Кравців Р.Й., Салата В.З., Семанюк В. І., Фреюк Д.В., Ярошович І. Г. Ветеринарна радіологія

Подождите немного. Документ загружается.

Ветеринарна радіологія

370

1,05; 0,9; 1,05. Виробляються сцинтиляційні рідини з підвищеною

атомною масою (елементвмісні сцинтилятори) для детектування

нейтронів, високоефективні рідини з низькою пружністю пари і т.д.

Радіорецепторне тестування

Що представляє собою радіорецепторне тестування?

При цьому методі як зв’язуючі реагенти використовують рецеп-

тори. Уперше метод був використаний для визначення вмісту естро-

генів. Зв’язуючим реагентом служив цитозоль клітин матки. Леф-

кович (1970) використав цитозоль адренокортикальних клітин для

визначення рівня кортикотропіну. Кет і співавт. (1972) розробили

спосіб радіорецепторного тестування плазми крові на присутність

гонадотропінів. Оскільки гормони діють за допомогою рецепторних

місць на клітинній мембрані або в цитоплазмі клітин, ці ділянки ви-

являють дуже високу специфічність у взаємодії з гормонами. Крім

цього, вони, як правило, володіють високою константою споріднено-

сті. Врешті, істотним моментом є те, що вони визначають не імуно-

логічну, а біологічну активність гормонів. Останнє особливо важли-

ве тоді, коли необхідно виміряти рівень активної форми речовини,

тобто система радіорецепторного тестування найбільш близько ві-

дображає істинно фізіологічний зміст результату, що одержується.

Радіорецепторне тестування успішно застосовується для ви-

мірювання концентрації естрогенів, кортикотропного гормону гі-

пофіза, пролактину, лютеотропного гормону, хоріонічного гона-

дотропіну, інсуліну, глюкагону, гормону росту, цАМФ та ін.

Цей метод вимагає використання клітинної системи, яка мі-

стить рецептори для речовини, що визначається. Наприклад, жи-

рова клітина має мембранні рецептори для кортикотропного і ти-

реотропного гормонів гіпофіза, адреналіну і глюкагону.

Стероїдні гормони зв’язуються внутрішньоклітинними ре-

цепторами. Тому способи приготування тканинних рецепторів

можуть бути різними. Наприклад, для вимірювання рівня естро-

генів гомогенізують тканину кролячої матки і за допомогою цен-

трифугування виділяють цитозольну фракцію, що містить естро-

генові рецептори. Цю фракцію використовують як зв’язуючий

371

реагент, за яким в інкубаційному середовищі конкурують радіо-

активний і холодний естрадіол. Потім зв’язаний і вільний компо-

ненти розділяють та вимірюють радіоактивність одного з них.

Які переваги методу радіорецепторного тестування?

До переваг методу радіорецепторного радіотестування від-

носяться:

1) висока константа спорідненості;

2) унікальна специфічність зв’язуючого агента, рецептора;

3) можливість визначення величини біологічної активності

речовини (оскільки рецептор розпізнає тільки його біологічно ак-

тивну ділянку);

4) перехресна реактивність рецепторів від різних видів ссав-

ців (що дозволяє використати тканини тварин для тестування

плазми крові людини);

5) можливість використання однієї і тієї ж тканини для при-

готування різних зв’язуючих рецепторних реагентів.

Які недоліки методу радіорецепторного тестування?

До недоліків методу відносяться:

1) нестабільність зв’язуючих ділянок рецептора, які легко

ушкоджуються в процесі приготування препарату;

2) погана розчинність рецептора;

3) функціональна специфічність рецепторів може розповсюд-

жуватися на молекули, що значно відрізняються хімічно (напри-

клад, тривало діючий тиреоїдний стимулятор дає перехресну реак-

цію при радіорецепторному тестуванні тиреотропного гормону);

4) деякі рецептори, розташовані на клітинній поверхні, не бе-

руть участі в біологічній відповіді клітини, що викликає сумніви

в їх функціональній специфічності;

5) радіорецепторне тестування можна використати тільки

для речовин, що мають тканинні рецептори;

6) застосування складної методики для отримання препаратів

рецепторів може приводити до значних відмінностей в результатах;

7) більш жорсткі вимоги до чистоти міченого ліганда, ніж у

випадку РІА.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

372

Радіотестування IN VITRO

Що представляє собою радіотестування речовин in vitro?

