Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

241

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Для виявлення капсулоутворення кращими способами є зараження білих мишей з

наступним забарвленням мазків-відбитків із органів та посіви на спеціальний елек-

тивний агар Буза (Венгрія) і Томова (Болгарія) або на середовище, що містить

розчин Хенкса і 40 % стерильної бичачої сироватки. Посіви вирощують в атмос-

фері 20-40 % CO

. Наступного дня 2-3 підозрілі колонії після мікроскопії відсіва-

ють на скошений МПА для виділення чистої культури.

Тварини гинуть через 24-36 год від гострої септицемії, проводять їх розтин,

роблять посіви із крові, селезінки та досліджують мазки-відбитки як вище описано.

На 3-й день дослідження знову заражають білих мишей, але вже чистою

культурою, проводять додаткові посіви і виконують тести для її остаточної іденти-

фікації та диференціації від антракоїдів і деяких бацил грунту. При цьому врахо-

вують головні й додаткові ознаки. До головних критеріїв відносять специфічну

патогенність, капсулоутворення, тест “перлинного намиста” на середовищі з пеніци-

ліном, лізис специфічним фагом, люмінесцентно-серологічний тест. Додатковими

ознаками є лецитиназна активність, відсутність рухливості та гемолізу (табл. 53)

Таблиця 53

Диференціальні ознаки збудника сибірки і грунтових бацил

Вид

Наяв-

ність

капсули

Пато-

ген-

ність

Лізис

специ-

фічним

фагом

Тест

"перлин-

ного

намиста"

Люмінес-

центно-

серологіч-

ний тест

Рухли-

вість

Гемо-

ліз

Леци-

тиназа

Фос-

фатаза

B. anthracis

B. anthracoides

B. subtilis

B. megaterium

B. cereus

–

Специфічну патогенність визначають введенням білим мишам 0,2 мл сус-

пензії культури. Виявлення у мазках-відбитках із органів загиблих тварин круп-

них паличок, оточених капсулою, свідчить про наявність у мікробів специфічної

патогенності (див. вкл., рис. 16). При зараженні мишей занадто великими дозами

культур грунтових бацил у тварин інколи наступає захворювання, але феномен

капсулоутворення відсутній.

Тест “перлинного намиста” проводять так. До бульйону Хоттінгера з кінською

сироваткою (30 %) добавляють пеніцилін у кількості 0,5 ОД/мл і сіють 2 краплі

молодої виділеної культури. Через 3 год росту в термостаті виготовляють мазки,

забарвлюють метиленовим синім і мікроскопують. Сибіркові бацили розташову-

ються у вигляді ланцюжків із кулястих форм, що нагадують намисто з перлин.

Сапрофітні грунтові бацили, нечутливі до пеніциліну, ростуть як звичайно, і в

мазках виявляють паличкоподібні ланцюжки.

Для виявлення фаголізабельності виділених штамів на підсушений МПА в

чашці Петрі з розкресленим на квадрати дном бактеріологічною петлею діамет-

ром 5 мм на кожен квадрат наносять велику краплю 5-6 – годинної культури. Чаш-

ку знову підсушують 30 хв і потім на центр кожної бляшки культури петлею діа-

242

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

метром 2 мм наносять маленьку краплю специфічного сибіркового бактеріофагу.

Облік результатів проводять через 5-6 год інкубації при 37 °С. Якщо культура на-

лежить до B. athracis, у місці нанесення на неї фагу видно лізис у вигляді стериль-

ної плямки. Жоден вид сапрофітних бацил нечутливий до дії специфічного фагу.

Швидко ідентифікувати виділену культуру можна також за допомогою діаг-

ностичної сибіркової сироватки, міченої флуоресцеїном (родаміном). Мазок із

капсульної культури фіксують метанолом, потім протягом 20 хв обробляють люмі-

несцентною сироваткою, промивають буферним розчином, висушують і мікро-

скопують під люмінесцентним мікроскопом. У мазках навколо клітин із капсулою

спостерігається специфічне світіння у вигляді яскраво-зелених обідків. Тепер ча-

стіше використовують непрямий варіант РІФ.

