Кравців Р.Й., Салата В.З., Семанюк В. І., Фреюк Д.В., Ярошович І. Г. Ветеринарна радіологія

Подождите немного. Документ загружается.

Ветеринарна радіологія

340

же пояснюватися й тим, що антитіло не здатне розрізнити антиге-

ни внаслідок їх структурної подібності. Остання імовірність тим

менша, чим специфічніше антитіло.

Більшість антитіл, виявлених у крові, відносяться до підкла-

су імуноглобулінів G (IgG), які є двовалентними. Це означає, що

вони здатні взаємодіяти з двома ідентичними молекулами анти-

гену. Антигени можуть бути одно-, дво- або полівалентними. Ва-

лентність антитіл і антигенів у значній мірі визначають тип реак-

ції, яка буде відбуватися між ними в системі in vitro. Полівалентні

антигени можуть комплексувати з двовалентними антитілами,

утворюючи тримірні гратчасті структури, які дають преципітати

й агрегати. При надлишку антитіл комплекси, що утворюються, є

нерозчинними. При розчиненні антигену, що зазвичай має місце

в класичних реакціях РІА, утвориться розчинний комплекс. То-

му при радіоімунологічних процедурах цей комплекс необхідно

виділяти з розчину за допомогою тих або інших способів, напри-

клад, осадженням антиімуноглобуліновою сироваткою.

Яка хімічна основа радіоімунологічного аналізу?

Радіоімунологічні реакції підпорядковуються фундаменталь-

ним правилам хімії. Якщо в розчині присутні тільки Аг (антиген)

і специфічне Ат (антитіло), то між ними встановлюється динаміч-

на рівновага (див. Закон дії маси):

Аг+Ат — АгАт ,

при якій:

zAm] k

——————— = —— = К,

z][Am]

де

- константи відповідно прямої та зворотної реакції;

[Аг], [Ат], і [АгАт] – відповідно молярні концентрації антиге-

ну, антитіла та комплексу антиген-антитіло;

К – константа асоціації або рівноваги в напрямку утворення

комплексу АгАт.

Константи швидкостей виражаються одиницями л/с, л/год і

341

т.д. Їх можна розглядати як імовірність здійснення реакції. Так, як-

що k1 більше від k2, реакція буде прагнути йти праворуч, до утво-

рення продукту АгАт. У цьому випадку К буде більше 1. Знання

констант рівноваги і концентрації реагентів у рівновазі дозволяє

розрахувати вихід продукту.

Хоча точна природа взаємодії антиген-антитіло залишається

невідомою, вважають, що система досягає рівноваги під час інку-

баційної фази. Згідно із законом дії маси, якщо К рівна констан-

ті рівноваги, то

К [Аг] [Ат]=[АгАт],

при умові рівноваги відношення зв’язаного антигену до віль-

ного В/F=[АгАт]/[Аг]

де В – зв’язаний і F – вільний антигени.

При типовій радіоімунологічній процедурі концентрація

вільного антигену й антитіла, що знаходиться в рівновазі, опису-

ється рівняннями:

[Аг]=[Аг

– АгАт] і [Ат]=[Ат

- АгАт]

де Аг і Ат – початкові концентрації компонентів. Звідси істин-

не відношення зв’язаного антигену до вільного антигену опису-

ється:

В/F=[АгАт]/[Аг

- АгАт].

Для РІА використовується мічений радіонуклідом антиген,

який поводиться так само, як холодний, тому:

В*/F*= [Аг*-Ат]/(Аг

* - Аг*Ат],

де Аг

* – початкова кількість міченого антигену,

Аг*Ат – кількість зв’язаного з антитілом міченого антигену.

Джерелом радіоактивного АгАт в реакції радіоімунотесту-

вання є Аг+Аг*+Ат⇔Аг*Ат+АгАт. Звідси очевидно, що якщо кон-

центрація неміченого Аг буде збільшена при постійній концен-

трації міченого Аг*, перший займе більше число зв’язуючих місць

антитіла. Результатом цього буде зниження концентрації зв’яза-

ного міченого антигену (Аг*Ат). Отже, відношення

В*/F*=[Аг*Ат]/[Аг

* - Аг*Ат]

повинно зменшуватися у міру збільшення в реакційній сумі-

ші холодного антигену. Оскільки немічений антиген отриманий

від пацієнта, В*/F* відображає кількість речовини, присутньої в

пробі, що тестується. Зміна цього відношення максимальна то-

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

342

ді, коли концентрація антигену мала порівняно з концентрацією

антитіла.

