Кравців Р.Й., Салата В.З., Семанюк В. І., Фреюк Д.В., Ярошович І. Г. Ветеринарна радіологія

Подождите немного. Документ загружается.

Ветеринарна радіологія

360

творюваність результатів рекомендується проводити 1 раз на мі-

сяць. Це можна зробити ваговим методом або з використанням

розчину радіоактивної мітки.

Гамма-лічильник призначений для реєстрації гамма-випро-

мінювання (рис. 13.3). Він може вимірювати активність ізотопів

125

І,

129

Со,

Со і призначений для підрахунку результатів радіоі-

мунологічного аналізу. Одночасно можна проводити вимірюван-

ня 12 зразків за допомогою 12 детекторів на основі кристалів Nal.

Однакова ефективність роботи детекторів забезпечується автома-

тичним визначенням високовольтної напруги для кожного з них і

розрахунком індивідуальних коефіцієнтів їх калібрування.

Рис. 13.3. Гамма-лічильник 1470 Wizard фірми

Wallak і Perkin Elmer (Фінляндія).

При використанні багатоканальних приладів окремі детек-

тори гамма-лічильника можуть забруднюватися радіоактивними

ізотопами, або може змінюватися ефективність їх роботи. Для по-

передження подібних помилок у роботі необхідно регулярно про-

водити стандартизацію лічильника.

Шейкер (рис. 13.4). Інтенсивність струшування впливає на

швидкість встановлення імунохімічної рівноваги в системі. У де-

яких наборах біохімічний склад калібрувальних проб значно ві-

дрізняється від складу аналізованих зразків сироваток крові, тому

імунохімічна реакція в них перебігає по-різному.

В умовах недоінкубації, що виникає при низькій інтенсивно-

сті струшування (менше ніж 280 осциляцій за хвилину) в аналізо-

ваних зразках, що мають більш високий вміст білка, ніж в стан-

дартах, не встигає наступити імунохімічна рівновага, і результат

аналізу спотворюється. Крім цього, при низькій інтенсивності

361

струшування покрита антитілами поверхня пробірки неповністю

омивається інкубаційною сумішшю і тому не бире участі в імуно-

хімічній реакції. Наслідком цього є зниження зв’язування і погір-

шення якості аналітичної системи.

Рис. 13.4. Шейкер інкубатор ШИ 115С.

Водяна баня. Температурний режим інкубації також є факто-

ром, що впливає на перебіг імунохімічної реакції в пробірці. Це

приводить до зниження зв’язування, збільшення коефіцієнта ва-

ріації і, як наслідок, до неправильних результатів.

Водоструменевий насос. Необхідний на стадії промивки. Про-

мивальний розчин треба видалити з пробірок негайно. Недотри-

мання цієї умови призводить до руйнування імунного комплексу

і відмивання зв’язаної активності

125

І. Результатом є різке знижен-

ня сигналу, збільшення коефіцієнта варіацій і погіршення інших

параметрів аналітичної системи.

Які недоліки має РІА?

Разом із безперечними перевагами РІА має і певні недоліки,

до яких можна віднести такі:

1) обмежений термін життя радіоактивної мітки, що викли-

кає необхідність постійної заміни реактивів;

2) відносно дороге спеціальне устаткування для реєстрації

радіоактивності;

3) можливість радіоактивного зараження навколишнього се-

редовища при здійсненні великої кількості аналізів, що викликає

необхідність дотримання спеціальних запобіжних засобів і висо-

ко кваліфікованого обслуговуючого персоналу.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

362

Саме ці труднощі послужили початковим моментом для по-

шуку методів, альтернативних РІА, але таких, що зберігають його

високу чутливість, специфічність та експресність.

Радіоімунологічний аналіз у ветеринарній медицині

Значні дослідження із застосуванням РІА були проведені вче-

ними ветеринарної медицини, зокрема з вивчення гормонального

статусу у великої рогатої худоби залежно від фізіологічного ста-

ну і продуктивності тварини, від сезону року, при лейкозі, а також

при променевій патології в овець.

Які дослідження із застосуванням РІА були проведені у ветеринарному

акушерстві та біотехнології розмноження?