Відсутність рухливості виявляють методом надавленої (висячої) краплі або

посівом уколом у пробірку з напіврідким агаром, а відсутність гемолізу встанов-

люють після посіву на кров’яний агар. Проби на лецитиназу і фосфатазу прово-

дять за допомогою загальноприйнятих методик.

Отже, великі грампозитивні нерухливі палички з капсулами, що ростуть у

вигляді характерних R-форм колоній, високопатогенні для експериментальних

тварин, дають тест “перлинного намиста”, яскраво світяться при обробці сибірко-

вою люмінесцентною сироваткою, ідентифікують як B. anthracis.

У тих випадках, коли виділити збудника з досліджуваного матеріалу дуже

важко або взагалі неможливо (трупи тварин, шкіра, хутро, шерсть, вовна), а також

при контролі тваринної сировини на деяких виробництвах, широко використовують

дуже чутливу й специфічну реакцію термокільцепреципітації Асколі. Вона дає

змогу виявляти в матеріалі навіть незначну кількість антигена сибіркових бацил.

Термостабільний антиген із досліджуваних матеріалів екстрагують кип’яті-

нням або “холодним” способом. Спочатку матеріал подрібнюють, потім залива-

ють 10-кратним об’ємом 0,85 % розчину хлориду натрію, кип’ятять 10-15 хв,

фільтрують через азбестову вату. У деяких випадках матеріал заливають потрійним

об’ємом 0,5 % розчину оцтової кислоти. При цьому проходить більш повноцінне

екстрагування антигену.

“Холодний” метод частіше застосовують при масовому обстежені шкір та

іншої сировини. Проби матеріалу стерилізують у автоклаві, подрібнюють, залива-

ють 10-кратним об’ємом ізотонічного розчину і залишають при температурі 6-16 °С

на 20-24 год, фільтрують так само. У всіх випадках антиген має бути максимально

прозорим.

Другий компонент реакції – преципітуючу сироватку – отримують шляхом

гіперімунізації коней вакциною СТІ або вбитою культурою B. anthracis.

У преципітаційні пробірки вносять 0,2-0,3 мл преципітуючої сироватки, а

потім обережно нашаровують 0,3 мл термоекстракту. На межі двох рідин утво-

рюється через 2-5 хв тонке кільце преципітату білуватого кольору (помутніння

рідини). Появу осаду через 10 хв вважають неспецифічною реакцією. Паралельно

ставлять декілька контролів: преципітуюча сироватка + позитивний естракт; пре-

ципітуюча сироватка + естракт із несибіркового матеріалу; преципітуюча сиро-

243

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

ватка + ізотонічний розчин; нормальна сироватка + термоестракт та ін. Перший

контроль має бути завжди позитивний, всі інші – негативними.

Серологічна діагностика сибірки проводиться рідко, переважно в таких

випадках, коли збудника хвороби виділити не вдається. Для виявлення антитіл у

сироватці крові хворих використовують такі високочутливі методи, як РНГА, ІФА,

реакція коаглютинації з протективним сибірковим антигеном.

Алергічний метод. Організм хворої і перехворілої на сибірку людини, а та-

кож після вакцинації реагує місцевою алергічною реакцією на внутрішньошкірне

введення алергену. Стан сенсибілізації виникає вже на 4-5 день хвороби і збері-

гається дуже довго. Алергеном для постановки проби служить антраксин – білко-

во-полісахаридний комплекс, отриманий шляхом гідролізу вегетативних форм

сибіркових бацил. Препарат вводять внутрішньошкірно на долонній поверхні пе-

редпліччя в об’ємі 0,1 мл. Результат враховують через 24 і 48 год. Пробу вважають

позитивною при виникненні гіперемії та інфільтрату діаметром понад 15 мм.

