнения патрона до определенного объема растворитель с

экстрагируемым веществом сливается в колбу, и процесс многократно по-

вторяется.

Во многих случаях процесс нагревания может быть губительным для

целевого продукта. Для предотвращения этого используется криоэкстракция,

которая осуществляется растворителями, кипящими при низких температу-

рах и находящимися при комнатной температуре в газообразном состоянии.

Для экстракции неполярных соединений используют жидкий пропан или бу-

тан. При последующем осторожном нагревании до 0 °С растворитель улету-

чивается, и остается продукт в чистом виде.

Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент –

твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональ-

ные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсор-

бента используют иониты на основе целлюлозы: катионит – карбоксиметил-

целлюлоза (КМЦ); анионит – диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также

сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному ме-

ханизму.

Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.

Наибольшее распространение получила хроматография. Хроматография (от

греч. chroma, родительный падеж chromatos – цвет, краска и -графия) – фи-

зико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распре-

делении их компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной

(элюент), протекающей через неподвижную. По технике выполнения хрома-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 285

тографию подразделяют на колоночную, когда разделение веществ прово-

дится в специальных колонках, и плоскостную: тонкослойную и бумажную.

В тонкослойной хроматографии разделение проводится в тонком слое сор-

бента, в бумажной – на специальной бумаге.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее

простых и эффективных экспресс-методов разделения и анализа веществ, не

требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой

избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения).

Этим методом можно определить 10–20 мкг вещества с точностью до 5–7 %.

В зависимости от природы подвижной фазы (ПФ), тонкослойная хромато-

графия может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко

применим в ТСХ первый вариант разделения.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким

слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или

пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса

(иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматографи-

рования могут использоваться готовые пластинки, выпускаемые промыш-

ленностью, размером 5х15 или 20х20 см. На расстоянии 2 см от края пла-

стинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца на-

носят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3–5 мм). После испа-

рения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно

которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образова-

ния слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств ана-

лизируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пестици-

дов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто применяют

смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографи-

ровании аминокислот используют смесь н-бутанола с уксусной кислотой и

водой, при анализе неорганических ионов – водные буферные растворы, соз-

дающие постоянное значение рН. При хроматографировании растворитель

движется снизу вверх (восходящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной

скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространствен-

ному разделению. После окончания хроматографического процесса пластин-

ку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя (обычно око-

ло 10 см) и высушивают.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине

после разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными

способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко про-

являются коричневые пятна для органических соединений с непредельными

связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реаген-

том, дающим с компонентами пробы окрашенные соединения. В состав на-

несенного слоя в готовые пластины часто вводят люминофор. При облучении

такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разде-

ленные компоненты пробы видны в виде темных пятен. Вещества, имеющие

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 286

собственную флуоресценцию, также обнаруживают в УФ-свете (например,

пестициды).

Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характе-

ру окраски пятен, параметру удерживания R

и с помощью стандартных ве-

ществ (свидетелей). Величина R

рассчитывается из экспериментальных дан-

ных по уравнению

= а/б, (6.1)

где а – расстояние от стартовой линии до центра пятна; б – расстояние, прой-

денное за это же время растворителем.

При стандартных условиях величина R

является постоянной величи-

ной, характерной для данного соединения. Но практика показывает, насколь-

ко трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспро-

изводимость значений R

. На величину R

влияет качество и активность сор-

бента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факто-

ры, не всегда поддающиеся достаточному контролю. Поэтому наряду с вели-

чиной R

идентификацию проводят по «свидетелю». Стандартное вещество

(свидетель), наличие которого предполагают в анализируемой смеси, наносят

на линию стандарта рядом с исследуемой пробой. Таким образом, стандарт-

ное вещество хроматографируется в тех же условиях. После хроматографи-

рования и детекции пятен сравнивают величины R

определяемого вещества

и «свидетеля». Количественное определение в ТХС может быть проведено

непосредственно на пластинке или после удаления веществ с пластинки. При

непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным спосо-

бом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по зара-

нее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Широкое распространение получил способ экстрагирования компонен-

тов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на

хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После полу-

чения хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта,

вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его

экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализи-

руют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 287

Рис. 6.1. ТСХ липидов музейного штамма Botryococcus braunii Kutz

No LB 807/1 Droop 1950 H-252 (слева) и изолята Botryococcus озера Шира

(справа). Система растворителей: гексан-диэтиловый эфир-уксусная ки-

слота (85:15:1 по объему). С – стандарт, 0 – начало роста, I – 6 суток, II –

13 суток, III – 24 сутки, IV – 38 сутки. 1 – полярные липиды, 2 – диациг-

лицерины, 3 – стерины, 4 – свободные жирные кислоты, 6 – триацилгли-

церины, 7 – МЭЖК в стандарте, 8 – эфиры стеринов, 9 – углеводороды,

X и Х1 – неидентифицированные фракции [3, 22]