У ветеринарному акушерстві та біотехнології розмноження

із застосуванням РІА встановлено динаміку гонадотропних гор-

монів гіпофіза: ЛГ (лютеінізуючого) і ФСГ (фоллікулостимулю-

чого гормонів) у сироватці крові корів за місяцями тільності й

сезонами року. Виявлений вплив рівня цих гормонів на фізіоло-

гічний стан тварин і їх продуктивність. Виявилося, що концен-

трація ЛГ і ФСГ у крові високопродуктивних корів холмогорсь-

кої породи була вищою порівняно з середньопродуктивними. За

сезонами року низький рівень ЛГ (15,15 мг/мл) виявлений у вес-

няний час, високий (54,44 мг/мл) - у зимовий, в той час як показ-

ники ФСГ мали недостовірні коливання (1,04-1,49 мг/мл в осін-

ньо-зимовий період і 2,25-3,52 мг/мл у весняно-літній). У період

тільності збільшувався вміст ЛГ з 3-го по 5-й і з 7-го по 8-й місяці

тільності; показники ФСГ були стабільними протягом всього пе-

ріоду плодоносіння.

На основі комплексного визначення ЛГ, естрадіолу й проге-

стерону в сироватці крові корів з нормальним статевим циклом

встановлена закономірність: максимальний вміст ЛГ і естраді-

олу спостерігається в передовуляторний період, а прогестерону

- під час найвищого розвитку жовтого тіла з десятиразовим пе-

ревищенням рівня його у фолікулінову фазу. У неплідних корів

виявлені серйозні порушення гормональних взаємовідносин в

363

організмі. У корів з фолікулярними кістами яєчників підвищува-

лася базальна секреція ЛГ й естрадіолу і був відсутній підйом вка-

заних гормонів у передовуляторний період. Виявлений низький

вміст прогестерону в лютеїновій фазі циклу, що дозволило зроби-

ти висновок про те, що в яєчнику з кістою не відбувається овуля-

ція фолікулів.

За аліментарної неплідності, викликаної ожирінням, вміст

ЛГ в передовуляторний період був у 2,15 раза, а естрадіолу в

1,54 раза вище за рівень їх базальної секреції; максимальний вміст

прогестерону під час найвищого розвитку жовтого тіла виявився

нижчим за норму і лише в 2,3 раза вищим порівняно зі середнім

рівнем у фолікуліновій фазі. Спостерігалася подовжена лютеїно-

ва фаза (18-19 днів). Виявлені відхилення призводять до того, що

під час овуляції з неповноцінного фолікула утвориться функціо-

нально малоактивне жовте тіло, яке виділяє недостатню кількість

прогестерону.

Таким чином, періодичне дослідження гормонів у крові ра-

діоімунологічним методом дозволяє контролювати нормальний

перебіг статевого циклу, своєчасно виявляти порушення відтво-

рювальної здатності, обґрунтовано застосовувати гормональні

препарати для відновлення статевої функції, а також визначати

оптимальний час для штучного осіменіння тварин.

Цікаві дані були отримані методом РІА з визначення проге-

стерону в молоці та сироватці крові корів. Встановлено, що ди-

наміка прогестерону і концентрація його в молоці корелює з умі-

стом його в сироватці крові. Концентрація прогестерону в молоці

на початку статевого циклу (1-3 день) виявляється невисокою; до

12 дня кількість гормону поступово зростає й утримується на ви-

сокому рівні до 18 дня циклу, а потім швидко падає до початко-

вих величин.

У разі запліднення тварини рівень прогестерону залишаєть-

ся високим. У період вагітності концентрація гормону зростає в 2

рази порівняно зі стадією урівноваження статевого циклу, досяга-

ючи 14 нг/мл в крові і 30-50 нг/мл в молоці. Отже, за рівнем вмісту

прогестерону в крові або молоці можна контролювати заплідне-

ність тварин у ранні терміни після осіменіння, тоді як ректальним

дослідженням це вдається зробити лише на 2-3 місяці вагітності.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

364

Які дослідження із застосуванням РІА були проведені з метою

прогнозування продуктивності?

З метою прогнозування молочної і м’ясної продуктивності

тварин методом РІА встановлено динаміку інсуліну, тироксину

та індексу ефективного тироксину в крові здорових корів протя-

гом лактації, а також виявлені кореляційні зв’язки між рівнем цих

гормонів у корів та їх молочною продуктивністю. Виявлена обер-

нена залежність між концентрацією інсуліну і тиреоїдних гормо-

нів у крові корів та рівнем їх середньодобового надою.

