Кравців Р.Й., Салата В.З., Семанюк В. І., Фреюк Д.В., Ярошович І. Г. Ветеринарна радіологія

Подождите немного. Документ загружается.

Ветеринарна радіологія

380

нювання, пластмасові - біля 7%, тому для проведення однієї реак-

ції не можна використовувати різні типи пробірок;

в) ефективність детектування випромінювання залежить та-

кож від об’єму проби, що вимірюється, тому для проведення одні-

єї реакції об’єм проб і положення пробірок в колодязі лічильника

повинні бути абсолютно однаковими;

г) немає необхідності доводити, наскільки впливають по-

милки радіометрії на кінцеві результати, тому за малої активно-

сті проби потрібно вимірювати довше для того, щоб нагромадити

досить велике число імпульсів на пробу;

д) після включення лічильника необхідно виміряти фон; про-

тягом 10 хв. рахують імпульси при відсутності проби в криста-

лі. Для середнього γ-лічильника фон складає менше за 50 імп./хв.

в нижньому положенні й вікні для

125

І. Фон може підвищуватися

внаслідок високого положення проби, великої ширини енергетич-

ного вікна, присутності в приміщенні високоенергетичних γ-ви-

промінювачів, забруднення касет, пробірок-носіїв або внутрішніх

стінок колодязя; необхідно встановити причину високого фону й

усунути її.

Які технічні моменти слід враховувати при використанні стандартів?

Кількісне вираження результатів радіотестування in vitro ба-

зується на порівнянні реакцій матеріалу, що тестується, з реак-

ціями стандарту, що оцінюється в тому ж самому тесті. Як у всіх

тестах, базованих на порівнянні двох матеріалів, “подібне” повин-

но порівнюватися з “подібним”. Для РІА це означає, що стандарт

повинен виявляти імунохімічну ідентичність матеріалу, що тесту-

ється. Неідентичність стандартів субстанціям, що визначаються,

може бути наслідком:

1) природних варіацій, типу “великого” інсуліну, фрагментів

гормонів та інших речовин;

2) видових відмінностей;

3) артефактів, викликаних деградацією;

4) помилок синтезу штучних субстанцій. Критичною є ста-

більність антигену, що використовується в наборах як стандарт

протягом тривалого часу.

381

Матеріали, які підходять для використання їх як стандартів,

можна розділити на 3 категорії:

1) високоочищені гомогенні антигени, отримані від тих же

видів тварин, що й матеріал, який вимірюється;

2) частково очищені антигени, що можуть використовувати-

ся як стандарти доти, поки не з’являться стандарти 1 категорії;

3) суцільна плазма, грубі екстракти з тканини або сечі, бакте-

рійні або вірусні антигени, які використовуються на ранніх етапах

розробки тесту при відсутності стандартів 1 і 2 категорій. Іноді за-

стосовують стандарт 1 категорії, взятий від іншого виду тварин,

ніж речовина, що вимірюється, якщо доведено, що дана тест-си-

стема “не відрізняє” стандарт один від іншого.

Зараз виробництво і поширення єдиних стандартів знахо-

дяться під контролем ВООЗ і здійснюються в Національному ін-

ституті біологічних стандартів та контрольних препаратів при

Комітеті з медичних досліджень в Англії та в Національному

агентстві з гормонів гіпофіза при Національному інституті ревма-

тизму та патології обміну речовин і травлення в США. Тільки при

використанні міжнародних стандартів можна дати єдину форму

вираження результатів, що дозволяє порівнювати дані, що отри-

муються або в різних лабораторіях, або в одній і тій же лаборато-

рії в різний час.

Яким вимогам повинен відповідати матеріал, прийнятий як стандарт?

Матеріал, прийнятий як стандарт, повинен задовольняти та-

кі вимоги:

• він повинен бути доступний в кількості, достатній для то-

го, щоб ним можна було забезпечувати велике число лабораторій

протягом багатьох років;

• він повинен бути стабільним, причому повинно бути відо-

мо, який вплив дає на нього зберігання протягом декількох міся-

ців при різних температурах;

• він не повинен містити домішок, що заважають визначен-

ню, у зв’язку із чим перед поширенням він повинен бути проте-

стований на великому числі різних аналітичних систем;

• в ідеальному варіанті він повинен являти собою індивіду-

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

382

альну речовину високого ступеня чистоти (тобто складатися з мо-

лекул тільки одного виду).