Мікробіологічна діагностика анаеробних інфекцій

До першої групи патогенних анаеробних мікроорганізмів належать збудники

правця, ботулізму, анаеробної газової інфекції, псевдомембранозного коліту та ін.

Це великі грампозитивні паличкоподібні бацили, що утворюють термінальні або

субтермінальні спори і виділяють сильні екзотоксини. Всі вони входять до роду

Clostridium родини Bacillaceae. Захворювання, які вони викликають, називають

тепер загальною назвою клостридіози.

Другу групу строгих анаеробів складають безспорові бактерії родів Bacte-

roides, Fusobacterium, Propionibacterium, Veillonella, Peptococcus і Peptostrepto-

coccus. Вони здатні викликати у людини гнійно-запальні і некротичні процеси

різноманітної локалізації.

Ботулізм

Ботулізм – тяжка, часто фатальна токсикоінфекція, яка виникає внаслідок

вживання продуктів, що містять токсини Clostridium botulinum, супроводжується

специфічними ураженнями нервової системи, переважно ядер язиково-гортанних

і окуломоторних нервів. Інколи хвороба розвивається після інфікування ран клос-

тридіями ботулізму.

C. botulinum продукує 8 типів сильних токсинів: А, В, С

, С

, D, Е, F, G, які

відрізняються антигенною специфічністю, що необхідно враховувати при прове-

денні лабораторної діагностики і лікуванні. Ботулізм у людей викликають типи А,

В, Е і F, типи С і D – у ссавців і птахів. Патогенність типу G для людини і тварин

не доведена.

Основним резервуаром і джерелом інфекції в природі є теплокровні травоїдні

тварини, в кишечнику яких клостридії розмножуються і з фекаліями у великій

кількості потрапляють у грунт і воду. Тут вони перетворюються в спори і дуже

244

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

довго зберігаються. Захворювання виникає при споживанні в їжу м’ясних, риб-

них та інших, переважно консервованих продуктів, у яких нагромаджуються кло-

стридії ботулізму та їх токсини. Небезпечними є консервовані продукти домашньо-

го приготування, особливо гриби.

Лабораторна діагностика ботулізму спрямована на виявлення токсину в ма-

теріалах, взятих у хворих, а також харчових продуктах, що спричинили отруєння.

Токсин визначають шляхом постановки біопроби і встановлення його типу в ре-

акції нейтралізації. Значно рідше виділяють чисту культуру збудника і проводять

серологічні дослідження.

Взяття матеріалу. В усіх випадках захворювань із симптомами ботулізму

у хворих обов’язково беруть промивні води шлунка, блювотні маси, кров, фекалії,

сечу; від трупа – вміст шлунка і кишок, лімфатичні вузли, шматочки печінки, го-

ловного і спинного мозку. Необхідно досліджувати і залишки підозрілої їжі.

Кров у хворого в кількості 10 мл беруть до введення ботулінових лікуваль-

них сироваток у пробірку з лимоннокислим натрієм у співвідношенні 3:1. Про-

мивні води шлунка, блювотні маси (100-200 мл) та випорожнення (50-60 г) вміщу-

ють у скляні банки з гумовими корками. Консервуючі речовини добавляти не мож-

на. При взятті секційного матеріалу 50-60 г кожного органу вміщують у окрему

банку. Залишки їжі відбирають по 200-300 г.

Щільні матеріали спочатку розтирають у ступках, вносять подвійний об’єм

ізотонічного або желатино-фосфатного розчину і залишають при кімнатній тем-

пературі на 2 год для екстрагування токсину. Екстракт центрифугують, рідину над

осадом використовують для поставки біологічної проби. Кров вводять без будь-

якої обробки.

Проби, що доставлені до лабораторії, досліджують одночасно у двох напрям-

ках: 1) для виявлення ботулотоксинів; 2) з метою виділення C. botulinum. Одно-

часно в тих же пробах вияляють і C. perfringens.