Які дослідження із застосуванням РІА були проведені у ветеринарній

онкології?

Враховуючи вплив гормонів на перебіг пухлинних процесів,

бачиться перспективним визначення їх рівня при вивченні пато-

генезу гемобластозів великої рогатої худоби, які наносять знач-

них економічних втрат тваринництву. Проведені в цьому напрямі

радіоімунологічні дослідження показали, що залежно від форми

і стадії гемобластозів виявляється різний механізм порушень ен-

докринної системи. Так, у корів при гострому лімфолейкозі змен-

шується вміст тироксину й інсуліну в крові, що характеризує гі-

пофункціональний стан щитоподібної і підшлункової залоз. У

початковій стадії хронічного лімфолейкозу знижується секреція

тироксину, але метаболізм гормонів у тканинах і процеси дейоду-

вання (утворення трийодтироніну з тироксину) не порушуються,

що відображає компенсаторні можливості організму.

На другій стадії розвитку лейкозного процесу посилюється

функціонування щитоподібної залози, викликане самим патоло-

гічним процесом, а також виникає гіпофункція підшлункової за-

лози. У деяких випадках (алейкемічний перебіг хвороби) функ-

ціональні зміни залоз внутрішньої секреції виявляються раніше,

ніж виражені ураження кровотворної системи і крові.

При лімфоцитарній лімфосаркомі нарівні зі змінами в систе-

мі крові знижується рівень гормонів у лімфі, що свідчить про по-

рушення їх метаболізму у тканинах. Встановлені зміни в секреції

гормонів у хворих тварин можуть бути використані для оцінки

365

та прогнозування важкості захворювання. Радіоімунологічне виз-

начення гормонального статусу дозволить ефективно та своєчас-

но виявляти хворих тварин і науково обґрунтовано підходити до

протилейкозних заходів профілактики. На основі РІА запропо-

новано декілька методів діагностики лейкозу тварин як з викори-

станням інтактного вірусу, так і структурних поліпептидів.

Які дослідження із застосуванням РІА були проведені в діагностиці

сказу?

Великої уваги заслуговує РІА в діагностиці сказу у тварин.

Метод базується на з’єднанні мічених радіонуклідом специфіч-

них антитіл антигеном (вірусом сказу) у мазках-відбитках моз-

ку хворих тварин і вимірюванням радіоактивності комплексу,

що утворився. Перевагами цього методу порівняно з традицій-

ними патоморфологічними є його висока специфічність, чутли-

вість, швидкість виконання, можливість дослідження несвіжого,

що вже розклався, патологічного матеріалу, а також кількісно ви-

ражати результати дослідження.

Сутність методу полягає в тому, що з різних відділів голов-

ного мозку (кора великих півкуль, амонові роги, мозочок і довга-

стий мозок) готують по чотири мазки-відбитки розміром 20x20 мм.

Препарати висушують на повітрі і фіксують протягом 4 год. в охо-

лодженому до 4°С ацетоні або п’ятикратним фламбуванням.

Як специфічні антитіла використовують антирабічний гам-

ма-глобулін, мічений

125

І.

На фіксовані препарати наносять мічений радіонуклідом ан-

тирабічний гамма-глобулін, вміщують їх у вологу камеру (чашки

Петрі із зволоженим дном) і витримують 20-30 хв. при температурі

37°С. Потім, протягом 18-24 год. препарати відмивають 0,01 М фос-

фатним буферним розчином або проточною водою і висушують

на повітрі. Дослідні та контрольні препарати обробляють окремо.

На закінчення проводять радіометрію препаратів.

Діагноз на сказ вважається позитивним, якщо радіоактив-

ність препаратів, що досліджуються, в 2 рази і більше перевищує

контрольні.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

366

Які дослідження із застосуванням РІА є перспективними у

собаківництві?

У зв’язку з інтенсивним розвитком собаківництва перспек-

тивне використання РІА для вивчення патогенезу, ранньої діагно-

стики й оцінки способів профілактики та лікування різних захво-

рювань у собак.

Які дослідження із застосуванням РІА є перспективними у

вірусології?

РІА є дуже перспективним у вірусології. Він дозволяє з висо-

кою надійністю діагностувати вірусні хвороби.