В качестве иллюстрации метода приведена тонкослойная хромато-

грамма липидов углеводородсинтезирующих штаммов Botryococcus braunii

Kutz, иллюстрирующая изменения состава липидов в процессе роста водо-

росли и изолята озера Шира (рис. 6.1

Хроматография на бумаге. По механизму разделения различают рас-

пределительную, адсорбционную, осадочную и другие виды бумажной хро-

матографии (БХ). В распределительной жидкость-жидкостной хроматогра-

фии бумага, приготовленная из специальных сортов хлопка, выполняет роль

носителя неподвижной жидкой фазы (НФ), в качестве которой часто высту-

пает вода, адсорбированная парами бумаги. В таком случае гидрофильная

бумага используется для нормально-фазовой хроматографии.

Растворителями – подвижной фазой (ПФ) - являются спирты (метанол,

этанол, н-пропанол, бутанол), простые эфиры (этиловый, метиловый), кетоны

(ацетон, ацетил-ацетон), эфиры органических кислот (метилацетат, этилаце-

тат), пиридин, хлороформ. Чаще используются смеси растворителей.

Для разделения некоторых органических веществ используют метод обра-

щенных фаз.

В этом методе для придания бумаге гидрофобного характера ее им-

прегнируют (пропитывают) нафталином, парафином, раствором каучука, си-

ликоном и др. Такая бумага служит носителем для неполярных растворите-

лей в качестве НФ. В качестве ПФ применяют смеси кислот с низшими спир-

тами. Обращенно-фазовая бумажная хроматография используется, например,

для разделения и идентификации полиненасыщенных жирных кислот при

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 288

изучении состава липидов, выделенных из животных и растительных тканей.

Бумагу пропитывают 5 %-м раствором силикона, в качестве ПФ используют

85 %-й раствор уксусной кислоты. Разделение веществ в распределительной

БХ осуществляется благодаря различию в скоростях движения компонентов

при многократном повторении актов экстракции и сорбции. Скорость пере-

мещения компонентов зависит от их коэффициентов распределения (как и в

методе экстракции).

По направлению движения элюента (ПФ) различают восходящую, нис-

ходящую и радиальную (круговую) хроматографию. Если элюент движется

по бумаге вверх, метод называют восходящей бумажной хроматографией;

при его движении сверху вниз – нисходящей бумажной хроматографией.

Очень быстро можно осуществить хроматографический анализ методом ра-

диальной бумажной хроматографии, в котором используется бумажный круг

с фитилем, опущенным в элюент. Иногда при сложном составе пробы не уда-

ется разделить ее компоненты с помощью одного растворителя. Тогда при-

меняют двумерную хроматографию. В угол квадратного листа хроматогра-

фической бумаги наносят раствор пробы и хроматографируют сначала в од-

ном элюенте, затем, повернув хроматограмму на 90 град, – в другом. Первый

элюент производит предварительное разделение компонентов пробы, второй

– окончательное.

Для проведения хроматографии на бумаге используют стеклянные гер-

метизированные камеры. Внутри камеры в верхней (нисходящий вариант)

или нижней ее части (восходящий вариант) помещают сосуд для подвижной

фазы (лодочку). Радиальную хроматографию можно осуществить в чашке

Петри. Детекцию зон, идентификацию и количественное определение в БХ

проводят так же, как и в методе тонкослойной хроматографии. Методом рас-

пределительной жидкостной бумажной хроматографии успешно анализиру-

ют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси амино-

кислот и других органических кислот, пептидов, пестицидов, фенолов, кра-

сителей, синтетических поверхностно-активных веществ.

Колоночная хроматография. В этом случае смесь молекул в растворе

пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В ре-

зультате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через

колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определен-

ной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями.

В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различ-

ных типов, используя которые, можно делить продукты согласно их заряду

(ионообменная хроматография), гидрофобности (гидрофобная хроматогра-

фия), размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связы-

ваться различными химическими группами (аффинная хроматография).

Ионообменная хроматография. Ионообменная хроматография (ИХ)

является разновидностью жидкостной хроматографии и в аппаратурном

оформлении ничем не отличается от других видов жидкостной колоночной

хроматографии.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 289

В основе ионообменной хроматографии лежит процесс обмена между

ионами анализируемого раствора (ПФ) и подвижными ионами того же знака

ионообменника (НФ) (рис. 6.2).