Для радіоімунологічної процедури вважається достатнім 50%

скріплення міченого антигену у відсутності холодного антигену.

Якщо константа рівноваги є низькою, кількість антитіл, необхід-

них для адекватного з’єднання антигену, повинна бути збільшена.

Разом з тим, якщо оцінюється конкуренція холодного і мічено-

го антигенів за антитіло, надлишок вільного антитіла буде значно

знижувати дію холодного антигену в системі. Чутливість тесту-

системи для холодного антигену виявиться низькою і в тому ви-

падку, якщо мічений антиген має низьку питому радіоактивність.

У цій ситуації для задовільного з’єднання міченого антигену та-

кож знадобиться ввести в систему більше антитіл.

Чим відрізняються між собою радіоімунологічні методи?

При класифікації радіоімунологічних методів за основу бе-

руть природу зв’язуючого агента:

• радіоімунологічний аналіз (РІА) – зв’язуючим агентом слу-

жать специфічні до досліджуваного ліганду антитіла;

• методи білковоконкурентного зв’язування – зв’язуючим

агентом є специфічні білки сироватки крові (глобуліни, що абсор-

бують тироксин, кортикостероїди і статеві гормони);

• метод радіорецепторного аналізу – для зв’язування вико-

ристовуються природні клітинні рецептори. Цей метод має дуже

високу чутливість, але може застосовуватися для визначення тіль-

ки тих речовин, до яких в тканинах є специфічні рецептори. Так, в

радіорецепторному аналізі тиреостимулюючих і тиреоблокуючих

антитіл використовуються очищені рецептори ТТГ, а для визна-

чення рівня вільного Т-4 іноді застосовується тироксинів зв’язу-

ючий глобулін;

• імунорадіометричний метод – найбільш поширений в су-

часній лабораторній діагностиці – в якості зв’язуючого агента ви-

користовуються мічені радіонуклідами антитіла (а не мічений анти-

ген), фіксовані на твердофазному носієві, наприклад, полістиролі.

Спільними якостями всіх вищеперерахованих методів є ви-

343

сока чутливість, що обумовлена використанням радіометричних

методів реєстрації мічених радіонуклідами лігандів, а також висо-

кою специфічністю.

Які реагенти використовують для радіоімунологічного аналізу?

Для проведення радіоімунологічного дослідження необхід-

ний добре очищений ліганд (антиген). Його отримують з біоло-

гічного матеріалу очищенням методами гель-хроматографії, іо-

нообмінної хроматографії, електрофорезу або шляхом хімічного

синтезу. Ліганд високого ступеня чистоти порівнюють з відповід-

ним міжнародним стандартом і використовують для приготуван-

ня стандартної кривої, отримання міченого ліганду та імунізації

тварин з метою створення специфічних антисироваток. Розведе-

ні стандарти розливають в ампули, швидко заморожують в рід-

кому азоті й зберігають при температурі до -20°С тривалий час.

Повторні розморожування і заморожування стандартів не реко-

мендуються, тому що вони призводять до руйнування біологічно

активних речовин.

Другим реагентом, необхідним для проведення РІА, є міче-

ний радіонуклідом ліганд з високою питомою активністю.

У імунологічних дослідженнях, як правило, використовують

джерела бета-часток (

Н,

С) або гамма-променів (

Сr,

125

131

I).

Тритій (

H) – бета-випромінювач з періодом піврозпаду 12,46

років. При бета-розпаді тритій перетворюється в гелій. Макси-

мальна енергія бета-частинок тритію досягає 0,018 МеВ. Пробіг

бета-частинок в повітрі дорівнює 0,008 м, максимальна проника-

юча здатність у м’яких тканинах – 0,008 мм. Під дією тритію в ор-

ганізмі порушується швидкість біохімічних реакцій, змінюється

структура молекул, відбувається їх іонізація.

Вуглець (

С) – бета-випромінювач з періодом піврозпаду

5568 років. При розпаді перетворюється у стабільний ізотоп азо-

ту. Максимальна енергія частинок – 0,155 МеВ. Пробіг частинок в

повітрі – 0,26 м, максимальна проникаюча здатність у м’яких тка-

нинах – 0,3 мм. При попаданні в організм може викликати різного

роду радіаційні ураження і зміну біохімічних процесів.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

344

Хром (

Сr) – перетворюється в стабільний ізотоп ванадію з

випущенням гамма-кванта. Період піврозпаду – 27,8 днів. Енергія

квантів при розпаді – 0,34-0,62 МеВ. Пробіг гамма-квантів в пові-

трі – 60 м, проникаюча здатність у м’яких тканинах – 80 мм. Не-

безпека

Сr зумовлена його гамма-випромінюванням. При роботі

з ним потрібно користуватися свинцевим захистом.