Можливості радіоімунологічного аналізу значно розшири-

лися в диференціальній діагностиці завдяки використанню моно-

клональних антитіл, що володіють високою специфічністю.

Яка роль РІА у вивченні променевої хвороби?

Важлива ланка у вивченні механізмів біологічної дії іонізуючих

випромінювань на тваринний організм - дослідження гормональної

системи при різних дозах опромінення. Комплексні радіоімунологічні

дослідження на вівцях показали, що визначення вмісту кортикотро-

піну і кортизолу в крові тварин дозволяє оцінювати функціональний

стан головної адаптивної ланки - гіпоталамо-гіпофізо-наднирнико-

вої системи в різні періоди променевої хвороби.

Ступінь променевого ураження чітко корелює з тривалістю

та інтенсивністю гіперкортицизму, а також рівнем кортикотропі-

ну в крові овець під час первинної реакції організму на опромі-

нення.

Сприятливий перебіг променевої хвороби супроводжується

повторним збільшенням концентрації АКТГ та кортизолу в пері-

од розпалу променевої хвороби і зниженням вмісту цих гормонів

нижче початкового рівня в період реконвалісценції. При несприят-

ливому перебігові променевої хвороби встановлене поступове, аж

до загибелі тварини, підвищення рівня АКТГ і кортизолу в крові.

Можливість швидкого та чіткого виконання масових обсте-

жень тварин за допомогою РІА дозволяє діагностувати ступінь

367

променевого ураження до вияву клініко-гематологічних змін в

опроміненому організмі, а отже, своєчасно провести заходи щодо

лікування і подальшого використання опромінених тварин.

З’ясувалися основні закономірності реакції системи “гіпофіз-

сім’яники” в опромінених статевозрілих баранів породи фінсь-

кий ландрас. Встановлено, що зсуви в гормональному балансі ЛГ,

ФСГ і тестостерону відображають функціональний стан системи

“гіпофіз-сім’яники” залежно від ступеня променевого ураження.

Так, при легкому ступені променевої хвороби (доза опромінення

0,96 Гр) рівень гонадотропінів (ЛГ і ФСГ) у сироватці крові бара-

нів збільшується до кінця першого тижня після опромінення (ЛГ

до 12,0±0,19, а ФСГ до 22,7±1,1 нг/мл) і нормалізується до 20-25

доби. Вміст тестостерону дещо зростав у період первинних про-

меневих реакцій і коливався в межах початкових величин протя-

гом останніх 15 діб спостереження.

При гострій променевій хворобі середнього ступеня важкості

(доза опромінення 4,86 Гр) відбувається достовірне підвищення

концентрації ЛГ і ФСГ на початку латентного періоду. Ескалація

рівня гонадотропінів продовжується до 20-25 доби після опромі-

нення. У четвертому періоді показники ЛГ і ФСГ знижуються. Ди-

наміка рівня тестостерону в сироватці крові характеризується на-

явністю піків гормону в період первинних реакцій (до 15,6 нг/мл)

і в кінці прихованого періоду (до 11 нг/мл). У третьому і четвер-

тому періодах гострої променевої хвороби виявлено прогресуюче

падіння рівня тестостерону, а показники андрогенів складали од-

ну третину від вихідного рівня (3,1±0,7 нг/мл).

Таким чином, отримані результати свідчать про дестабіліза-

цію діяльності системи “гіпофіз-сім’яники” при гострій промене-

вій хворобі.

За даними радіоімунологічного аналізу встановлена залеж-

ність рівня гастрину в крові від ступеня важкості променевої хво-

роби. Так, при променевій хворобі, викликаній рентгенівським

опроміненням в дозі 0,96 Гр (легкий ступінь), кількість гастрину

в крові зростає в період первинних реакцій променевої хвороби,

а в її розпал (7-10 добу після опромінення) знижується в 1,5 раза

порівняно з нормою. При опроміненні в дозі 3,84 Гр (середня сту-

пінь важкості) кількісні зміни гастрину мають таку ж закономір-

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

368

ність, але вони більш виражені; в період розпалу хвороби рівень

гастрину знижується в 2,5 раза порівняно з нормою (з 70,85 пг/мл

до 28,03 пг/мл).

