Комачкова З.К. Лекции по Гистологии

Подождите немного. Документ загружается.

(растровые) электронные микроскопы (СЭМ). Просвечивающие электронные

микроскопы позволяют получить лишь плоскостное изображение изучаемого

микрообъекта, а сканирующие способны создавать трехмерное изображение,

т.е. последовательно прощупывают электронным пучком отдельные точки

поверхности.

Полученное изображение выводится на телевизионный экран,

электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Для изучения деталей строения мембран и межклеточных контактов

применяется метод замораживания – скалывания (-160ºС). Метод

электронной микроскопии «замораживание» - травление применяют для

изучения внешней поверхности мембран клеток. После замораживания блок

раскалывают кристаллы льда, удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем

на участки клеток напыляют тонкую пленку тяжелого металла (например,

платины).

Методы замораживания позволяют изучать нефиксированные клетки

без образования в них артефактов, вызываемых фиксатором.

Сверхвысоковольтная микроскопия. Электронные микроскопы с

ускоряющим напряжением до 3000000В позволяют исследовать объекты

большой толщины (1-10 мкм).

Для изучения структуры макромолекул на атомарном уровне

применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину

волны около 0,1нм (диаметр атома водорода).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК И

ТКАНЕЙ.

Препарат может представлять мазок (крови, костного мозга, слюны,

цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (селезенки, тимуса, печени),

пленку из ткани (соединительной рыхлой, брюшины, плевры), тонкий срез

(наиболее часто используемый).

Процесс приготовления гистологического препарата для световой и

электронной микроскопии включает следующие этапы:

1. взятие материала и фиксация его;

2. уплотнение материала;

3. приготовление срезов;

4. окрашивание;

5. заключение в бальзам (для световой микроскопии).

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов,

предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание,

стабилизирует макромолекулы путем химического их сшивания. Маленький

образец органа погружают в фиксатор (спирт, формалин, осьмиевая кислота

и др.) или замораживается.

Фиксация приводит к уплотнению кусочков. Уплотнение их

продолжают удалением воды – обезвоживанием в спиртах возрастающей

концентрации от 60º до 100º, пропитыванием парафином или целлоидином,

или заливают в пластические среды и смолы (глутаральдегид).

Приготовление срезов производится при помощи микротома (для

световой микроскопии) и ультрамикротома (для электронной микроскопии) –

специальных приборов.

Стальной нож микротома позволяет получить срезы толщиной 3-8 мкм

из залитых в парафин, целлоидин или полиэтиленгликоль кусочков ткани.

Стекляные или алмазные ножи позволяют получать срезы толщиной 1-

5 мкм (для электронной микроскопии).

Срезы для световой микроскопии помещают на предметное стекло.

Окрашивание срезов (в световой) или напыление их солями металлов

(в электронной микроскопии) производят для увеличения контрастности

изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе.

Перед окрашиванием срезы депарфинируют и доводят до воды в

спиртах нисходящей концентрации. Методы окраски гистологических

препаратов очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач

исследования. Гистологические красители подразделяют на кислые,

основные и нейтральные.

Кислые красители (например, эозин, конгокрасный) связываются со

структурами, имеющими щелочную реакцию (цитоплазматические белки), их

называют оксифильными.

Основные или щелочные красители (гематоксилин, метиленовый

синий, азур) связываются с базофильными (кислыми) компонентами ткани

(нуклеиновые кислоты ядра, рибосомы).

Нейтральные или стандартные красители представляют собой смеси

кислых и щелочных красителей (гематоксилин и эозин). Их называют

нейтрофильными. Для сохранения препарат заключают в канадский бальзам,

покрывая объект покровным стеклом.

Для электронной микроскопии материал на специальной сетке

контрастируют солями тяжелых металлов, используя соли марганца,

кобальта, после чего их просматривают на микроскопе и фотографируют.

Изучают микрофотографии.

Гистологические методы позволяют установить локализацию

определенных веществ или биохимических процессов в тканевых и

клеточных структурах. Также используют гистоферментные реакции, при

этом помещают срезы в раствор субстрата, и специального вещества,

способного образовать конечный продукт реакции в виде окрашенного

осадка.

Для некоторых клеток и органелл характерны ферменты – маркеры.

Например, для лизосом – кислая фосфатаза, для митохондрии –

сукцинатдегидрогеназа и цитохромоксидаза, для эндоплазматической сети –

глюкозо-6-фосфатаза.

Для иммуногистохимии используют реакции, основанные на

специфическом взаимодействии меченых антител с тканевыми антигенами.

МЕТОДЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.