Речовини білкової чи пептидної природи, що містять аміно-

кислоти тирозин чи гістидин, мітять радіоактивним йодом. Ато-

ми йоду заміщують атоми водню в ароматичних кільцях бокових

ланцюгів молекули. При цьому зовнішня мітка входить у молеку-

лу ліганду. Коли радіонуклідом вибору є йод, перевагу надають

ізотопові йод-125. Він має достатньо довгий період піврозпаду

– 60 днів і, отже, тривалий термін використання. Низька енергія

гамма-випромінювання йоду-125 обумовлює більш високу ефек-

тивність реєстрації гамма-квантів сцинтиляційним кристалом,

що дозволяє використовувати менші кількості нукліду та спри-

яє зниженню опромінення персоналу, який виконує радіоімуно-

логічні дослідження.

Мітка лігандів (антигенів) йодом-125 достатньо нескладна

при наявності відповідного обладнання.

В ліганди, що не мають у своїй структурі тирозину чи гісти-

дину, вводять внутрішню мітку, при цьому атом водню заміщуєть-

ся атомом тритію (Н-3). Це, як вказувалося вище, чистий випро-

мінювач бета-частинок з дуже низькою енергією (18 кеВ) і досить

тривалим періодом піврозпаду (12,46 роки). Мітити ліганди Н-3

надзвичайно складно, цей процес можна здійснити лише в про-

мислових умовах шляхом хімічного, біологічного синтезу або ну-

клідного обміну.

Кожна мітка має як свої переваги, так і свої недоліки.

Недоліки мічення лігандів (антигенів) йодом-125:

• мітка йод-125 нестійка і при тривалому зберіганні відще-

плюється;

• у процесі мічення речовина пошкоджується, в результаті

чого знижується її спорідненість із зв’язуючим реагентом.

Переваги мічення лігандів (антигенів) йодом-125:

• отримання сполук з високою питомою радіоактивністю

(2000-4000 ГБк/ммоль);

345

• простота радіометрії проб, для цього необхідний лише

сцинтиляційний гамма-лічильник.

Переваги мічення лігандів (антигенів) Н-3:

• дає можливість тривалого зберігання мічених речовин (до

3-6 міс.), однак отримані при цьому ліганди мають низьку питому

вагу (до 100 ГБк/ммоль).

Недоліки мічення лігандів (антигенів), мічених Н-3:

• значно зростає вартість дослідження, тому що вимагає до-

рогих за ціною сцинтиляційних β-лічильників, сцинтиляційної

рідини, до складу якої входить розчинник і речовини, що мають

властивість флуоресціювати під впливом іонізуючого випроміню-

вання;

• використання розчинників, що містять ароматичні сполуки.

Третім реагентом, що бере участь у радіоімунологічній реак-

ції, є антисироватка, що містить специфічні до ліганду антитіла.

Яким чином отримують мічені йодом-125 ліганди (антигени)?

В основу методів йодування лігандів покладене перетворен-

ня від’ємного іону йоду, який має слабку реакційну здатність, у

вільний йод, що є більш реакційно здатним.

Найширше для йодування лігандів застосовується метод із

застосуванням хлораміну Т, розроблений Хантер; Грінвуд (1962).

Він ґрунтується на сильних окисних властивостях хлораміну Т і

дозволяє швидко провести мітку антигену йодом-125.

Для виконання йодування необхідні наступні реагенти: натрій-

йод-125 без носія (74 МБк) з питомою активністю 3,7-7,4 ГБк/мл,

0,5 М фосфатний буфер (2,4 мг/мл), йодид калію у фосфатному

буфері (10 мг/мл), ліганд, який треба визначити (2,5-5 мкг в 0,01

мл фосфатного буфера). Розчин хлораміну Т у фосфатному буфері

готують безпосередньо перед використанням і зберігають у тем-

ному місці.

