Кравців Р.Й., Салата В.З., Семанюк В. І., Фреюк Д.В., Ярошович І. Г. Ветеринарна радіологія

Подождите немного. Документ загружается.

Ветеринарна радіологія

390

——

•100%

Наприклад, при використанні твердофазного носія вона зви-

чайно менша і, отже, чутливість нижча.

Величина

—— .

100%

служить показником спорідненості анти-

тіл, стабільності всіх реагентів, повноти осадження при центри-

фугуванні.

Як правило, величина

—— .

100%

зменшується при тривалому

зберіганні реагентів набору. Придатність набору звичайно зале-

жить не від періоду напіврозпаду радіонукліда, а від збереження

імунореактивності міченого ліганда. Молекула останнього з ча-

сом деградує внаслідок радіолізу, хімічних пошкоджень або по-

рушення внутрішньомолекулярних зв’язків. Первинне антиті-

ло перестає “впізнавати” свій видозмінений антиген й утворення

комплексів або різко знижується, або припиняється.

Багато комерційних наборів включають контрольні сироват-

ки з відомим вмістом речовини, що визначається. Однак, крім то-

го, в лабораторії необхідно мати свої пули сироватки і плазми, які

можна вводити у вигляді окремих проб при кожному використан-

ні чергового набору. На практиці краще змішувати плазму крові,

взяту від декількох людей (для нівелювання відмінностей у кон-

центрації білка), розливати її на аліквоти, потім плазму треба за-

морозити і використати при потребі. Важливо, щоби вміст анти-

гена в контрольній пробі знаходився в межах робочого відрізка

калібрувальної кривої.

Що представляє собою контроль якості тест-системи за специфічністю

скріплення міченого ліганда?

Специфічність (або вибірковість) тесту означає можливість

відділення речовини, що визначається, від домішок, що дають пе-

рехресні реакції. Вона насамперед визначається специфічністю

первинної антисироватки. Специфічне антитіло здатне відрізни-

ти речовину, що вимірюється від інших, дуже близьких за будо-

вою субстанцій.

Специфічність, або, вірніше, перехресну реактивність, визна-

чають таким чином:

391

1. Різні концентрації стандартної речовини (С) відкладають

на осі абсцис; на осі ординат – відповідні значення

——

100%

де В=С

, С

..., С

, С

=0, С

=1, ..., С

=1×10

Будують калібрувальну криву. На осі ординат знаходять точ-

ку

1 С

—

——

100%

2 T

, тобто

——

=50%. З цієї точки проводять пряму, пара-

лельну осі абсцис. Припустимо, що для кортизолу

——

=50% від-

повідає концентрації, рівній 2,5 нг на пробу. Необхідно визначити

відсоток перехресної реактивності для інших стероїдів, напри-

клад, альдостерону, тестостерону тощо. Для цього роблять таке

ж розведення концентрацій названих речовин і будують для них

криві на тому ж графіку, на якому вже є крива для кортизолу. Як-

що крива для альдостерону перетинає перпендикуляр, відновле-

ний з точки

——

=50% для кортизолу, є перехресна реактивність.

Її відсоток обчислюють таким чином. Нехай для альдостерону

——

=50% за графіком відповідає концентрації 9000 нг на пробу;

тоді перехресна реактивність у даній тест-системі складе

2,5

———

100%

9000

= 0,028%.

Якщо крива для тестостерону не перетинає вказаний вище

перпендикуляр, тестостерон в даній тест-системі не конкурує з

кортизолом.

Інший варіант обчислень відсотка перехресної реактивності

(ПР) можна здійснити за формулою:

50% А

П Р = ————

100%,

50% Б

де 50% А – кількість однієї речовини, здатної зв’язати 50% ан-

титіла (наприклад, 0,05 нг);

50% Б - кількість іншої речовини, що зв’язує 50% антитіла

(наприклад 50 нг) в тій же тест-системі.

У цьому випадку ПР для Б щодо до А складе:

50% А

П Р = ————

100% = 0,01%,

50% Б

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

392

Що представляє собою контроль якості тест-системи за величиною

її чутливості?

Чутливість – найменша кількість речовини, що визначаєть-

ся за допомогою даного тесту. Звичайно в описі реагентів набо-

ру приводиться величина чутливості, яка встановлюється фір-

мою виробником даного набору. Дослідник повинен знати, що

чутливість максимальна при максимальному значенні

—— .