Потрібно враховувати що в комерційних наборах реагентів,

як стандарти фірми застосовують препарати власного виготов-

лення, калібровані за відповідними міжнародними стандартами,

тому речовина, що використовується, може не завжди бути іден-

тичною міжнародному стандартові (наприклад, за стабільністю,

фізико-хімічною гомогенностю).

Розділення зв’язаної та вільної фракцій міченого ліганда

при виконанні процедури радіотестування in VITRO

Які загальні принципи розділення зв’язаної і вільної фракцій міченого

ліганда при виконанні процедури радіотестування in vitro?

Після завершення інкубації реакційної суміші при виконан-

ні процедури радіотестування in vitro комплекс “мічений ліганд-

зв’язуючий реагент” необхідно відділити від незв’язаного мічено-

го ліганда. Всі способи розділення цих двох фракцій базуються на

фізико-хімічних відмінностях їх властивостей. Основними крите-

ріями для вибору способу розділення є ефективність і практич-

ність.

Під ефективністю мають на увазі повноту відділення ком-

плексу від вільного ліганда. В ідеальному випадку ефективність

повинна бути близька до 100%. Практично якась частина мічено-

го ліганда завжди буде виявлятися у фракції зв’язаного ліганда

навіть у відсутності зв’язуючого реагенту. Причини такого впли-

ву наступні:

1) фізичне захоплення вільного ліганда комплексом “зв’язую-

чий реагент-ліганд” (наприклад, внаслідок випадання вільного лі-

ганда в осад, що утворюється);

2) присутність в міченому ліганді домішок, близьких за хіміч-

ними властивостями до комплексу “зв’язуючий реагент-ліганд”;

3) адсорбція вільного ліганда на стінках пробірки;

4) неповне розділення вільного і зв’язаного ліганда через од-

накову здатність до осадження;

5) неповне осадження комплексу мічений “ліганд-зв’язуючий

383

реагент”, що часто має місце при використанні в РІА методу под-

війних антитіл;

6) мічений ліганд може містити домішки, які не реагують зі

зв’язуючим агентом і внаслідок цього виявляються у вільній фазі

(наприклад, вільний йодид);

7) процес розділення може викликати дисоціацію комплексу

(наприклад, при використанні методу розділення, при якому віль-

ний ліганд адсорбується на вугіллі, а зв’язаний залишається в роз-

чині); розділенню може заважати той факт, що активоване вугілля

здатне конкурувати зі зв’язуючим агентом за ліганд і “відривати”

таким чином ліганд від комплексу.

Що слід розуміти під практичністю методів розділення?

Під практичністю методів розділення мають на увазі швид-

кість і простоту розділення, а також можливість широкого засто-

сування даного методу. Висока швидкість розділення бажана ли-

ше в екстрених випадках. Більшість методів розділення вимагає

нетривалого часу (порівняно з інкубацією) і лише в невеликій мі-

рі збільшує загальний час аналізу. Винятком є метод подвійних

антитіл, оскільки в цьому випадку етап розділення може займа-

ти більше 24 год.

Які способи застосовуються для розділення вільного і зв’язаного

ліганда?

Класифікація методів розділення запропонована Реткліф

(1974). Способи розділення вільного і зв’язаного ліганда, що за-

стосовуються в методах скріплення, нтакі:

1) електрофорез (крохмальний гель, ацетат целюлози, поліа-

криламідний гель);

2) гель-фільтрація (колонки або додання гелю в пробірку);

3) адсорбція (активоване вугілля, силікати, гідроксилапа-

тит);

4) фракційне осадження (етанолом, діоксаном, поліетилен-

гліколем, сульфітом натрію, сульфатом амонію, трихлороцтовою

кислотою);

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

384

5) методи подвійних антитіл (розчинна і тверда фази); іммо-

білізовані антитіла.

Електрофорез. Розділення вільного і зв’язаного ліганда при

цьому методі базується на тому, що комплекс ’’ліганд-зв’язую-

чий реагент’’ рухається до центру паперової смужки, а вільний лі-

ганд адсорбується на старті в точці нанесення інкубаційної сумі-

ші. Після висушування цієї смужки вимірюють радіоактивність

обох “плям” і визначають співвідношення радіоактивності зв’яза-

ної та вільної фракцій. Можна використати також електрофорез у

крохмальному, поліакриламідному гелі або ацетаті целюлози. Ме-

тод на загал має багато недоліків, тому зараз при радіотестуванні

in vitro він не використовується.