У конічну колбу об’ємом 3-5 мл вносять 74 МБк натрій-йод-125,

по 0,025 мл фосфатного буферу і розчину ліганда. Після швидко-

го струшування додають 0,025 мл хлораміну Т і знову струшують

протягом 20-30 с.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

346

Реакцію зупиняють додаванням 0,1 мл 2,5% розчину альбу-

міну бичачої сироватки у фосфатному буфері. Очистку міченого

ліганду і відділення від непрореагованого радіоактивного матері-

алу проводять методом гель-хроматографії на колонці (1х15 см),

заповненій сефадексом G-50, яка попередньо була промита фос-

фатним буфером, що містить 0,5% розчин альбуміну бичачої си-

роватки. Елюцію проводять тим же буфером. Елюати збирають у

пробірки фракціями по 0,5 мл. Після розрахунку питомої актив-

ності міченого ліганда його розливають в ампули і зберігають при

температурі, не вищій ніж -20°С до моменту використання.

Лактопероксидазний метод йодування кращий від методу із

застосуванням хлораміну Т тим, що при його застосуванні менше

пошкоджується мічений ліганд. При використанні ферменту лак-

топероксидази ліганд не підлягає дії великих концентрацій окис-

нювача. Реакція припиняється розведенням розчину без застосу-

вання відновника.

Для проведення йодування цим методом необхідні: 100 мкг

лактопероксидази, розчиненої в 0,5 мл 0,4 М натрій-ацетатного

буфера, яка зберігається в замороженому стані при температурі -

20°С, 74 МБк натрій-йод-125 з питомою активністю 3,7-7,4 ГБк/мл,

0,4 М натрій-ацетатний буфер (рН 5,6), ліганд, що підлягає йоду-

ванню (2,5-5 мкг в 0,01 мл фосфатного буфера), розчин перекису

водню (1:50000).

У конічну колбу, що містить розчин ліганда, додають 0,025 мл

0,4 М натрій-ацетатного буфера, 100-250 нг лактопероксидази, роз-

чиненої в 0,1 мл розчину перекису водню (600 нг). Вміст колби ста-

ранно перемішують і через 5 хвилин додають ще 0,1 мл (600 нг) роз-

чину перекису водню. Через 15 хв. після йодування мічений ліганд

очищають методом гель-хроматографії на колонці (1

×15см) з сефа-

дексом G-50 в 0,5 М фосфатному буфері (рН 7,5), що містить 0,5%

розчин альбуміну бичачої сироватки. Елюцію проводять так, як бу-

ло описано вище при використанні хлораміну Т. При застосуванні

лактопероксидазного методу приготування реагентів та умови про-

ведення реакції більш складні, ніж при використанні хлораміну Т.

347

Що представляють собою специфічні до ліганда антитіла?

Антитіла виявляються серед β- і γ-глобулінів при електрофо-

ретичному розділенні плазми і білків (імуноглобулінів).

Найбільша кількість антитіл міститься в імуноглобулінах G.

Вони утворюються β-лімфоцитами та плазмоцитами при специ-

фічній штучній імунізації лігандами, які підлягають визначенню.

Імуногенністю відзначаються антигени з високою молеку-

лярною масою (понад 1000). Ступінь її збільшується прямо про-

порційно до росту молекулярної маси.

Низькомолекулярні речовини (гаптени) здатні зв’язувати-

ся із специфічними антитілами, але не викликають імунної від-

повіді. Для отримання специфічних антитіл до речовин з молеку-

лярною масою менше 1000 необхідним є хімічне зв’язування їх з

більш крупними білковими молекулами типу альбуміну.

Яким чином отримують антисироватку?

Антисироватку, що містить специфічні тіла до ліганда, от-

римують шляхом імунізації тварин речовинами, що мають іму-

ногенні властивості. На моноспецифічність та афінітет антитіл

впливають:

• природа й доза імуногену;

• вид тварини, яку використовують для імунізації;

• ступінь чужорідності антигену;

• спосіб введення препарату;

• вид ад’юванта;

• періодичність імунізації;

• час отримання антисироватки.

Однією з найважливіших властивостей антитіл, яка дозволяє

виявляти найменші відмінності у подібних між собою молекулах,

є специфічність антитіл. Вона залежить від структури антитіл і

реагуючого ліганда.

Другою властивістю є афінітет – спорідненість антитіла до

антигена. Антитіла можуть реагувати з великою кількістю спо-

ріднених між собою лігандів з різною константою спорідненості.