100%

При рутинних аналізах цей параметр визначають за стандартною

кривою, приймаючи за межу чутливості

—— .

100%

=95% або 50% і

знаходять на осі абсцис відповідну цьому значенню концентрацію

стандартної речовини.

Що представляє собою перевірка точності тест-системи?

Точність (precision) – ступінь відтворення тесту, тобто здат-

ність давати однакову відповідь за повторного тестування тієї ж

самої проби. Перевірка точності тестування включає оцінку 3 па-

раметрів.

а) Відтворення стандартної кривої для різних партій реаген-

тів. Криві можна відтворювати, якщо для кожної партії

—— .

100%

=50% буде відповідати одній і тій же середній кон-

центрації з коефіцієнтом варіації менше за 2%.

б) Відтворення при одному тестуванні, тобто при проведенні

реакції з одним набором реагентів однієї лабораторії. Визначають

концентрацію речовини в декількох реплікатах одночасно (краще

не менше ніж 10) для 3 варіантів контрольної сироватки або плаз-

ми: з високим, середнім і низьким вмістом цієї речовини. Обчис-

люють коефіцієнт варіації (див. вище) для кожної концентрації.

Якщо він перевищує 10%, якість тест-системи незадовільна; якщо

рівний 2% або менший – якість відмінна. При використанні спро-

щеного варіанту даного тесту визначають концентрацію речови-

ни в 20 реплікатах одних і тих же контрольних сироваток. Якщо з

інтервалу М±2

δ “випадає” тільки одна проба з 20, якість тест-си-

стеми хороша, якщо 2-3 проби – незадовільна.

в) Відтворення при тестуванні одних і тих же контрольних

проб з використанням наборів реагентів даної тест-системи кра-

393

ще в різних лабораторіях. У цьому випадку граничною величиною

коефіцієнта варіації вважається 15%. Тест на точність дозволяє

також оцінити кваліфікацію співробітників, що здійснюють про-

цедуру радіотестування аналізу in vitro, вплив тих або інших чин-

ників (температури, тривалість інкубації та центрифугування), а

також прийнятність обладнання для цілей радіотестування.

Що представляє собою перевірка надійності тест-системи?

Надійність (ассuracy) означає, наскільки точно отримана ве-

личина відповідає істині. Цей параметр залежить від сукупності

3 попередніх і наявності точних стандартів. Перевірка надійності

здійснюється за допомогою тестів на “відкриття” і паралелізм.

Тест на ступінь наближення до істинного вмісту речовини у

пробі.

До однакових аліквот контрольної плазми з відомим умістом

речовини (наприклад 5 нг), що визначається в даній тест-системі,

підливають різні концентрації стандартної речовини (наприклад

100, 200, 400, 800 нг) і вимірюють такі проби. Визначити відсоток

ступеня наближення до істинного вмісту речовини “відкриття” в

пробі можна таким чином (табл. 13.4).

Таблиця 13.4

Визначення відсотка ступеня наближення до істинного вмісту речовини

(“відкриття”) в пробі

Сумарна кількість 105 205 405 805

речовини в пробі нг, Х (5+100) (5+200) (5+400) (5+800)

“Відкрита” кількість

речовини в пробі, нг, Y 98 201 408 816

% “Відкриття”

Y/Х

⋅

100% 93,3 97,5 100,7 101,2

Якщо обчислений потім коефіцієнт варіації буде в межах 10%,

надійність тесту задовільна, якщо вище за 10% - незадовільна.

Тест на паралелізм.

Тест на паралелізм – визначення концентрації речовини в по-

слідовному розведенні контрольної плазми, що відповідає розве-

денню стандартної субстанції (наприклад, кожна подальша кон-

центрація менша від попередньої в 2 рази). Стандартну криву

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

394

контрольних розведень будують на одному й тому ж графіку в ло-

гарифмічному масштабі.

При проведенні тесту на паралелізм розводити контрольну

плазму треба тим же розчинником, що й стандартну субстанцію.

Пробірки з контрольною плазмою потрібно вміщувати через кож-

ні 5-10 інших проб. Це забезпечує впевненість в якості контролю.