Гель-фільтрація. Молекули комплексу “ліганд-зв’язуючий

реагент” мають більш високу молекулярну масу, ніж молекули

незв’язаного ліганда. Це дозволяє використати для їх розділення

спосіб, що базується на принципі молекулярного сита із застосу-

ванням сефадексу чи біогелю. При цьому існують два прийоми: 1)

гелем заповнюють скляні колонки, що вельми незручно для ру-

тинних аналізів; 2) гель додають прямо в інкубаційну суміш, де

незв’язаний ліганд вільно розподіляється між внутрішнім про-

стором гранул і зовнішнім середовищем, а комплекс “зв’язуючий

реагент-ліганд” не може проникнути в гранули і концентрується

в навколишньому середовищі. Переваги методу: легке розділення

фракцій; немає необхідності в центрифугуванні. Недоліки мето-

ду: залежність від вмісту білка; час інкубації - критичний чинник,

він не повинен перевищувати час, вказаний в інструкції, оскільки

іонообмінники можуть захоплювати і комплекс “антиген-антиті-

ло”; розділення відбувається тільки в тому випадку, якщо молеку-

лярна маса вільного антигена менша ніж 100000 дальтон; в деяких

випадках сефадекс руйнує комплекс “антиген-антитіло”; колонка

непридатна для повторної роботи; для рутинного аналізу необхід-

но мати велике число колонок і велику кількість наповнювача.

Адсорбція. Для розділення вільного і зв’язаного ліганда ши-

роко застосовується неспецифічна адсорбція біологічних молекул

на поверхні частинок. При цьому адсорбуються тільки молекули

вільного ліганда, а молекули зв’язуючого агента і його комплексу

з лігандом такою здатністю не володіють. Найбільш широко за-

385

стосовуються методи адсорбції, в яких використовуються акти-

воване вугілля або силікати. З існуючих препаратів активованого

вугілля найбільш ефективним є вугілля марки Norit з максималь-

ними розмірами частинок 60 мкм.

До силікатів, що також використовуються для розділення,

відносяться тальк, Quso G-32 (Саlbiochem), фулерова земля і фло-

ризил. За принципом дії силікати практично не відрізняються від

активованого вугілля; те ж відноситься до переваг та недоліків

цього адсорбенту.

Гідроксилапатит, що використовується в деяких системах,

зокрема при радіоімунологічному аналізі стероїдів, адсорбує не

вільний, а зв’язаний ліганд.

До переваг адсорбційних методів відносяться висока швид-

кість, простота і невелика вартість, до недоліків - низька ефектив-

ність. При їх використанні доводиться ретельно підбирати умо-

ви аналізу (рН, температура, іонна сила, концентрація білка), щоб

уникнути адсорбції комплексу. Якщо комплекс володіє великою

швидкістю дисоціації, то адсорбент може конкурувати зі зв’язую-

чим реагентом за ліганд і спричиняти розщеплення комплексу. Тому

необхідне дуже точне дотримання часу інкубування, центрифугу-

вання і перенесення надосадової рідини в пробірку для радіометрії;

розливати реагенти треба дуже швидко, щоб варіації періоду ад-

сорбції в різних пробірках були мінімальними; всі стандарти і про-

би, що тестуються, необхідно центрифугувати одночасно.

Осадження. Осадження солями чи органічними розчинника-

ми (сульфат амонію, сульфат натрію, сульфіт натрію, хлорид на-

трію, етиловий спирт та ін. і водорозчинні полімери типу поліети-

ленгліколю) відноситься до способів фракціонування органічних

молекул. Розділяючий реагент додають у концентрації, за якої

зв’язуючий реагент та його комплекс з лігандом стають нерозчин-

ними і випадають в осад, а вільний ліганд залишається в розчині.