Деякі молекули антитіла мають дуже низьку спорідненість до лі-

ганда, який індукував їх утворення, і тому можуть взаємодіяти

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

348

з іншими лігандами, що називається перехресною реактивністю.

Перехресна реактивність пояснюється нездатністю антитіл роз-

різняти антигени через їх структурну подібність.

Вибір тварини для отримання антисироватки залежить від

кількості необхідної антисироватки. Найчастіше використовують

дрібних лабораторних тварин (гвінейських свинок, кроликів, бі-

лих щурів), а за необхідності виготовлення великої кількості си-

роватки – великих тварин (кіз, ослів, коней). Вони більше підхо-

дять для отримання преципітуючої антисироватки, що містить

вторинні антитіла. Для імунізації найчастіше використовують

50-100 мкг хімічно чистого ліганда. Для сповільнення всмокту-

вання ліганда і посилення утворення специфічних антитіл анти-

гени вводять в організм тварини разом з ад’ювантами.

Вид ад’юванта – найчастіше використовують повний ад’ювант

Фрейда, який складається із суміші мінеральної олії, детергенту, вби-

тих мікобактерій. Щоби отримати водно-олійну емульсію, водний

розчин імуногена емульгують у двох-трьох об’ємах ад’юванта.

Періодичність і спосіб імунізації – найефективнішим є вну-

трішньошкірне введення імуногенного розчину. Доцільно вводи-

ти малі його дози (біля 0,025 мл) у велику кількість точок. Такий

спосіб введення дає швидку і максимальну імунну відповідь на-

віть після одноразової імунізації, що дозволяє зекономити час та

імуноген. При множинних внутрішньошкірних ін’єкціях макси-

мальні титри антитіл з’являються через 8-10 тижнів і залишають-

ся високими тривалий час.

Підшкірне введення, хоча і менш ефективне, проте широко

застосовується для отримання антисироватки. Емульсію ділять на

3-4 порції і вводять у різні точки. Повторну імунізацію зазвичай

проводять двічі з інтервалом 2-3 тижні.

Кров для отримання антисироватки беруть через 2-3 тижні

після третьої ін’єкції імуногенної суміші. Визначають титр анти-

тіл, потім антисироватку розводять буферним розчином до опти-

мального титру, розливають в ампули і зберігають при температу-

рі, не вищій ніж -20°С до вживання.

Оптимальний титр антисироватки, що застосовується для

радіоімунного аналізу, встановлюють шляхом інкубації різних її

розведень з міченим лігандом. З метою отримання найвищої чут-

349

ливості методу використовують мінімальне розведення антиси-

роватки, яка при відсутності неміченого ліганда зв’язує біля 50%

міченого ліганда.

Які буферні розчини використовують для проведення радіоімунного

аналізу?

Для проведення радіоімунного аналізу необхідні також і бу-

ферні розчини. Найчастіше застосовують такі буферні розчини:

- фосфатний;

- барбітуратний;

- боратний;

- тріс-буфер.

Характер буферного розчину не має суттєвого значення, але

його рН не повинно значно відрізнятися від рН нейтрального

розчину (допустимі межі 7,4- 8,6). Оскільки висока концентрація

солей перешкоджає реакції “антиген-антитіло”, іонна сила буфер-

ного розчину повинна бути низькою (0,01-0,1 моль). Буферний

розчин не повинен містити мікроорганізми, тому до нього дода-

ють мертиолат (0,1 мг/мл) чи азид натрію (0,2-1 мг/мл). Буферні

системи в деяких випадках містять білок (альбумін бичачої сиро-

ватки, желатин або вільну від ліганда плазму).

Для зменшення пошкодження речовин білкового походжен-

ня до буферного розчину додають інгібітори ферментів, аналогіч-

них до трипсину – трасилол, контрикал по 20 КО/мл (КО-каллі-

креїнові одиниці).

Які особливості забору біологічного матеріалу для проведення

радіоімунного аналізу?

Кров для РІА забирається зранку натще в умовах фізіологіч-

ного спокою. Її набирають в попередньо охолоджені центрифуж-

ні пробірки, що містять гепарин або натрієву сіль ЕДТА (1 мг/мл).

Для попередження руйнування речовин білкового походження

протеолітичними ферментами при заборі використовують одно-

разові голки без шприца (так званий метод забору крові самото-

ком у пробірку). Після цього пробірки легко струшують, центри-

фугують при температурі - 4°С, плазму крові переносять порціями

Методи радіоімунологічного аналізу