Радіотестування in vitro – узагальнене поняття для різних

методів визначення вмісту речовини поза організмом, у пробірці,

маючи на увазі обов’язкову наявність серед реагентів, необхідних

для такого вимірювання, речовини, міченої радіоактивним нуклі-

дом (ізотопом).

Для позначення варіантів цього методу часто використову-

ється різна термінологія, що може привести до помилки. Напри-

клад, такі назви, як сатураційний замінний аналіз відносяться до

визначення принципу, що лежить в основі РІА, а терміни радіо-

імунологічний, імунорадіометричний, радіолігандний і радіоре-

цепторний аналізи відносяться до позначення реагентів, що ви-

користовуються в реакції.

Радіоімунотестування як метод вимірювання залежить від

ступеня подібності поведінки стандартної та вимірюваної суб-

станції (Екінс, 1974). Процедура дослідження при цьому вклю-

чає внесення міченої речовини в пробірку, що містить зв’язуючий

компонент і пробу, що аналізується, проведення деяких маніпу-

ляцій та кінцеву радіометрію проб.

Метод радіотестування in vitro є високоспецифічним і на по-

рядок більш чутливим, ніж будь-які інші лабораторні методи ана-

лізу. Він швидко завоював широке визнання і в деяких областях

медицини (наприклад, в ендокринології) практично витіснив всі

колишні способи вимірювання концентрацій біологічно активних

речовин. Чималу роль у впровадженні радіотестування in vitro в

медицину зіграла поява розроблених комерційних наборів (kits),

укомплектованих міченою речовиною, стандартом, зв’язуючим і

розділяючим компонентами. Зараз способи такого аналізу розро-

блені для великого числа сполук різної хімічної природи і молеку-

лярної маси.

373

Де застосовуються методи радіотестування in vitro?

Методи радіотестування in vitro широко застосовуються в

таких галузях медицини:

1) ендокринології - для діагностики цукрового діабету, пато-

логії гіпофізарно-надниркової і тиреоїдної систем, вивчення ме-

ханізмів ендокринно-обмінних порушень;

2) онкології - для ранньої діагностики злоякісних пухлин і

контролю за ефективністю лікування;

3) кардіології - для діагностики інфаркту міокарда і диферен-

ціації форм судинних порушень;

4) педіатрії - для визначення причин порушень розвитку у ді-

тей і підлітків;

5) акушерстві та гінекології - для контролю за розвитком пло-

ду, діагностики гінекологічних захворювань і виявлення причин

неплідності;

6) алергології - для визначення концентрації імуноглобулінів

й алергенів;

7) фармакології - для вимірювання швидкості розпаду і виве-

дення лікарських речовин;

8) психіатрії - для оцінки ефективності лікування.

Найчастіше радіотестування in vitro використовується для

визначення концентрації таких біологічно активних речовин:

• гормонів (кортикотропного, соматотропного, тиреотроп-

ного, лютеотропного, інсуліну, глюкагону, кальцитоніну, парат-

гормону, хоріонічного гонадотропіну, пролактину, окситоцину,

вазопресину);

• пухлинних антигенів-білків (міоглобіну, імуноглобулінів,

тироксин-зв’язуючого глобуліну, тиреоглобуліну, феритину, казе-

їну, β-глікопротеїду вагітності);

• кислої та лужної фосфатази;

• лікарських препаратів та інших речовин типу циклічних

нуклеотидів, поліамінів, вітамінів, жовчних кислот, простаглан-

динів, ендорфінів та енкефалінів.

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

374

Методи перевірки надійності й точності досліджень

Радіометричний метод перевірки надійності й точності мікропіпеток

Що представляє собою радіометричний метод перевірки

мікропіпеток?