Разделяемая смесь

Рис. 6.2. Катионообменная хроматография (схематизировано: изображено поверхностное

электростатическое взаимодействие с частицами): а, б – две стадии процесса

В качестве ионообменников или ионитов обычно используют синтети-

ческие полимерные вещества, называемые ионообменными смолами. Они

состоят из матрицы и активных групп, содержащих подвижные ионы. В за-

висимости от знака обмениваемых ионов различают катиониты и аниониты.

Катиониты содержат кислотные группы различной силы, такие как сульфо-

группы, карбоксильные, оксифенильные. Аниониты имеют в своем составе

основные группы, например алифатические или ароматические аминогруппы

различной степени замещенности (вплоть до четвертичных). Иониты могут

находиться в Н-форме и ОН-форме, а также в солевой форме. В Н-форме ка-

тиониты и ОН-форме аниониты содержат способные к обмену ионы водо-

рода и гидроксила соответственно, в солевых формах ионы водорода заме-

нены катионами металла, анионы гидроксила – анионами кислот. В зависи-

мости от силы кислотных и основных групп в ионитах различают сильно-

кислотные (R-SO

Н) и слабокислотные (R-СООН) катиониты; сильнооснов-

ные (R-N(СН

)

ОН) и слабоосновные (R-NН

ОН). Сильнокислотные и силь-

ноосновные иониты способны к ионному обмену в широком диапазоне рН.

Процесс ионного обмена протекает стехиометрично. Например:

R-SO

H + Na

= R-SO

Na + H

R(NН

)

ОН + Сl

= R(NН

)

Сl + ОН

Смесь с выче-

том адсорбиро-

ванных ионов

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 290

Это ионообменное равновесие характеризуется константой ионного

обмена:

++ ++

3 33

H Na H Na

3 33

[H ][RSO Na] [OH ][R(NH ) Cl]

; .

[Na ][RSO H] [Cl ][R(NH ) OH]

+−

= =

(6.2)

На основании констант ионного обмена построены ряды сродства ио-

нов к данному иониту, позволяющие предвидеть возможности ионообмен-

ных разделений. В зависимости от сродства к фиксированным ионам непод-

вижной фазы разделяемые ионы перемещаются вдоль хроматографической

колонки с различными скоростями; чем выше сродство, тем больше объем

удерживания компонента. При разделении органических кислот и оснований

важную роль играет степень их диссоциации. Для двух веществ, имеющих

разные константы обмена, рассчитывают фактор разделения или коэффици-

ент распределения, который характеризует селективность ионита:

/ b

= K

(6.3)

где f

a/b

– фактор разделения; K

, K

– константы ионного обмена веществ А и В.

Чем больше фактор разделения, тем сильнее ионит удерживает вещество А.

Например, константы ионного обмена солей железа (III) и кобальта (II) на

сильнокислотном катионите марки КУ-2 составляют 3726 и 286 соответст-

венно, тогда f

= 13. Таким образом, можно сделать вывод о том, что

катионит КУ-2 более селективен к ионам железа (III).

Важной количественной характеристикой ионитов является их обмен-

ная емкость. Полная обменная емкость определяется количеством эквивален-

тов ионов, обмениваемых одним граммом сухого ионита. Чем больше обмен-

ная емкость, тем большую пробу можно ввести в колонку с ионитом. При

подготовке ионитов к работе их переводят в соответствующую форму. Так,

для перевода катионита в Н-форму через колонку с набухшим ионитом про-

пускают раствор сильной кислоты, избыток которой отмывают водой. Затем

медленно пропускают раствор смеси ионов. Каждый катион задерживается

на ионите согласно своей сорбируемости. Далее пропускают подходящий элю-

ент. Например, катионы щелочных металлов легко элюируются 0,1 М HCl.

При этом ионы водорода обмениваются на сорбированные катионы, которые

вместе с раствором выходят из колонки в соответствии с константами ионно-

го обмена. На выходе из колонки фракции собирают в отдельные сосуды и

определяют содержание любым подходящим методом.

Иониты применяются для деионизации (обессоливания) воды, очистки

сахарных сиропов от минеральных солей; в препаративной химии – для кон-

центрирования растворов; для определения ионов железа (III), меди и свинца

в вине; кальция и магния в молоке; различных металлов в биологических

жидкостях. Кроме того, ионный обмен используют для перевода ионов в

форму, удобную для количественного определения. Ионообменную хромато-

графию применяют для разделения фенолов, карбоновых кислот, аминокис-

лот, аминосахаров, пуриновых, пиримидиновых и других оснований. Часто