Аналізи проводять при нейтральному чи близькому до нейтраль-

ного значенні рН. У міру підвищення концентрації солі або орга-

нічного розчинника першими в осад будуть випадати речовини, у

яких ізоелектрична точка лежить в нейтральній області, а вже по-

тім будуть осідати інші речовини в порядку віддалення їх ізоелек-

тричної точки від нейтральної області. До переваг цього способу

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

386

можна віднести універсальність, швидкість, простоту і добре від-

творення результатів, до недоліків - нижчу чутливість порівняно

з методом подвійних антитіл.

Метод подвійних антитіл:

- антитіла прості в розчині без носія. При РІА для розділен-

ня застосовують осадження комплексу за допомогою повторних

антитіл, вироблених проти первинних, тобто зв’язуючого реаген-

та. Використовують повторні антитіла від різних видів тварин.

Ці антитіла, з’єднуючись з комплексом “первинне антитіло-ан-

тиген”, формують “великий” конгломерат молекул, який осаджу-

ється центрифугуванням. Повторне антитіло повинно володіти

специфічністю відносно γ-глобулінів того виду тварин, від яких

отримане перше антитіло. Після додання до інкубаційної суміші

повторних антитіл відбувається реакція імунопреципітації. Для

розділення за допомогою методу подвійних антитіл потрібна від-

носно висока концентрація повторних антитіл, тому їх завжди до-

дають разом з білком-носієм, що являє собою суцільну сироватку

або γ-глобуліни того виду тварин, від яких отримані перші анти-

тіла. При підборі кількості повторних антитіл і γ-глобулінів не-

обхідно враховувати такі чинники: 1) повноту осадження ком-

понентів комплексу “антиген-антитіло”; при надлишку першого

антитіла осадження міченого ліганда повинно бути близьким до

100%; 2) мінімальна кількість повторного антитіла, яке забезпе-

чує повне осадження, (при надлишку антитіл осад не утвориться);

3) величина неспецифічного з’єднання не повинна перевищува-

ти 5%; більш висока величина іноді зумовлена присутністю у по-

вторної антисироватки антитіл, специфічних відносно до ліганду;

4) система повторних антитіл повинна бути проведена в присут-

ності тієї рідини (тобто плазми і сироватки крові або сечі), яка за-

знає аналізу. Перешкоди, що викликаються в системі подвійних

антитіл плазмою або сироваткою крові, пояснюють присутністю в

цих рідинах високомолекулярних глобулінів та комплементу.

До переваг вказаного методу відносяться повне розділення

(95%), висока надійність (немає втрати комплексу “антиген-ан-

титіло” через дисоціації), велика специфічність, відсутність жор-

сткої залежності від часу, температури і вмісту білка, до недолі-

ків – утворення не дуже щільного легкого осаду й те, що після

387

центрифугування необхідно негайно видаляти надосадову ріди-

ну; потрібний додатковий час інкубації (іноді до 72 год.), що знач-

но збільшує загальну тривалість аналізу; важкість отримання ре-

агентів (оскільки кожний новий препарат необхідно піддавати

ретельній перевірці); вторинні антитіла використовуються у від-

носно високих концентраціях, їх кількості, отриманої від однієї

тварини, вистачає для невеликого числа аналізів;

- антитіла, фіксовані на рухомій твердій фазі. Антитіла кова-

лентно пов’язані з частками целюлози, сефарози або сефадексу,

фіксовані на скляних або пластмасових намистинках. Цей спосіб

дає хороше розділення, оскільки тверда фаза при центрифугуван-

ні утворить щільний осад; неспецифічне з’єднання мінімальне. До

недоліків методу потрібно віднести необхідність постійного збов-

тування під час інкубації та складності з розливом точної і рівної

кількості суспензії у всі пробірки;

- антитіла іммобілізовані. Зв’язуючий реагент, іммобілізова-

ний на дископодібних частинах полімерів і на стінках полімерних

пробірок. Поверхня пластинки володіє здатністю, зумовленою та-

кими видами взаємодії, як іонні, гідрофобні та ін. Ці види взає-

модії є менш міцними порівняно з ковалентними зв’язками, що

утворюються при застосуванні гранульованих твердофазних но-

сіїв. Метод зручний і простий у використанні, з його допомогою

досягається висока ефективність розділення зв’язаної і вільної

фракцій, оскільки першу можна добре промити. Однак чутливість

такої тест-системи низька, оскільки ділянки антитіла, зв’язані з

поверхнею пробірки, недоступні для реагента (особливо високо-

молекулярного).