Процедура будь-якого методу радіотестування in vitro вима-

гає застосування точних мікропіпеток, які можуть бути ручни-

ми, напівавтоматичними й автоматичними. Основна вимога до

мікропіпеток – вони повинні забезпечувати відтворення об’єму

з помилкою не більше за 3%. Невеликі відхилення в необхідно-

му об’ємі не так істотні, оскільки вони дають одну й ту ж похиб-

ку при багаторазовому застосуванні. Звичайно всі тест-систе-

ми дуже точно збалансовані, тому незначні відхилення в об’ємах

впливають на результат не в такій мірі, як регулярне недодавання

однієї і тієї ж кількості реагенту. Дуже важливо користуватися пі-

петками зі змінними наконечниками, що дозволяє уникати пере-

хресного забруднення проб, що тестуються. Надійність і точність

піпеток перевіряється різними способами. Для радіоізотопної ла-

бораторії найбільш прийнятний радіометричний метод:

1) за допомогою піпетки, що перевіряється, в 10 пробірок на-

бирають рівні об’єми розчину радіоактивного йоду (

125

І);

2) для розчину в кожній пробірці встановлюють час, за який

він дасть 40000 імпульсів;

3) обчислюють коефіцієнт варіації для 10 проб: якщо він не

перевищує 10%, точність мікропіпетки задовільна;

4) визначають надійність за формулою:

1000 імп./хв. на одиницю об’єму

Істинний об’єм проби (мкл) = ——————————————————;

імп./хв. на 1 мл

5) обчислюють коефіцієнт варіації для всієї групи проб: якщо

він не перевищує 10%, об’єми розчинів, взяті з допомогою даної

мікропіпетки, близькі до істинних.

375

Які вимоги ставляться до біологічних рідин, що підлягають

тестуванню?

Проба плазми або сироватки, що підлягає тестуванню, по-

винна містити істинний антиген, ідентичний чи аналогічний немі-

ченому стандартному антигенові. Бажано, щоб кров, призначена

для радіотестування in vitro, забиралася в однотипні центри-

фужні пробірки. Такі пробірки повинен готувати (очищати, ви-

сушувати, додавати антикоагулянт або інгібітор ферментів) один

співробітник. Кров без добавок відстоюють, а з добавками цен-

трифугують, отриману сироватку або плазму розливають в таку

кількість дрібних пластмасових пробірок (скло може не витрима-

ти низьку температуру), яка рівна або перевищує число різних ти-

пів тестувань. Наприклад, якщо треба визначити рівень ТТГ, Т

і ТГ, сироватку необхідно розлити в 5-7 пробірок (аліквот) з та-

ким розрахунком, щоб сироватки вистарчило на дуплет (подвій-

ний повтор). Аліквоти потрібно негайно заморозити шляхом по-

міщення їх в низькотемпературну шафу при -20°С, і зберігати там

до моменту використання. Заморожувати і зберігати аліквоти в

морозильній камері побутового холодильника не можна, оскіль-

ки температура в ній не досягає навіть -10°С. Для однієї реакції

беруть тільки одну аліквоту від даного хворого.

Які чинники слід враховувати при виборі проби біологічних рідин

для тестування?

При виборі виду проби біологічних рідин потрібно врахову-

вати таке:

1) при отриманні сироватки крові виникає небезпека того,

що при відстоюванні крові з еритроцитів інтенсивно звільняють-

ся протеолітичні ферменти, які можуть зруйнувати речовину, що

визначається, і пошкодити його мічений аналог під час інкубуван-

ня. Тому для визначення вмісту білкових сполук краще готувати

плазму крові;

2) при отриманні плазми часто використовують гепарин або

цитрат; перший блокує з’єднання антигену з антитілом, другий

істотно змінює кислотність середовища, до якого надзвичайно

чутливі радіоімунологічні реакції. Тому в суху центрифужну про-

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

376

бірку бажано додавати 50 мг ЕДТА на 5 мл крові (1:100); відразу

після відбору кров перемішати з ЕДТА і центрифугувати. ЕДТА є

слабим антикоагулянтом, блокатором протеолітичних ферментів

і складовою частиною багатьох буферних сумішей;