Исследование живых клеток и тканей позволяет получить информацию

об их жизнедеятельности – движениях, росте, делении клеток, влиянии на

них различных физических и химических факторов. Прижизненные

исследования проводят либо в организме (in vivo), либо вне организма (in

vitro).

Наблюдения в живом организме проводят с помощью специальных

просвечивающих микроскопов – иллюминаторов (например, изучая

циркуляцию крови в микрососудах), введением в организм животного

витального красителя (например, троипанового синего или литиевого

кармина при выявлении фагоцитов).

Более распространенными являются исследования живых клеток и

тканей в культуре. Выделенные клетки, ткани или органы помещают в

стеклянные или пластмассовые сосуды с питательной средой – плазму крови,

искусственные среды.

Взятые из организма человека клетки при пункции или биопсии могут

в культуре использоваться для определения пола, злокачественного

перерождения, наследственных заболеваний.

Клеточные культуры широко применяют для гибридизации клеток.

Слиянием двух клеток различных типов образуют гетерокарион –

клетка с двумя ядрами, при этом клетки обрабатывают полиэтиленгликолем

или инактивированными вирусами для повреждения плазмолемм клеток.

Гетерокарион способен к митозу.

Клонирование гибридных клеток приводит к образованию гибридных

клеточных линий, которые используются для изучения генома. Например, в

гибридной клеточной линии «мышь-человек» установлена роль хромосомы

11 в синтезе инсулина человека.

Гибридомы – клетки с геномом от двух разных клеток, одна из которых

опухолевая. Например, слиянием В-лимфоцитов с опухолевыми клетками В-

лимфомы. Время жизни В-лимфоцитов в культуре ограничено, а В-лимфомы

«бессмертны». Гибридомы способны длительно размножаться в культуре.

Каждый клон гибридомы является источником моноклональных антител.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ.

С помощью количественно-гистохимических методов возможно

изучать концентрацию и содержание химических веществ в конкретных

структурах клеток и тканей.

Цитоспектрофотометрия – метод количественного изучения

внутриклеточных веществ по их абсорбционным спектрам, по интенсивности

поглощения света, которая зависит от концентрации вещества, производят

количественное определение его в клетке.

Цитоспектрофлюориметрия – метод количественного изучения

внутриклеточных веществ по спектрам их флюоресценции.

Цитофлюориметры позволяют обнаружить малые количества вещества (до

-14

– 10

-16

г) и оценивать их локализацию в микроструктурах.

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Позволяют определять с помощью специальных сеток число любых

структур, их площади, диаметры, ядерно-плазменные отношения.

Различают ручную морфометрию и автоматизированную, при которой

все параметры измеряются и регистрируются в приборе автоматически.

Автоматизированные системы обработки изображений позволяют

эффективно применять количественные методы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гистология под ред. Ю.Н.Афанасьева, Н.А.Юрьиной. М., 1989,

2001, 2002 с.10-27.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

ТЕМА: Предмет и методы гистологии.

1. Дайте определение ткани.

2. Какие классификации тканей Вам известны?

3. Что представляет собой микротом?

4. В чем различие между световой и электронной микроскопией?

5. Каковы типы световой микроскопии? В чем их различия?

6. Что устанавливают гистохимические методы?

7. Что представляет собой цитофотометрия?

8. В чем сущность метода радиоавтографии?

ПОНЯТИЕ О ТКАНЯХ. ЭВОЛЮЦИЯ ТКАНЕЙ.

Основные критерии, которыми оперирует гистология – это

гистологические элементы.

Гистологические элементы являются структурно-функциональными

единицами, образующими ткани, органы, организм в целом.

Ткань – это филогенетически сложившаяся система гистологических

элементов, объединенных общей структурой, функцией и происхождением.

Система гистологических элементов конструируется, обновляется и

функционирует лишь при условии образования контактов между ними и

информационных взаимоотношений, т.е. множества процессов,

объединенных термином межклеточные взаимоотношения.

Гистологические элементы подразделяются на две основные категории

– клеточные (клетка, симпласт, синцитий) и неклеточные (компоненты

межклеточного вещества).

Клетка – главный элемент, а симпласты и синцитий образуются из

отдельных клеток.

Симпласт – многоядерная структура, образованная при слиянии

однотипных клеток (остеопласт, поперечно-полосатое мышечное волокно).

Синцитий – это структура, состоящая из клеток, соединенных

цитоплазматическими мостиками. Например, синцитиотрофобласт, синцитий

в сперматогенном эпителии семенных канальцев.

Группы клеток образуют клеточные популяции.

Леблон (1964г.) рассматривал 2 критерия для выделения клеточной

популяции:

1. наличие или отсутствие митозов внутри популяции

2. продолжительность жизни клеток – потомков по сравнению с

жизнью хозяина.

