Кравців Р.Й., Салата В.З., Семанюк В. І., Фреюк Д.В., Ярошович І. Г. Ветеринарна радіологія

Подождите немного. Документ загружается.

Ветеринарна радіологія

350

в сухі поліпропіленові пробірки, герметично закривають і за не-

обхідності тривалого зберігання ставлять у морозильну камеру -

20°С на 1,5-2 місяці. За потреби зберігання плазми до 24 год. мож-

на використати звичайний холодильник з температурою до - 8°С.

Розморожування плазми і повторне її заморожування недопусти-

ме, оскільки значно спотворює результати РІА.

Етапи радіоімунологічного аналізу

1) Методика рідкофазного радіоімунологічного аналізу

Який перший етап рідкофазного радіоімунологічного аналізу?

Всі реагенти знаходяться в рідкому стані.

До розчину антитіл додають мічений антиген і пробу, що мі-

стить невідому кількість неміченого антигену. Концентрацію ан-

титіл в реакційній суміші підбирають так, щоби число місць зв’я-

зування було набагато меншим, ніж загальне число антигенів.

Концентрація міченого антигену повинна перевищувати макси-

мально можливу концентрацію антигену в пробі.

Який другий етап рідкофазного радіоімунологічного аналізу?

Реакційну суміш інкубують при певній визначеній темпе-

ратурі. Мічений і немічений антигени конкурентно зв’язуються

з антитілами, при цьому утворюються імунні комплекси, що мі-

стять або мічений, або немічений антиген. Таким чином, до кінця

інкубації в реакційній суміші присутні мічені та немічені імунні

комплекси, а також вільні мічені та немічені антигени. Кількість

мічених імунних комплексів обернено пропорційна до кількості

неміченого антигену в досліджуваній пробі.

Який третій етап рідкофазного радіоімунологічного аналізу?

На третьому етапі рідкофазного радіоімунологічного аналізу

для кількісного визначення мічених імунних комплексів їх треба

відділити від вільного міченого антигену. Найрозповсюдженіши-

ми є два способи розділення:

351

1 спосіб – до реакційної суміші додають речовину, що підви-

щує її густину (наприклад, поліетиленгіколь).

2 спосіб – до реакційної суміші додають речовину з більшою

молекулярною масою, яка специфічно зв’язується з антитілами в

складі імунних комплексів. Для цього використовують інші анти-

тіла або стафілококовий білок А.

В обох випадках імунні комплекси, що мають більшу молеку-

лярну масу, аніж вільні антигени, осаджують центрифугуванням і

вимірюють радіоактивність осаду.

Який четвертий етап рідкофазного радіоімунологічного аналізу?

На четвертому етапі визначають концентрацію антигену в

невідомій досліджуваній пробі за калібрувальною кривою. Для її

побудови використовують декілька стандартних калібрувальних

сироваток з відомими концентраціями неміченого антигену.

2) Методика твердофазного радіоімунологічного аналізу

Яка особливість твердофазного радіоімунологічного аналізу?

При цій методиці антитіла є мобілізованими на водонероз-

чинному носієві – на полістирольних пробірках. Особливий різ-

новид цього методу – імунорадіометричний аналіз, в якому

використовують мічені антитіла, а не мічений антиген. У радіоре-

цепторному аналізі роль антитіла виконують реагенти, що специ-

фічно зв’язують речовину, яку треба визначити. Цими реагентами

можуть бути рецептори гормонів або зв’язуючі білки плазми. Так,

в радіорецепторному аналізі тиреостимулюючих і тиреоблокую-

чих аутоантитіл використовуються очищені рецептори ТТГ.

Як проводять підготовку реагентів для твердофазного радіо

імунологічного аналізу?

Всі реагенти стабільні строго до закінчення терміну придат-

ності, який вказаний на флаконі, за умови зберігання їх при тем-

пературі 2-8°С.

1. Розчинити контрольну сироватку, для чого довести флако-

ни, що містять її, до кімнатної температури і внести в кожен з них

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

352

по 1 мл дистильованої води.

Акуратно перемішати вміст флаконів. Піпетування зразків

можна проводити не раніше, ніж через 10 хвилин після їх розчи-

нення. Розчинені контрольні сироватки можна зберігати при тем-

пературі 2-8°С протягом доби. Для тривалого зберігання їх треба

заморозити при температурі - 20°С.

Вимоги точності проведених аналізів вимагають щоденної

обов’язкової постановки контрольних зразків паралельно з неві-

домими пробами.

2. Підготовка промивного розчину.

Перенести вміст флакону з концентратом промивного розчи-

ну в 500 мл дистильованої води і перемішати. Підготований таким

чином до роботи промивний розчин може зберігатися при темпе-

ратурі 2-8°С до закінчення терміну придатності РІА-набору.