Виявлення ботулінових токсинів. Наявність ботулінового токсину в дослі-

джуваному матеріалі і визначення його типу проводять за допомогою реакції ней-

тралізації на білих мишах. Для цього відбирають 5 пар мишей вагою 16-18 г на

кожну пробу. В реакції використовують діагностичні (не лікувальні!) антитоксичні

ботулінові сироватки типів A, B, E, F, які розводять 0,85 % розчином хлориду

натрію до 100-200 МО/мл, що забезпечує нейтралізацію гомологічного токсину в

досліджуваній пробі.

Центрифугат доставлених матеріалів або кров хворого розливають по 1,4 мл у

5 пробірок. У перші чотири з них вносять по 0,6 мл (200 МО/мл) антитоксичних

протиботулінових сироваток відповідно типів A, B, E і F. У останню пробірку до-

бавляють 0,6 мл нормальної сироватки. Всі пробірки витримують 40 хв при

кімнатній температурі для нейтралізації токсину. По 1-му мл суміші з кожної пробір-

ки вводять п’яти парам мишей (центрифугат + сироватки – підшкірно, кров + сиро-

ватки – в черевну порожнину). За тваринами спостерігають протягом 3-4-х днів.

При наявності в досліджуваному матеріалі ботулінового токсину гинуть чоти-

ри пари мишей, окрім двох, яким була введена суміш матеріалу з тим типом сироват-

245

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

ки, що нейтралізувала дію гомологічного типу токсину. При загибелі всіх мишей

пробу треба повторити з розведеним в 10, 20, 100 разів біологічним матеріалом.

Постановка реакції нейтралізації з визначенням типу ботулотоксину має важ-

ливе значення при виборі відповідної сироватки для специфічного лікування бо-

тулізму. Тому при видачі відповіді про виявлення ботулінового токсину лаборато-

рія повинна обов’язково вказувати його тип.

Якщо бактеріологічна лабораторія має типові антитоксичні ботулінові ерит-

роцитарні діагностикуми, серотип токсину краще визначати за допомогою реакції

непрямої гемаглютинації. Вона високоспецифічна, чутлива, значно економічніша,

швидше дає результат, ніж реакція нейтралізації in vivo. Для виявлення збудника

ботулізму чи його токсину можна також застосовувати метод ІФА та імуноелектро-

форезу.

Професор С.М. Мінервін і його співробітники у 1959 р. розробили прискоре-

ний метод діагностики ботулізму за допомогою визначення фагоцитарного показ-

ника. Він грунтується на тому, що ботулотоксини різко пригнічують фагоцитарну

функцію лейкоцитів. Гомологічна антитоксична ботулінова сироватка нейтралі-

зує лейкотоксичну дію екзотоксину, чого немає при дії гетерологічних сироваток.

Дослід ставлять із використанням мікродоз компонентів. У 5 маленьких про-

бірок вносять піпеткою Панченкова по одному об’єму лимоннокислого натрію

(

поділок піпетки до мітки 75) і по два об’єми крові хворого. Потім у пробірку

№ 1 добавляють один об’єм 0,85 % розчину хлориду натрію, а в пробірки № 2, 3,

4 і 5 – відповідні діагностичні ботулінові сироватки типів A, B, E, F у тому ж

об’ємі. Після перемішування всіх компонентів пробірки ставлять у термостат на

30 хв для нейтралізації можливого токсину в крові хворого гомологічною сиро-

ваткою і в усі пробірки вносять по одному об’єму 1 млрд зависі культури золоти-

стого стафілокока і знову вміщують у термостат на 20 хв для завершення процесу

фагоцитозу. Із вмісту кожної пробірки готують мазки, фарбують за Романовсь-

ким-Гімзою і визначають фагоцитарний показник. Для цього підраховують

кількість поглинених коків у 50 полінуклерах і ділять отримане число на 50. Якщо

в крові хворого є токсин, то фагоцитарні показники в усіх пробах крові будуть

низькі, за винятком показника в тій пробірці, де тип токсину і сироватки гомо-

логічні. У тяжких випадках ботулізму фагоцитарний показник може падати до

нуля. Гомологічна сироватка, нейтралізуючи токсин, відновлює цей показник до

норми. Метод не можна використовувати для виявлення ботулотоксину в харчо-

вих продуктах і секційному матеріалі.