3) більшість речовин біологічного походження за низької

температури більш стабільні, ніж при кімнатній, тому їх звичайно

зберігають у замороженому стані. Заморожування потрібно про-

вести дуже швидко, інакше в процесі охолоджування речовини

можуть руйнуватися. У звичайних побутових холодильниках за-

морожування відбувається повільно, в зв’язку з чим речовини,

що охолоджуються, можуть руйнуватися через утворення вели-

ких кристалів льоду; найкраще заморожування провести з самого

початку в рідкому азоті – в цьому середовищі процес охолоджу-

вання йде набагато швидше і не супроводжується руйнуванням

охолоджених речовин;

4) розмороження і повторне заморожування пошкоджують

практично всі біологічні проби. Існує помилкова думка про те, що

така дія не впливає на тиреоїдні та стероїдні гормони. Однак по-

трібно пам’ятати, що основний пул стероїдних і тиреоїдних гор-

монів циркулює під “захистом” транспортних білків, які, як і всі

інші білки, не витримують температурних перепадів та, руйную-

чись, перестають “захищати” гормони. Останні, звільняючись, не-

гайно включаються в метаболічний ланцюг, що, в кінцевому ре-

зультаті, веде до спотворення істинної картини;

5) хімічне оточення, в якому знаходиться препарат, також є

важливим чинником. При зберіганні білків у розчинах, концен-

трація цих білків завжди повинна бути більшою від 1 мг/мл. Відо-

мо, наприклад, що розбавлена антисироватка втрачає активність

набагато швидше, ніж нерозбавлена.

Молекули деяких речовин біологічного походження, таких,

наприклад, як АКТГ, особливо легко руйнуються при окиснен-

ні, тому їх треба зберігати в присутності якого-небудь відновни-

ка або в атмосфері, що не містить кисню (наприклад, в атмосфе-

рі азоту).

377

Які чинники слід враховувати при постановці реакції?

Для того, щоб відбулася реакція, всі її компоненти інкубують

разом. У суміші реагентів мічена й немічена речовини, ліганди,

конкурують за активні ділянки зв’язуючого реагента (наприклад,

антитіла). Після досягнення рівноваги зв’язану радіоактивну ре-

човину різними способами відділяють від незв’язаної. Радіоактив-

ність, додана в кожну пробірку, є постійною. Варіації концентрації

випробуваної або стандартної речовини знайдуть відображення у

вимірюваннях співвідношення радіоактивності у двох фракціях:

вільної і зв’язаної міченої речовини. Після розділення цих двох

фракцій одну з них радіометрують. За калібрувальною кривою,

побудованою на основі радіоактивності стандартних проб, зчиту-

ють значення радіоактивності випробовуваних проб.

Що являють собою сучасні комерційні набори реагентів для

радіотестування?

Сучасні комерційні набори реагентів являють собою різні ва-

ріанти радіотестування:

1) радіоімунологічний аналіз (РІА), який базується на двох

принципах – конкурентному заміщенні й послідовному на-

сиченні;

2) імунорадіометричний аналіз (ІРМА);

3) конкурентне білкове з’єднання (КБЗ);

4) радіорецепторне тестування (РРТ);

5) радіореагентний аналіз (РРА).

Суворе виконання інструкції, яка додається до набору, забез-

печує хорошу якість отриманих результатів. Однак кожний етап

має деякі уявні несуттєві технічні моменти, які можуть впливати

на якість тест- системи.

Які технічні моменти впливають на розчинення антигенів

тесту-системи?

Розчинником звичайно є дистильована вода, вільна від орга-

нічних компонентів. Після розчинення реагентів необхідно пере-

свідчитися в повній гомогенності розчину. Негомогенний розчин

Методи радіоімунологічного аналізу

Ветеринарна радіологія

378

служить джерелом помилок. Разом з тим, надмірне збовтуван-

ня сумішок приводить до пошкодження реагентів, що, природ-

но, впливає на результати дослідження. Всі реагенти зберігаються

відповідно до інструкції їх виробників. Деякі реагенти чутливі до

світла. Вони надходять звичайно в коричневих флаконах; на всіх

реагентах вказані дати виготовлення і термін придатності.