Який порядок проведення імунорадіометричного аналізу?

Аналіз необхідно проводити в дублікатах.

Для проведення імунорадіометричного аналізу необхідно:

1. Довести реактиви до кімнатної температури.

2. Внести у пробірки по 100 мл калібрувальних проб, кон-

трольних проб та проб досліджуваних зразків.

3. У кожну пробірку додати по 100 мл мітки (моноклональних

антитіл, мічених йодом-125). Перемішати вміст пробірок, уника-

ючи утворення піни.

4. Окремо приготувати 2 пробірки для вимірювання загаль-

ної активності йоду-125 (Т) і внести в них по 100 мл мітки.

5. Інкубувати пробірки протягом 2 годин при кімнатній тем-

пературі (18-25°С) і постійному струшуванні.

6. Ретельно видалити вміст всіх пробірок (окрім проб Т).

7. Промити пробірки 2 мл промивного розчину (крім проб

Т). Негайно видалити рідину і повторити процедуру промивання.

Переконатися, що видалена вся рідина.

8. Виміряти швидкість випромінення йоду-125 у всіх пробір-

ках протягом 1 хвилини на гамма-лічильнику.

353

Як оцінюють результати імунорадіометричного аналізу?

Аналіз досліджуваних і калібрувальних проб повинен про-

водитися одночасно. Результати аналізу отримують за допомогою

калібрувальної кривої, яку треба ставити при кожній постановці.

Треба підкреслити, що діагностичне значення має тільки резуль-

тат при його правильній інтерпретації.

Які очікувані значення та оцінка результатів РІА?

На відміну від біологічних методів аналізу, РІА дає можли-

вість точно виміряти вміст речовини, яку визначають. Результат

РІА залежить тільки від співвідношення компонентів реакції “ан-

тиген-антитіло”.

Кожній лабораторії рекомендовано встановити свої власні зна-

чення рефенсних величин, беручи до уваги вікові та інші чинники.

Від яких чинників залежить надійність результату РІА?

Надійність результатів РІА залежить від аналітичних харак-

теристик набору, а саме:

• Чутливості. Чутливість набору РІА дуже висока. Деякі

методики виявляють дуже низькі концентрації речовин, аж до 10-

14 моль/л. Наприклад, набором ПСА (простатспецифічний анти-

ген) можна визначити рівень ПСА до 0,1 нг/мл.

Чутливість особливо важлива при вимірюванні базальних

концентрацій пептидних гормонів (ці концентрації звичайно зна-

ходяться в межах від 10-13 до 10-10 моль/л), а також при визна-

ченні гормонів непептидної природи, наркотиків та лікарських

засобів, ферментів, бактерійних і вірусних антигенів.

• Відтворюваності.

- всередині аналізу.

Аналіз визначення ПСА проводять з використанням 4 зраз-

ків сироватки крові (табл. 13.1).

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

354

Таблиця 13.1

Аналіз визначення ПСА всередині аналізу

Зразки сироватки крові

Сироватка 1 2 3 4

Кількість визначень 10 10 10 10

Середня концентрація, нг/мл 1,11 7,14 18,7 42,5

Коефіцієнт варіації, % 8,6 2,1 1,6 1,5

- між аналізами.

Аналіз визначення ПСА проводять з використанням 4 зраз-

ків сироватки крові (табл. 13.2).

Таблиця 13.2

Аналіз визначення ПСА між аналізами

Зразки сироватки крові

Сироватка А В С D

Кількість визначень 10 10 10 10

Середня концентрація, нг/мл 1,48 3,50 12,0 76,1

Коефіцієнт варіації, % 9,4 7,6 5,1 4,8

• Точно сті.

При розведенні проби виміряна концентрація речовини по-

винна зменшуватися пропорційно до ступеня розведення (тест на

розведення). На прикладі набору для визначення ПСА 3 зразки

сироватки крові розводять нульовою калібрувальною пробою і

проводять аналіз згідно з інструкцією (див. таблицю 13.2).

Тест на відкриття стандартної сироватки:

Різні кількості ПСА додають до 4 зразків сироватки крові і

проводять аналіз отриманих таким чином зразків (табл. 13.3).

355

Таблиця 13.3

Тест на відкриття стандартної сироватки

Зразок Розведення Теоретич. Виміряна “Відкриття”,

концентрація, концентрація,

нг/мл нг/мл %

1 нерозведен. - 11,5 -

2х 5,75 5,51 96,0

4х 2,88 2,62 91,0

8х 1,44 1,24 86,0

2 нерозведен. - 20,3 -

2х 10,2 10,2 90

4х 5,08 5,02 95

8х 2,54 2,38 100

3 нерозведен. - 82,0

2х 41,0 36,7 90

4х 20,5 19,5 95

8х 10,2 10,2 100

• Специфічності.