Уніфікована система перевірки якості наборів реагентів для

радіотестування in vitro не тільки є запорукою отримання висо-

ковірогідних результатів наукового дослідження і клінічного по-

казника, але й дозволяє мати об’єктивну аргументацію при вибо-

рі того або іншого набору для рутинних клінічних аналізів. Крім

цього, невідповідність комерційного набору одному чи декіль-

ком описаним кількісним параметрам може служити основою для

складання рекламації на даний набір і вимоги щодо його заміни

фірмою-виробником.

Що представляє собою специфічність тест-системи?

Специфічність визначають як міру впливу на результат ана-

лізу речовин, відмінних від тих, що аналізуються. До них відно-

сять дві групи речовин: 1) подібні з лігандом за своїми фізико-

хімічними властивостями і тому здатні безпосередньо взаємодія-

ти зі зв’язуючим агентом (перехресна реактивність) і 2) ті, що без-

посередньо не реагують зі зв’язуючим реагентом, але здатні впли-

вати на основну реакцію між і лігандом (кислотою).

При проведенні всіх реакцій з’єднання основну проблему

представляє неспецифічна перехресна реактивність зв’язуючого

реагента. У разі використання антисироватки існують 3 причини

перехресної взаємодії:

1) одна і та ж гомогенна популяція антитіл може реагувати

з багатьма родинними між собою лігандами, причому для кож-

ної такої реакції характерне своє значення константи споріднено-

сті (К);

2) антисироватка може містити різні популяції молекул анти-

тіл, одна або декілька з яких можуть бути специфічними щодо та-

кої ж ділянки молекули антигена, який є також у родинних йому

з’єднаннях;

395

3) антисироватка може містити антитіла, специфічні віднос-

но до домішок, присутніх як в препараті ліганда, так і в матеріалі,

що аналізується.

Оцінку величини перехресної реакції проводять за схемою,

описаною в розділі контроль якості. Способи підвищення спе-

цифічності зв’язуючого реагента залежать від його природи. Для

природних зв’язуючих реагентів (білки крові або клітинні рецеп-

тори) єдиним методом підвищення специфічності є проведення

попередньої екстракції. При використанні антитіл можливостей

для прямого підвищення специфічності значно більше. До їх чис-

ла відноситься: вибір схеми імунізації, підбір умов аналізу, а та-

кож видалення небажаних популяцій молекул шляхом виснажен-

ня антисироватки.

Неспецифічність, пов’язану з присутністю в імуногені домі-

шок, можна “обійти” при використанні чистого ліганда.

Неспецифічність, зумовлену присутністю однакових анти-

генних ділянок в імуногені та родинній йому речовині, можна

виключити шляхом використання такого фрагмента імуногена,

який не містить загальної антигенної ділянки.

Неспецифічність, зумовлену взаємодією однієї гомогенної

популяції антитіл з деякими подібними антигенними ділянками,

шляхом підбору імуногена виключити не можна.

Для видалення небажаної популяції антитіл застосовують ме-

тод виснаження. З цією метою використовують очищений препа-

рат фрагмента, що містить загальну антигенну ділянку або препа-

рат забруднюючої речовини. Іноді комбінують обидва прийоми.

Існують два прийоми виснаження антисироватки: 1) пере-

хресно реагуючу речовину додають в антисироватку і видаляють

імунопреципітат, що утворився при допомозі центрифугуван-

ня; 2) перехресно реагуючу речовину додають у розчинній формі,

зв’язаній із твердою фазою (типу целюлози або сефадексу).

Специфічність тесту можна підвищити також шляхом підбо-

ру умов проведення аналізу, наприклад:

1) при дуже сильному розведенні антисироватки неспеци-

фічність, зумовлена присутністю антитіл, які володіють низькою

спорідненістю, може бути незначною;

2) використовувати високоочищений мічений ліганд;

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

396

3) проводити найбільш вибіркове розділення зв’язаної та

вільної фракцій.

Неспецифічність другого типу зумовлена присутністю речо-

вин, що перешкоджають взаємодії між зв’язуючим реагентом та

лігандом: сильно заряджені речовини типу гепарину, високі кон-

центрації солей, сечовини, кислот і лугів. Така неспецифічність

виявляється в тому, що при радіотестуванні невідомої проби кон-

центрація ліганда виявляється вищою за концентрацію, виміряну

за допомогою інших незалежних методів аналізу.

