В
ПОМОЩЬ
МИКРОБИОЛОГУ
На
вопросы
отвечает
д-р
техн.
наук,
вед. науч.
сотр.,
руководитель
ИЛЦ
«Биотест"
Н.В.Нефедова
Что
собой
представляет
метод
полимеразной
цепной
реакции
и
можно
ли
его
использовать
для
определения
микробиологических
показателей
безопасности
молочного
сырья
и
готовых
продуктов?
Метод
полимеразной
цепной
реакции
является
одним
из
самых
современных
методов
молекулярной
биологии.
Он
основан
на
многократном
избирательном
копировании
определенного
участка
ДНК
при
помощи
ферментов
в
искусственных
условиях
in vitro.
При
этом происходит
копи
рование
только
того
участка
,
который
удовлетворяет
задан
ным
условиям
,
и
только
в
том
случае,
если
он
присутству
ет
в
исследуемом
образце
.
ПЦР-диагностика
позволяет
проводить
как
качественный
,
так
и
количественный
учет
микроорганизмов.
Теоретически
методом
ПЦР-диагностики
можно
обнару
жить
даже
единственную
копию
исследуемой
ДНК
в
образ
це
,
что
позволяет
говорить
об
отсутствии
у
него
предела
чувствительности
.
Кроме
этого
,
исследование
методом
ПЦР
имеет
абсолютную
специфичность,
т
.
е.
если
ПЦР
про
веде
на
правильно
,
то
ложноположительных
результатов
быть
не
может.
Полимеразная
цепная
реакция
в
реальном
времени
позволяет
идентифицировать
патогенные
бактерии,
выде
ленные
из
пищевых
продуктов
и
продовольственного
сырья
.
Например,
бактерий
,
подозрительных
на
принад
лежность
к
роду
Sa/monella, Campylobacter, E.coli,
Entero-
bacter sakazakii,
дрожжей
и
плесеней.
Метод
позволяет
оперативно
получать
точные
и
надежные
результаты
с
целью
ускоренного
подтверждения
принадлежности
выде
ленных
микробиологическими
методами
культур
к
бакте
риям
соответствующего
рода
,
значительно
снижать
уро
вень
возможных
ошибок
,
зависящих
от
лиц,
выполняющих
анали
з.
ПЦР-анализаторы
выявляют
микроорганизмы
в
продук
тах
питания
и
пробах
окружающей
среды
в
автоматиче
ском
режиме
«
реального
времени
>>
.
Благодаря
получению
миллиона
копий
целевого
фрагмента
ДНК
,
если
таковой
присутствует
в
реакционной
среде
,
можно
проводить
скри-
Ведущая
руб
рики
канд.
техн.
наук
Н.В.АНАНЬЕВА
нинг
исследуемых
проб,
в
результате
которого
пользова
тель
получает
однозначные
ответы
,
не
требующие
интер
претации
специалиста
,
типа
''
да
>>
или
«
НеТ
>>
в
течение
2-5
ч
после
начала
анализа.
Обнаружение
специфических
целевых
нуклеотидных
последовательностей
ДНК
,
присутствующих
в
микроорга
низмах-мишенях,
может
происходить
с
помощью
интер
калирующих
красителей
или
зондов.
В
ходе
ПЦР
краси
тель
интеркалирует
(включается)
в
двухцепочечную
ДНК
и
флуоресцирует
на
свету.
По
завершении
амплификации
(копирования
ДНК-участков)
температура
реакционной
смеси
повышается
до
значения
,
при
котором
амплифици
рованные
цепи
ДНК
денатурируют
,
краситель
высвобож
дается
,
интенсивность
флуоресценции
снижается
.
Эти
изменения
флуоресценции
наносятся
на
график
зависи
мости
от
температуры
для
построения
кривой
плавления,
которая
интерпретируется
программным
обеспечением
системы
микробиологического
анализатора.
В
случае
применения
зондов
используют
олигонуклео
тиды,
ковалентно
связанные
с
красителем
с
одной
сторо
ны
и
гасителем
флуоресценции,
сильно
ослабляющим
сигнал
,
с
другой
стороны.
В
ходе
ПЦР
зонд
разрушается
,
флуорофор
и
гаситель
разобщаются,
вследствие
чего
флуоресцентный
сигнал
усиливается
пропорционально
числу
накапливаемых
копий
.
Данные
изменения
флуорес
ценции
фиксируются
на
графике
кривой
накопления
про
дукта
ПЦР
.
Флуоресценция
измеряется
анализатором
автоматически
с
помощью
специфичных
к
красителям
светофильтров
в
оптической
системе
прибора
.
Сравнение
интенсивности
регистрируемого
флуоресцентного
сигна
ла
на
кривой
контрольных
препаратов
и
исследуемого
образца
бактериальной
культуры
позволяет
в
реальном
времени
определить
присутствие
в
нем
матричной
ДНК
микроорганизмов-мишеней
.
Основные
преимущества
ПЦР-анализаторов:
•
высокая
скорость
и
достоверность
результатов
обнару
жения
микроорганизмов
в
сырье,
готовы
х
продуктах
и
смывах
с
технологического
оборудования
и
рабочих
поверхностей
;
•
высокая
чувствительность
анализа
(1
О
копий
ДНК),
что
превышает
чувствительность
классических
микробиоло
гических
методов
на
несколько
порядков
;
•
возможность
определения
источников
заражения
,
отеле
живанив
их
на
уровне
штаммов
для
контроля
над
процес
сом
производства
и
окружающей
средой
;
•
возможность
дифференцирования
типов
патогенны
х
микроорганизмов
для
получения
дополнительно
й
инфор
мации
.
Воnросы
по
интересующим
вас
темам
присылайте
по
адресу:
107140,
Москва,
3-й
Красносельский
пер
. ,
д.
21,
стр.
2
(495)640-50-51,{495)640-50-52,{495)640-50-53,(499)264-87-82,{499)264-03-44
E-mail:
info@moloprom.ru