Виділення культур C. botulinum. До посіву досліджуваний матеріал емуль-

гують у фарфорових ступках як вище вказано. По 10 мл матеріалу сіють у 4 фла-

кони з 75-150 мл свіжорегенерованого рідкого середовища (Кітта-Тароцці, Хоттін-

гера, казеїново-грибного). Два флакони прогрівають: один при 60 °С протягом

15 хв (для селекції C. botulinum типу Е), другий – 20 хв при 80 °С. Два флакони

інкубують при 28 °С (для типів E і F) решту – при 35 °С в анаеростаті або під

шаром вазелінового масла товщиною 0,5 см. На 2, 4, 6 і 10-й день із флаконів, де є

ріст, виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і мікроскопують. Збудник боту-

246

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

лізму має вигляд крупних грампозитивних паличок

із овальною субтермінальною спорою, що нагаду-

ють тенісні ракетки (рис. 72).

Щоб визначити тип ботулотоксину з флакона

відбирають 10-15 мл культуральної рідини, центри-

фугують її і ставлять реакцію нейтралізації на білих

мишах або РНГА з типовими ботуліновими сироват-

ками, як вище описано.

Для отримання ізольованих колоній з метою

виділення чистої культури краплю культуральної

рідини з флакона вносять на поверхню анаеробного

кров’яного або печінкового агару і втирають скля-

ним шпателем в агар послідовно в трьох чашках. Посіви вирощують в анаероста-

тах. Через 48 год інкубації вивчають характер колоній. На кров’яному агарі ко-

лонії можуть бути неправильної форми з фестончастими краями, або гладенькі,

круглі, із зонами гемолізу навколо них. Різні типи C. botulinum можуть утворюва-

ти неоднакові колонії. При посіві уколом у високий стовпчик цукрового агару ко-

лонії мають вигляд чечевичок або жмуточків вати.

Після мікроскопування типових колоній їх відсівають на середовище Кітта-

Тароцці, отримують чисту культуру та ідентифікують її за морфологічними, куль-

туральними, токсигенними та біохімічними властивостями шляхом посіву в сере-

довища Гісса. Палички ботулізму ферментують глюкозу, галактозу, гліцерин, маль-

тозу, сахарозу, фруктозу до кислоти і газу, розріджують желатин, виділяють H

не утворюють індол. Для диференціації C. botulinum від інших анаеробів викори-

стовують і інші тести (табл. 54).

Таблиця 54

Диференціальна характеристика анаеробних мікроорганізмів

Ферментація

Вид

Рухли-

вість

Леци-

тіназа

Ліпаза

Глюкоза Лактоза Маніт

Індол

С. botulinum

C. difficile

C. histolyticum

C. novyi

C. perfringens

C. septicum

C. sordellii

C. sporogens

C. tetani

Визначення сероварів збудника ботулізму здійснюють за допомогою реакції

нейтралізації токсину in vivo, методом ІФА або в РНГА.

Методика виділення C. perfingens при харчових отруєннях викладена в розділі

анаеробної газової інфекції.

Рис 72. C. botulinum.

247

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Правець

Правець (стовбняк) – гостра ранова інфекція людей і тварин, що розвиваєть-

ся в результаті ураження токсином нейромоторних клітин спинного і головного

мозку, проявляється розвитком тонічних і тетанічних скорочень м’язів. Збудник –

Clostridium tetani – тонкий, довгий, рухливий мікроб із термінальною круглою

спорою, яка надає йому вигляд барабанної палички. Вона має О- і Н-антигени, за

характером яких збудник правця поділяють на 10 серотипів, але всі вони виділя-

ють однаковий, тотожний токсин.