У деяких випадках неспецифічні ефекти можуть приводити

до занижених значень концентрації. В основі даної неспецифічно-

сті лежать 4 механізми:

1) блокада взаємодії зв’язуючого реагента з лігандом;

2) розкид величин NSB;

3) руйнування або інактивація зв’язуючого реагента або мі-

ченого ліганда;

4) руйнування або інактивація неміченого ліганда.

До практичних способів усунення неспецифічності 2-го ти-

пу відноситься:

1) забезпечення ідентичності загального складу стандарту і

проби, що аналізується (наприклад, за вмістом білка);

2) визначення ступеня адсорбції міченого або неміченого лі-

ганда з розчину, що аналізується на стінках пробірки (в пробірку

додають мічений ліганд, потім його витягують і визначають раді-

оактивність, що залишилася);

3) усунення можливості ферментативного розщеплення (в

інкубаційне середовище додають інгібітори ферментів);

4) екстракція і концентрування ліганда.

Що представляє собою чутливість тест-системи?

Чутливість тест-системи – та мінімальна кількість речовини,

яку можна визначити за допомогою даного способу в даних умо-

вах. Звичайно визначають мінімальну концентрацію неміченого

ліганда, при якій ще є відмінність в результатах аналізу мінімаль-

ного і нульового стандарту (В

). Ця відмінність повинна ґрунтува-

тися на статистично вірогідних довірчих інтервалах, знайдених як

397

для В

, так і для стандарту. Наприклад, якщо при двох паралель-

них визначеннях отримані величини 100 і 105, то середнє ариф-

метичне значення дорівнює 102,5, а ймовірний інтервал станови-

тиме 97,6-107,4. Якщо будуть проведені додаткові визначення, то

ймовірний інтервал звузиться. Так, при показниках 99; 100; 105 і

106 середнє арифметичне не зміниться, однак ймовірний інтервал

буде становити 99,1-105,9.

Чутливість потрібно виражати концентрацією (маса на оди-

ницю об’єму) речовини, що вимірюється в біологічній рідині,

а не абсолютною кількістю речовини в пробі, як це нерідко ро-

блять. Наприклад, істинна чутливість тесту становить 1 нг/мл; як-

що об’єм інкубаційної суміші рівний 1 мл, то абсолютна кількість

речовини, що аналізується, буде такою, що дорівнює 1 нг, але як-

що об’єм інкубаційної суміші рівний 0,1 мл, то абсолютна кіль-

кість буде становити всього 0,1 нг. На цій основі вирішують, що в

останньому випадку чутливість вищае, тоді як насправді вона од-

накова в обох випадках. Іноді чутливість помилково виражають у

вигляді питомої величини відносно стандарту у водному розчині

й отримують дуже низьку ефективну чутливість.

Способи підвищення чутливості:

1) Зниження кількості міченого ліганда – ефективний спосіб

підвищення чутливості тест-системи при умові обліку обмежень

цього способу. Зокрема, при будь-яких заданих умовах (спорід-

неність і концентрація зв’язуючого реагента, час інкубації) є така

мінімальна концентрація міченого ліганда, при якій подальше її

зниження не викликає змін чутливості аналізу. Тому підвищення

питомої радіоактивності міченого ліганда з метою зниження його

концентрації в реакційній суміші в багатьох випадках невиправ-

дане, оскільки це збільшує ймовірність швидкого пошкоджен-

ня ліганда, а чутливість при цьому не підвищується. При вибо-

рі оптимальної кількості міченого ліганда потрібно вийти з того,

щоб загальне число імпульсів на пробу складало не більше ніж

10000 у хвилину. Якщо мінімальна кількість міченого ліганда дає

значно більше число імпульсів, необхідно знизити питому радіо-

активність початкового препарату.

2) Зменшення кількості зв’язуючого реагента. У міру його

зменшення чутливість аналізу буде підвищуватися. На практиці

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

398

підвищення чутливості обмежене точністю тесту: чим вища чут-

ливість, тим нижче відтворювання результатів. Емпірично доведе,

що зниження кількості зв’язуючого реагента до такого мінімуму,

при якому

——

100%

не перевищує 20%, абсолютно неефективне,

оскільки нівелюється зниженням точності.