Леблон выделил четыре категории клеточных популяций:

1. эмбриональная популяция;

2. статистическая популяция (нейроны);

3. растущая популяция (делятся, но митозы затухают);

4. обновляющаяся популяция (много митозов). Клетки могут

находиться на разных стадиях дифференцировки,

функционального состояния.

В гистологии рассматривают следующие сообщества клеток:

1) клеточный тип;

2) дифферон;

3) клон.

Клеточный тип включает понятие клеточные фенотипы, а также

пластичность и границы нормы клеточного типа.

Клетки одинаковой морфофизиологической характеристики относятся

к одному клеточному типу. Например, кардиомиоциты, которые делятся на

рабочие, проводящие и эндокринные. Это разные типы или разные

фенотипы.

Клеточный тип – это сумма фенотипов. Для них характерны

пластичность и границы нормы. В организме человека насчитывают более

200 клеточных типов.

Совокупность клеточных форм, составляющих ту или иную линию

дифференцировки называется дифферон (гистогенетический ряд).

В диффероне последовательно различают:

1) стволовые клетки

2) клетки – предшественницы

3) зрелые клетки

В диффероне нарастает специализация. Например, при гистогенезе

эритроцитов.

В норме дифференцировка необратима.

Клон – группа клеток, происходящая от одной родоначальной клетки –

предшественницы.

Представление о клоне возникло в иммунологии. При попадании в

организм антигена одна иммунокомпетентная клетка усиленно размножается

и образуется большое количество одинаковых клеток (клон), способных

синтезировать антитела к антигену.

Также клоном является определенное количество сперматозоидов,

которые образуются в процессе сперматогенеза и спермиогенеза.

Помимо клеток ткани содержат межклеточное вещество или тканевой

матрикс. В разных тканях его разное количество.

Межклеточное вещество состоит из основного вещества, иногда

содержит волокна (например, в соединительной ткани). Компоненты

внеклеточного матрикса вырабатываются клетками, но они, в свою очередь,

влияют на клетки (например, контролируют их пролиферацию и

дифференцировку).

В тканях имеются жидкости: внутриклеточная и внеклеточная.

Внутриклеточная жидкость составляет 55% всей воды организма

человека, содержит в низкой концентрации Na

, Cl

, HCO

, в высокой

концентрации К

, органические фосфаты (АТФ) и белок. Низкая

концентрация Na

и высокая концентрация К

обусловлены работой Na

, К

АТФ-азы, выкачивающей Na

из клетки в обмен на К

Внеклеточная жидкость составляет 20% всей воды организма. Здесь

выделяют:

1) интерстициальную жидкость (20% всей воды организма,

находящейся в межклеточном пространстве тканей).

2) 7,5% всей воды организма составляет плазма, химический состав

которой сходен с таковым интерстициальной жидкости, но

концентрация белка в плазме выше.

3) Кристаллизационная вода, находящаяся в костях и хряще (15%

всей воды организма).

4) трансклеточная жидкость (2,5% всей воды организма),

содержащаяся в пищеварительном тракте, желчи,

мочевыделительной системе, внутриглазной и

цереброспинальной жидкости, в жидкостях серозных полостей

как плевра, брюшина, перикард.

ГИБЕЛЬ КЛЕТОК

Развитие многоклеточного организма, формирование тканей и их

функционирование предполагает наличие баланса между клеточной

пролиферацией, клеточной дифференцировкой и гибелью клеток. Клетки

гибнут в различных ситуациях. Так, массовую гибель клеток в раннем

онтогенезе называют запрограмированной. Клетки гибнут, выполнив свои

функции, при повреждении и некрозе тканей, при различных заболеваниях.

Примером запрограмированной гибели клеток служит гибель

нейробластов (от 25 до 75%) на определенных этапах развития нервной

системы путем апоптоза (путем деградации компонентов клеток, как

хроматиновая конденсация, фрагментация ДНК, появлением микроядер с

последующим фагоцитозом распадающихся клеток макрофагами). При этом

клетка как бы рассыпается.

Клетками, выполнившими свои функции и погибающими являются

клетки крови.

При патологических состояниях может идти относительная

избирательная гибель клеток, например в нервной системе при болезни

Альцгеймера.

При некрозе, вызываемом различными химическими или физическими

факторами в клетках происходит изменение ионного состава, прекращаются

синтезы АТФ, белков, нуклеиновых кислот, лизосомные ферменты

активируются, клетка растворяется.

ЭВОЛЮЦИЯ ТКАНЕЙ.

Свойства любой ткани несут на себе отпечаток всей предыдущей

истории ее становления.