Джерелом правцевих клостридій є тварини (вівці, коні, кози, корови, свині),

у кишечнику яких вони постійно знаходяться у складі нормальної мікрофлори. Із

фекаліями тварин мікроби потрапляють у грунт, переходять у спорову форму і

зберігаються роками. Хвороба розвивається лише тоді, коли збудник проникає в

організм через ушкоджену шкіру, м’язи, слизову оболонку при пораненнях,

ін’єкціях, опіках, обмороженнях, пролежнях тощо.

Мікробіологічні дослідження з метою діагностики правця проводять рідко.

Клінічна картина хвороби настільки характерна, що необхідність вдаватись до

бактеріологічної діагностики просто відпадає. Лише у випадках нетипового або

летального її перебігу, при розвитку правця після підпільних абортів чи пологів у

домашніх умовах, а також коли виникає правець новонароджених, такі дослідження

необхідно рекомендувати. Значно частіше проводять виявлення C. tetani у шов-

них і перев’язувальних матеріалах, лікарських препаратах для парентерального

введення, у пробах грунтів тих регіонів, де реєструється висока захворюваність

на стовбняк.

Взяття матеріалу. Від хворих на дослідження беруть гній, рановий вміст,

ексудат, шматочки некротизованих тканин, тампони з рани, сторонні тіла; від по-

мерлих – кров, рановий вміст, старі рубці, селезінку. У випадках виникнення правця

після абортів і пологів досліджують виділення та біоптати з вагіни і матки; при

захворюванні новонароджених – виділення з пупка. Всі матеріали негайно на-

правляють до бактеріологічної лабораторії краще в спеціальних транспортних се-

редовищах, захистивши їх від згубної дії кисню повітря.

Первинна бактеріоскопія. Із патологічного або секційного матеріалів виго-

товляють декілька мазків та препаратів-відбитків, забарвлюють за Грамом, Ожешко

(для виявлення спор) і мікроскопують під імерсійною системою. Наявність у маз-

ках довгих грампозитивних паличок з круглими термінальними спорами при

відповідній клінічній картині дає змогу запідозрити присутність C. tetani (рис. 73).

Але на основі лише мікроскопічного дослідження не можна робити висно-

вок, оскільки в матеріалі можуть бути подібні за морфологією непатогенні мікро-

організми (C. pseudotetanicum, C. tetanomorphum).

Бактеріологічне і біологічне дослідження. Отриманий в лабораторії матері-

ал розтирають у стерильних ступках із піском, добавляючи середовище для конт-

ролю стерильності до отримання 10 % суспензії. Рідку фазу матеріалу розділяють

на дві рівні частини, одну з яких прогрівають при 80 °С протягом 20 хв. Це при-

248

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

зводить до загибелі вегетативних клітин бактерій і

значно підвищує шанси на виділення C. tetani. Далі

грітий і негрітий матеріал досліджують паралельно.

Для нагромадження анаеробних клостридій

обидві порції висівають у дві пробірки з середови-

щем Кітта-Тароцці (або тіогліколевим бульйоном).

Одночасно для отримання ізольованих колоній роб-

лять посів на чашку з анаеробним кров’яним агаром

такого складу: до еритрит-агару добавляють 10 %

середовища 199, 10 мкг/мл метадіону, 10 мкг/мл ге-

міну, 10 мг/мл цистину, 0,1 % твіну – 80 і 5 % дефіб-

ринованої крові барана або кролика. При сильному

забрудненні проб сторонньою мікрофлорою до агару ще додають неоміцин, ген-

таміцин або налідиксову кислоту в кількості 40-50 мкг/мл.