3) Збільшення часу інкубації. Цей прийом можна використа-

ти тільки при дуже низьких концентраціях (загальний час інку-

бації може становити 7 діб). Недоліком є те, що у міру збільшен-

ня часу інкубації підвищується можливість порушення нативної

структури реагентів (зокрема, міченого ліганда) під дією інших

компонентів системи (наприклад, білкові гормони можуть зазна-

вати дії протеолітичних ферментів). Саме з цієї причини нерідко

спостерігається зменшення з’єднання в нульовому стандарті (іно-

ді радіоактивність виявляється навіть нижчою від першого стан-

дарту), що несприятливо впливає на чутливість.

4) Скорочення тривалості інкубації. Якщо зупиняти реакцію

раніше, ніж досягнута рівновага, то з’єднання в нульовому стан-

дарті буде знижене, уявна ж чутливість може підвищитися. Такий

ефект досягається шляхом передчасного розділення зв’язаного і

вільного ліганда. У випадку великої партії проб можливі істот-

ні відмінності між першою та останньою пробірками, оскільки в

останній реакція може раніше наблизитися до стану рівноваги.

5) Зміна порядку додавання реагентів. При додаванні реаген-

тів у послідовності “проба - мічений ліганд - зв’язуючий агент”

мічений і немічений ліганд мають однакову можливість зв’язува-

тися зі специфічними ділянками зв’язуючого реагента. При зміні

порядку додавання міченого ліганда і зв’язуючого агента отриму-

ють іншу калібрувальну криву і значно більш високу чутливість.

Такий спосіб аналізу називається методом пізнього додавання мі-

ченого ліганда. Можливість використання даного способу стосов-

но тієї або іншої системи потрібно встановлювати емпірично.

6) Збільшення об’єму проби, що тестується. Об’єм проби, що

тестується зазвичай не перевищує 10% загального об’єму інкуба-

ційної суміші (наприклад, 50 мкл в 500 мкл). Оскільки інші реа-

генти можна додавати без зниження точності в такому малень-

кому об’ємі, як 50 мкл, то здається, що можна збільшити об’єм

проби до 400 мкл і таким чином підвищити чутливість у 8 разів.

399

Однак на практиці цей прийом використати не можна, оскільки

збільшення об’єму проби приводить до наростання неспецифіч-

ного ефекту. Останній незначний, якщо вміст проби в інкубацій-

ній суміші не перевищує 10% загального об’єму.

7) Зміна температури інкубації. Швидкість досягнення біоло-

гічними реакціями стану рівноваги в тестах in vitro зростає у 2 ра-

зи при підвищенні навколишньої температури на 10°C. Однак пе-

реважно підвищення температури не призводить до збільшення

чутливості, але прискорює руйнування (наприклад, ферментатив-

не) міченого ліганда. Верхньою межею температури вважають 45°С.

При радіотестуванні in vitro частіше використовують пониження

температури. Так, при застосуванні методу конкурентного білко-

вого з’єднання константа спорідненості зв’язуючих білків помітно

підвищується при зниженні температури, і, відповідно, збільшуєть-

ся чутливість аналізу. Аналогічне явище спостерігається при раді-

оімунологічному аналізі пептидів, тому для отримання виключно

високої чутливості використовують низькі температури.

Основним чинником, що визначає зниження чутливості

тест-системи, є збільшення концентрації зв’язуючого реагента в

інкубаційній суміші. При цьому калібрувальна крива зсувається

праворуч, у бік вищих концентрацій неміченого ліганда. Цю об-

ставину потрібно враховувати при розробці систем радіотесту-

вання in vitro для визначення кількості речовин, присутніх у про-

бі у високій концентрації (наприклад, β

-мікроглобулінів).

У тест-системі з низькою чутливістю потрібно збільшувати

кількість міченого ліганда. При цьому відпадає необхідність того,

щоб ліганд мав високу питому радіоактивність і тим самим підви-

щується стабільність.

До інших переваг даного способу відноситься:

1) підвищення рівня з’єднання в нульовому стандарті, тобто

збільшення крутості кривої і тим самим – точності вимірювання;

2) мінімальний час інкубації (після антитіла можна відразу

додавати реагент);

3) об’єм проби, що тестується, може бути мінімальним (від-

падає необхідність в її попередньому розбавленні);

4) зв’язуючий реагент, перебуваючи у відносному надлишку,

може не володіти виключно високою спорідненістю до ліганда.

Методи радіоімунологічного аналізу