Специфічність РІА визначається специфічністю антитіл і мо-

же бути дуже високою. Отримано антитіла й розроблено методи-

ки РІА, що дозволяють диференціювати антигени з мінімальними

структурними відмінностями, наприклад:

- Т-3 і Т-4 розрізняються лише одним атомом йоду;

- Кортизол і кортикостерон розрізняються лише одним гі-

дроксильним радикалом;

- Інсуліни людини і свині розрізняються лише кінцевою амі-

нокислотою В-ланцюга;

- Інсуліни свині, кашалота і собаки мають однакову послі-

довність амінокислот, розрізняються лише за рахунок різної їх

конформації.

Від яких ще умов залежить надійність результату РІА?

Надійність правильності отриманого результату РІА зале-

жить також від таких умов: крива залежності рівня зв’язування

антитіл з міченим антигеном від концентрації антигену в пробі

повинна співпадати з калібрувальною кривою.

Якщо ці умови не виконуються, можна запідозрити, що на

імунохімічну реакцію, якою є РІА, впливають фактори:

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

356

А. Неспецифічного впливу на імунохімічну реакцію.

• рН. Швидкість реакції “антиген-антитіло” і стабільність

імунних комплексів звичайно не залежать від рН в інтерва-

лі 7,0-8,5. Як правило, в дуже кислому або дуже лужному се-

редовищі імунні комплекси дисоціюють, хоча деякі білки з

основними властивостями найкраще взаємодіють з антиті-

лами при рН 4,0-6,0. Тому для кожної системи РІА підбира-

ють оптимальне рН.

• Склад реакційної суміші також впливає на реакцію (анти-

ген-антитіло). Енергія взаємодії антигену з антитілом змен-

шується при високій концентрації солей у пробі чи в реак-

ційній суміші. Деякі лікарські засоби (наприклад, гепарин)

і бактерицидні препарати (тіомерсал) пригнічують імунохі-

мічну реакцію. Тому для розведення стандартів і проб вико-

ристовують той самий буферний розчин і враховують мож-

ливі ефекти компонентів реакційної суміші.

Б. Перехресна імунореактивність речовин з подібною будовою.

1. Гетерогенність молекулярних форм пептидних гормонів.

• Пептидні гормони синтезуються у вигляді білків-поперед-

ників, які перед викидом у кров проходять процесинг. При

цьому утворюється одна або декілька форм гормону, які во-

лодіють або не володіють біологічною активністю. Напри-

клад, при процесингові секретину і ВІП (вазоактивного ін-

тестинального пептиду) утворюється тільки одна біологічно

активна форма гормону. Навпаки, гастрин, що синтезуєть-

ся клітинами антрального відділу шлунку, поступає в кров

як у вигляді зрілого гормону, що складається з 17 амінокис-

лот, так і у формі біологічно активного попередника, який

містить 34 амінокислоти. Обидва пептиди визначаються од-

нією системою РІА.

• На результати РІА впливають біологічно неактивні молеку-

лярні фрагменти гормонів, такі як С-кінцевий фрагмент ПТГ

(паратгормону). Концентрація цього фрагмента в сироватці

в нормі перевищує концентрацію зрілого ПТГ (ПТГ1-84), а

при хворобах нирок суттєво збільшується (навіть у хворих

без вторинного гіперпаратиреозу). Оскільки для визначен-

ня ПТГ звичайно використовують антитіла до С-кінцевого

357

фрагмента, правильна інтерпретація результату потребує

оцінки функції нирок.

Концентрацію ПТГ1-84 у плазмі можна визначити за до-

помогою високочутливого імунорадіометричного методу,

який базується на використанні двох різних антитіл: до С- і

N-кінцевого фрагментів ПТГ.

Антитіла до С-кінцевого фрагменту іммобілізують на полі-

мерному носії. Потім додають проби або стандарти і мічені

йодом-125 антитіла до N-кінцевого фрагмента ПТГ. Анти-

тіла, мобілізовані на носієві, зв’язують як С-кінцевий фраг-

мент, так і ПТГ1-84..Такий підхід використовують також в

інших випадках, коли у пробі присутні молекулярні фраг-

менти гормону.

• У тварин різних видів первинні структури одного й того ж

пептидного гормону можуть бути ідентичними. Але частіше

вони відрізняються за однією або декількома амінокислота-

ми. Амінокислотні заміни виникають у результаті мутацій і,

як правило, локалізуються в ділянках молекули гормону, що

не відіграють першорядної ролі в його біологічній активно-

сті. Відмінності в первинній структурі визначають імуноре-

активність гормону.