Враховуючи, що найбільш важливі клітинні функції, що охо-

плюють секрецію гормонів, ріст клітин та їх імунну відповідь, зна-

ходяться у ссавців під впливом циклічних нуклеотидів, було виз-

начено вміст цАМФ (циклічний аденозинмонофосфат) в плазмі

крові баранів, опромінених в дозах 0,96 і 3,84 Гр. При опроміненні

дозою 0,96 Гр рівень цАМФ збільшується в період первинної ре-

акції організму, досягаючи найбільшої концентрації в розпал про-

меневої хвороби. У цей час рівень цАМФ вищий за базальний в

1,7 раза. До 30 доби після опромінення концентрація цАМФ зни-

жується, але залишається вище контрольного рівня. Така ж зако-

номірність простежується і при опроміненні дозою 3,84 Гр, але

спостерігаються великі коливання у вмісті циклічного нуклеоти-

ду, концентрація якого в розпал променевої хвороби була вищою

від вихідної більше ніж у 2 раза.

Встановлені зміни рівня цАМФ в крові у опромінених тва-

рин корелюють з дозою опромінення і відображають ступінь про-

меневого ураження.

Яка роль РІА у кількісному визначенні концентрації ферментів?

Радіоімунологічний аналіз відкрив можливість кількісного

визначення низьких концентрацій ферментів, які були недоступ-

ні для традиційних методів дослідження. При цьому на аналіз не

впливають ні температура, ні інгібітори, ні активатори ферментів,

ні зміни в якісному складі й кількісному вмісті субстрату.

Яка роль РІА у виявленні антиспермальних антитіл?

За допомогою РІА можна визначити місце з’єднання анти-

спермальних антитіл зі сперматозоїдом (головка, шийка, хво-

стик). Проте, цей метод не дає інформації про антигенну специ-

фічність антитіл.

Слід також враховувати, що позитивний результат може бу-

ти наслідком наявності антитіл на лейкоцитах, що знаходяться в

спермі, а не на сперматозоїдах.

369

Радіометрія біологічних тканин

Як проводять радіометрію біологічних тканин?

Для радіометрії зразків тканин проби спалюють, отримую-

чи пари тритієвої води або

СО

, які потім вловлюються рідкими

сцинтиляторами. У цьому випадку можна не контролювати фон

та ефективність реєстрації, оскільки склад сцинтиляційної сумі-

ші завжди постійний. При спалюванні можливі втрати активності

та ізотопне фракціонування, але при ретельному виконанні про-

цедури і надійній апаратурі ці джерела погрішностей можна усу-

нути. Недоліком методу спалення є тривалість процедури підго-

товки зразка для вимірювань.

Переведення біологічних проб у розчин можна здійснюва-

ти за допомогою так званих тканинних розчинників. У практиці

сцинтиляційних вимірювань використовують такі розчинники:

1) гіамін 10-Х (Нуаmine 10-Х) - розчиняє сироватку і плазму

крові, амінокислоти (за винятком аргініну);

2) NCS - тканинний розчинник - являє собою суміш розчин-

них у толуолі четвертинних амонієвих основ з молекулярною ма-

сою 250-600 дальтон;

3) біо-солв (Bio-solv);

4) солуен-100 (Soluen-100) - четвертинна амонієва основа з

молекулярною масою 386 дальтон, у ньому можна розчиняти ве-

ликі проби цільної крові;

5) дигестин (Degestin).

Кращим розчинником вважається гіамін 10-Х, який добре

розчиняє більшість біологічних тканин. Вимоги до його хімічної

чистоти дуже високі. Будь-яке забруднення відразу ж збільшує

хемілюмінесценцію, хімічне і колірне гасіння в сцинтиляторах.

У нашій країні виготовляються сцинтиляційні гелі для гетеро-

генних вимірювань зі сцинтиляційною ефективністю до 1,3 по від-

ношенню до еталонного сцинтилятора ЖС-11, ЖС-12, ЖС-37 і

ЖС-39. Як гелеутворюючий агент використовують поліметилме-

такрилат. Для вимірювання повних зразків випускається сцинти-

ляційна рідина на основі діоксану: ЖС-7, ЖС-7А, ЖС-8, ЖС-103,

ЖС-109. Їх відносні світлові виходи відповідно становлять 0,8; 1,0;

Методи радіоімунологічного аналізу