Неминуча неоднорідність покриття стінок в різних пробір-

ках впливає на відтворення результатів у реплікатах однієї й тієї

ж проби. Врешті, з його допомогою неможливо оцінити не-

специфічне з’єднання.

На даний час розроблені нові варіанти методу, що дозволя-

ють зв’язувати антитіла з поверхнею пробірок ковалентним зв’яз-

ком. При цих варіантах можна використати спеціальні вкладиші

для пробірок, а також вводити в склад покриття пробірок мічений

ліганд; при проведенні аналізу потрібне тільки одне додавання ре-

агентів у тканини пробірки.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

388

Контроль якості та кількісна оцінка

Що представляє собою контроль якості тест-системи?

Контроль якості – суттєвий компонент рутинного застосу-

вання будь-якого тесту. При перевірці будь-якої нової тест-систе-

ми, а також використанні комерційних наборів бажано реалізу-

вати мінімальну програму: в кожну реакцію потрібно включати

декілька груп стандартів, щоби пересвідчитися у стабільності

стандартної кривої, а також декілька проб плазми з різними кон-

центраціями антигена для оцінки величини коливань результатів.

Корисну інформацію можна отримати при використанні різного

виду “blanks” (холостих) проб, що містять тільки окремі компо-

ненти даної тест-системи.

Кількісна оцінка включає: певні величини відтворення дея-

ких параметрів за калібрувальною кривою, порівняння форми

кривих і проходження спеціальних тестів на специфічність, точ-

ність, надійність.

Що представляє собою контроль якості тест-системи за калібрувальною

кривою?

Кращим способом побудови калібрувальних кривих є побу-

дова їх за типом

—

100%

при різних концентраціях стандартів. При цьому В

– макси-

мальне зв’язування, що приймається за 100%, оскільки в систе-

мі мічений “антиген-антитіло” немає конкурента В – С

, С

, тобто зв’язування в присутності різних концентрацій стан-

дартного антигена. У цьому випадку всі криві виходять з однієї й

тієї ж точки, тому якщо дана тест-система дає хороше відтворен-

ня результатів, калібрувальні криві, отримані з різними партіями

реагентів, повинні накладатися одна на одну. Робочий відрізок ка-

лібрувальної кривої - найбільш лінійна і стабільна частина кривої.

За характером варіацій робочого відрізка легко встановити сту-

пінь відмінностей наборів з однієї партії та наборів з різних пар-

тій реагентів. За концентраціями стандартів, відповідних

389

В В

—

•100=20% і — •100=80%,

визначають робочий відрізок, що забезпечує максималь-

ну точність аналізів (у цих межах кривої отримують результати

з найбільш високим відтворенням). Саме на цей відрізок повин-

на припадати концентрація антигена контрольної сироватки або

плазми. Таким способом можна встановлювати відтворення кри-

вих при аналізі якості реагентів з однієї або різних партій, а також

при порівнянні двох наборів різних виробників при умові одно-

значності принципу і тесту та способу побудови кривих.

Істотне значення має порівняння всіх параметрів калібру-

вальної кривої: Т, NSВ, В

, RS. Так, швидкість рахунку Т-проб

можна вважати задовільною, якщо коефіцієнт варіації не пере-

вищує 3%. Величину неспецифічного зв’язування визначають за

формулою:

NSВ

——— •100

При задовільному розділенні вільної та зв’язаної радіоак-

тивності вона не повинна перевищувати 5%. Величину зв’язуючої

здатності антитіла і будь-якого іншого зв’язуючого реагента виз-

начають за формулою:

——

•100%

В ідеалі цей параметр повинен бути близьким до 50%. Чим

він менший, тим нижча чутливість тест-системи, оскільки калі-

брувальна крива буде більш похилою, але її робочий відрізок по-

довжиться. При великому відсоткові з’єднання чутливість тест-

системи збільшиться, але робочий відрізок кривої скоротиться.

Наприклад, при В

=40% можна визначити концентрації раково-

ембріонального антигена в межах 5-320 мкг/л, при

——

•100%=60%

цей розмах скоротиться від 1,25 до 180 мкг/л, але в цих межах

чутливість підвищиться.

Спосіб розділення вільної та зв’язаної фракцій також впли-

ває на величину

Методи радіоімунологічного аналізу