Посіви інкубують в анаеробних умовах при температурі 37 °С протягом

48-72 год. Колонії C. tetani на кров’яному агарі плоскі, напівпрозорі, з нерівними

краями, нерідко у вигляді переплетених ниток, що нагадують павучків. Навколо

колоній виникає зона гемолізу (рис. 74). Якщо колонії відсутні, роблять висів із

середовищ накопичення на кров’яний агар. При посіві уколом у високий стовпчик

цукрового агару колонії C. tetani нагадують хмаринки або жмуточки вати.

Виділену чисту культуру ідентифікують за морфологічними, культуральни-

ми ознаками і обов’язково шляхом визначення токсигенності, яка є вирішальним

тестом при діагностиці правця. Для виявлення токсичної дії культури або первин-

ного досліджуваного матеріалу ставлять біологічну пробу нейтралізації токсину

правцевою сироваткою на тваринах.

Правцевий токсин отримують шляхом вирощування культури в середовищі

Кітта-Тароцці протягом 2-3 діб з наступною фільтрацією або центрифугуванням

бульйону. Двом білим мишам внутрішньом’язево (біля кореня хвоста) вводять по

0,5 мл суміші фільтрату з правцевою антитоксичною сироваткою (200 МО). Суміш

попередньо витримують у термостаті 40-60 хв. Спостереження за мишами прово-

дять протягом 4-5 діб. Якщо у фільтраті містився правцевий екзотоксин, заражені

миші гинуть при явищах висхідного правця. Конт-

рольні тварини залишаються живими. Аналогічно

біопробу ставлять і з досліджуваним матеріалом (роз-

терті в ізотонічному розчині шматочки тканин, гній,

ексудат тощо). Виникає така ж сама клінічна карти-

на правця, як і після введення токсину, а антисиро-

ватка нейтралізує присутній токсин.

Для виявлення правцевого токсину в середови-

щах накопичення, а також для ідентифікації виділе-

ної чистої культури C. tetani використовують

високоспецифічну й більш економічну реакцію не-

прямої гемаглютинації. У ряді лунок полістироло-

Рис.74. Колонії C. tetani.

Рис. 73. C. tetani.

249

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

вої пластини роблять розведення культуральної рідини в буферному розчині з кро-

лячою інактивованою сироваткою від 1:10 до 1:1280. Потім у кожну лунку вно-

сять по 0,1 мл правцевого еритроцитарного антитільного діагностикуму (суспен-

зія еритроцитів барана, сенсибілізованих правцевою антитоксичною сироваткою).

Пластини з лунками вміщують у термостат на 60 хв, потім залишають при кімнатній

температурі. Попередній результат враховують через 3 год, остаточний – через 18

год. При наявності правцевого токсину в ряді лунок появляється феномен гема-

глютинації.

Для ідентифікації C. tetani в різних об’єктах можна використовувати люмінес-

центно-серологічний метод, застосувавши протиправцеву антимікробну сироват-

ку, мічену ізотіоціанатом флуоресцеїну, а також метод імуноферментного аналізу.

Спеціально для виділення чистої культури збудника правця Філдс запропо-

нував оригінальний спосіб: кілька крапель прогрітого при 60 °С протягом 90 хв

досліджуваного матеріалу або культури із рідкого середовища накопичення сіють

у конденсаційну рідину на дні пробірки зі скошеним кров’яним чи сироватковим

агаром. Посів вирощують 18-24 год в умовах строгого анаеробіозу. Збудник прав-

ця завдяки своєму повзучому росту, обумовленому джгутиками, росте у вигляді

тоненької плівки по всій поверхні середовища. З верхньої частини плівки роблять

3-5 таких пересівів до отримання чистої культури.

Серологічний метод діагностики правця практично не використовується.

Лише для контролю ефективності вакцинації правцевим анатоксином (визначен-

ня рівня антитоксину в крові) вибірково проводять постановку реакції нейтралі-

зації, РНГА, ІФА.