2. Гетерогенність інших сполук.

• Лікарські засоби і наркотики. Речовини, які структурно

подібні з препаратом, і його метаболіти можуть зв’язувати-

ся або не зв’язуватися з антитілами. Якщо вимірюють вміст

токсичного препарату, то необхідно знати, чи дана методи-

ка виявляє тільки активну форму препарату. Навпаки, як-

що треба довести вживання наркотику, то відмінності в іму-

нореактивності між самим наркотиком і його метаболітами

можна не враховувати. Таким чином, вимоги до специфіч-

ності РІА залежать від мети аналізу.

• Ферменти. РІА дозволяє вимірювати вміст ферменту, але не

його активність. Інгібітори й активатори ферменту та при-

сутність субстрату не впливають на результат. В одній і тій

же системі можна визначати як сам фермент, так і профер-

мент та інші неактивні форми ферменту. Залежно від мети

дослідження, ці особливості методу можуть відігравати по-

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

358

зитивну або негативну роль, оскільки багато ферментів ма-

ють видову специфічність, а біологічна активність ферменту

не обов’язково корелює з його імунохімічною реактивністю.

Тому РІА треба розглядати як доповнення до методу аналізу

ферментів, який ґрунтується на їх активності, а не як підмі-

ну цих методів.

Особливості застосування РІА в клініці

В основі визначення багатьох сотень ендогенних та екзоген-

них речовин лежить спільний принцип, але вимоги до чутливості

методу і діагностичне значення результатів відрізняються.

Що необхідно враховувати при застосуванні РІА в клініці?

При застосуванні РІА в клініці необхідно враховувати:

А. Концентрації деяких пептидних гормонів у однієї і тієї ж

людини коливаються в дуже широкому діапазоні: під впливом

стимуляторів або інгібіторів секреції і залежно від періоду доби

рівень гормону може змінитися на 1-2 порядки. В таких випад-

ках результати РІА самі по собі не мають першочергового значен-

ня для діагнозу.

Б. Концентрацію гормону треба співставити з концентрація-

ми речовин, метаболізм яких регулюється цим гормоном, а також

тих речовин, котрі регулюють його секрецію. Наприклад, продук-

ція інсуліну при підвищеній концентрації глюкози і деяких аміно-

кислот в крові та зниження при гіперглікемії. Рівень СТГ (сомато-

тропний гормон) зростає при стресі і гіпоглікемії та знижується

при гіперглікемії. Високий рівень АКТГ (адренокортикотропний

гормон) у плазмі на фоні зниженого рівня кортикостероїдів свід-

чить про первинну наднирникову недостатність; якщо ж уміст

кортикостероїдів підвищений, слід запідозрити гіпофізарний син-

дром Кушинга.

Для уточнення результатів РІА необхідно застосовувати

функціональні проби з навантаженням.

В. При визначенні непептидних гормонів (зокрема, стероїд-

них і тиреоїдних) чутливість методу має першочергове значення,

оскільки в нормі концентрації цих гормонів дуже низькі.

359

Г. При визначенні концентрацій лікарських засобів, особливо

препаратів з вузьким терапевтичним діапазоном, також необхід-

ною є висока чутливість РІА.

Д. При визначенні антигенів вірусів та мікроорганізмів (та-

ких, як антиген вірусу гепатиту В або туберкулопротеїд) треба

враховувати, що їх абсолютна концентрація в будь-якій біологіч-

ній рідині залежить не тільки від важкості інфекції, але й від ін-

ших факторів, в тому числі від способу отримання матеріалу.

Е. Біологічна активність гормону, його фрагмента чи анало-

га далеко не завжди відповідає його імунохімічній реактивності.

Щоби за результатами РІА судити про біологічну активність гор-

мону, треба знати, в яких молекулярних формах існує гормон і які

з них можна визначити за допомогою РІА.

Яке обладнання необхідне для проведення радіоімунного аналізу?

Стандартне лабораторне обладнання для виконання радіоі-

мунних аналізів включає такі прилади: центрифуга, точні мікро-

піпетки, гамма-лічильник, горизонтальний шейкер, водяна баня,

вортекс (вихровий змішувач), система для відсмоктування рідини

з пробірок (водоструменевий насос).

Мікропіпетки, що застосовуються для проведення піпетку-

вання (рис. 13.2) повинні пройти метрологічну атестацію один раз

у рік в бюро метрології і стандартизації.

Рис. 13.2. Мікропіпетки.

Використання неатестованих піпеток приводить до непра-

вильних результатів та поганої відтворюваності.

У лабораторних умовах перевірку піпеток на точність і від-

Методи радіоімунологічного аналізу