Які технічні моменти слід враховувати при інкубуванні?

Перед початком реакції потрібно ретельно ознайомитися з

процедурою, щоб заздалегідь підготувати всі умови інкубування.

Останнє залежить від того, який метод розділення вибраний. Так,

смоли і деякі твердофазні системи необхідно постійно обертати

або струшувати з абсолютно однаковою швидкістю для всіх проб.

Вугілля вимагає наявності льодяної бані і суворого дотримання

часу для всіх етапів реакції. Для пробірок, покритих антитілами,

під час інкубації необхідне регулярне збовтування. Поліетилен-

гліколь, вугілля, смола і деякі інші адсорбенти вимагають суворо-

го контролю за часом і температурою реакції, вмістом білка.

Які технічні моменти слід враховувати при розділенні фракцій?

Розділення фракцій варіює від простого зливу рідини, декан-

тування (як у разі покритих антитілами пробірок) до центрифугу-

вання і промивки. Дуже важливим є хороше просторове розділен-

ня вільної та зв’язаної фракцій. Процедура розділення - найбільш

варіативний етап радіотестування в наборах різних фірм; вона, в

основному, визначає точність і надійність результатів. Необхід-

но знати обмеження вибраного способу розділення, оскільки в ін-

шому випадку будуть мати місце різні джерела помилок. До них

відносяться: центрифугування, декантування, температура, вміст

білка в пробах, що тестуються, неспецифічне “захоплення” адсор-

буючою системою, видалення комплексу з твердої фази, неповне

осадження, неспецифічне з’єднання антитілом (див. також Розді-

лення зв’язаної і вільної фракцій міченого ліганда).

379

Які технічні моменти слід враховувати при центрифугуванні?

Прискорення при центрифугуванні позначається буквою G.

Часто таке позначення помилково прирівнюється до числа обе-

ртів за хвилину. Інструкції до багатьох наборів включають номо-

грами, що спрощують перехід від значень G до обертів за хвилину

і навпаки. При відсутності номограм швидкість центрифуги мож-

на розрахувати за спеціальною формулою. Іноді для проведення

аналізу потрібні рефрижераторні центрифуги, в яких підтриму-

ється температура не вище за 4-6°С. Температуру в них потрібно

іноді перевіряти, для цього вміщують термометр безпосередньо в

камеру після зупинки центрифуги. При відсутності такої центри-

фуги звичайну центрифугу потрібно встановлювати в спеціальній

холодній кімнаті або вміщувати на дно її камери лід. Краще вико-

ристати ротор, що гойдається замість фіксованих кутових рото-

рів, оскільки останні “розмазують” осад на стінках пробірок, що

може служити джерелом помилок. За допомогою ротора, що гой-

дається, на дні пробірки виходить невеликий компактний осад.

Щоб уникати помилок, промивка проб і злив (або відсмокту-

вання) надосадової рідини повинні проводитися дуже ретельно.

Тому не можна надовго залишати пробірки перевернутими, інак-

ше осад “сповзає”. Не можна залишити на стінках пробірки кра-

плі рідини.

Які технічні моменти слід враховувати при радіометрії?

Стабільність роботи лічильника перевіряється таким чином.

Радіометрують одну або декілька проб через рівні проміжки часу

до 40000 імпульсів. Якщо час реєстрації цієї кількості імпульсів в

кожному випадку (при необхідності з урахуванням часу напівроз-

паду) відрізняється не більше ніж на ±2%, лічильник працює ста-

більно. Важливо враховувати:

а) різні лічильники мають різну ефективність, тому без від-

повідної корекції ні в якому разі не можна радіоактивність в од-

них пробірках вимірювати на одному лічильнику, а в інших - на

іншому;

б) різні типи пробірок і флаконів по-різному пропускають γ-

випромінювання

125

І. Скляні пробірки блокують до 20% випромі-

Методи радіоімунологічного аналізу