Ранова анаеробна газова інфекція

Анаеробна газова інфекція (клостридіальний міозит, газова гангрена) – гостра,

тяжка, поліетіологічна ранова інфекція, яку викликають бактерії роду Clostridium

в асоціації між собою і умовно-патогенними мікроорганізмами. Основними збуд-

никами захворювання є Clostridium perfrigens, C. novyi (oedematiens), C. septicum

(див. вкл., рис. 17). Значно рідше зустрічаються C. histolyticum, C.sordellіi, C. fallax.

Із аеробних бактерій у рановому вмісті виявляють протей, стафілококи, кишкові

палички та ін. C. perfrigens може викликати харчові токсикоінфекції.

В якості досліджуваного матеріалу беруть шматочки уражених тканин, рано-

вий вміст, eкcудат, випіт при набряках; при харчових токсикоінфеціях – блювотні

маси, промивні води шлунка, випорожнення, кров, залишки підозрілої їжі. В разі

необхідності досліджують перев’язувальний та шовний матеріал (шовк, кетгут),

одяг, грунт, секційний матеріал (шматочки некротизованих тканин, печінки, селе-

зінки). З метою попередження шкідливої дії кисню повітря на анаеробну мікро-

флору тверді матеріали для дослідження краще брати у короткі пробірки, що гер-

метично закриваються. Рідкі досліджувані матеріали можна набирати у шприц,

на голку насадити гумовий корок і в такому вигляді транспортувати до лабо-

раторії.

250

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Мікробіологічна діагностика газової гангрени зводиться до виділення чис-

тих культур збудників, їх ідентифікації на основі морфологічних, культуральних і

біохімічних властивостей та визначення типів токсинів.

Бактеріоскопія є необхідним етапом для орієнтації в характері ранової

мікрофлори. Для цього готують мазки-відбитки з уражених тканин, ексудату чи

випоту, забарвлюють за Грамом або метиленовою синькою. Наявність у мазках

великої кількості крупних грампозитивних паличок зі спорами чи капсулами

(C. perfringens) або без них може служити ознакою можливого розвитку газової

гангрени (рис. 75).

Рис. 75. C. Perfringens: 1 – вегетативні форми; 2 – капсули; 3 – спори.

1 2 3

З метою орієнтовної ідентифікації клостридій можна використати люмінес-

центно-серологічний метод, коли мазки обробляють діагностичними флуоресцен-

тними сироватками. За видом сироватки, яка викликає специфічне світіння навколо

оболонок бактерій під люмінесцентним мікроскопом, визначають вид збудника.

Бактеріологічне дослідження. Рідкі досліджувані матеріали сіють у натив-

ному вигляді. Шматочки уражених тканин та інші щільні матеріали спочатку го-

могенізують у фарфорових ступках з піском, добавляючи рівний об’єм ізотоніч-

ного розчину хлориду натрію. Будь-який матеріал розділяють на 2 частини; одну з

них прогрівають 20 хв при 80 °С, другу не піддають термічній обробці. Обидві

проби паралельно висівають на спеціальні сердовища для культивування анае-

робних мікроорганізмів.

Для первинного накопичення анаеробів широко використовують середови-

ще Кітта-Тароцці. На ньому C. perfringens росте з інтенсивним помутнінням і бурх-

ливим газоутворенням. Інші види утворюють помутніння і менше виділення газу

або без нього (C. histolyticum). При посіві на стерильне знежирене лакмусове молоко

C. perfringens вже через 4-5 год викликає його звудження з утворенням цегляного

кольору губчастого згустка, який газ підіймає на поверхню пептонізованої рідини.

Класичним середовищем для отримання ізольованих колоній є кров’яний

цукровий агар Цейслера (до МПА додають 1,5 % дефібринованої крові і 2 % глю-

кози). Чашки з посівами вирощують в анаеростаті. На цьому агарі колонії основ-

них збудників мають гладеньку дископодібну форму сіруватого кольору з рівними

або бахромчастими краями і піднятим центром, оточені зоною гемолізу (рис. 76).