Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

251

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

На середовищі Вілліса-Хоббса (МПА з лакто-

зою, індикатором нейтральним червоним, яєчним

жовтком і знежиреним молоком) колонії C. perf-

ringens червоного кольору і зоною опалесценції;

колонії C. novyi безбарвні (не розкладають лакто-

зи), але із зоною опалесценції; колонії С. septicum

червоні; навколо колоній C. histolyticum є зона про-

світлення.

Колонії C. histolyiticum, С. sordellii безбарвні,

а ореол опалесценції мають лише колонії C. sor-

dellii. На кров’яному агарі з бензидином колонії

C. novyi чорніють після перебування на повітрі.

При посіві матеріалу уколом у стовпчик агару Вільсона-Блера вже через 3-4

години в ділянках росту C. perfringens середовище чорніє. Характерні особли-

вості росту на молоці і середовищі Вільсона-Блера використовують для експрес-

діагностики газової гангрени, викликаної C. perfringens.

Колонії, що виросли на диференціально-діагностичних середовищах, мікро-

скопують, пересівають на середовище Кітта-Тароцці, отримують чисту культуру

й ідентифікують її за морфологічними, культуральними і біохімічними властиво-

стями. Важливе значення має визначення типів екзотоксинів.

При відсутності анаеростатів та інших приладів для створення анаеробних

умов ізольовані колонії, а отже й чисті культури, можна отримати шляхом посіву

різних розведень досліджуваного матеріалу у трубки Віньяль-Вейона за методом

Вейнберга. Матеріал розводять 1:10, 1:100, 1:1000 у розтопленому і охолоджено-

му до 45 °С цукровому агарі, розлитому в пробірки по 10 мл. Із кожного розведен-

ня агар натягують у трубки, а капілярний кінець запаюють на вогні. Після інку-

бації при 37 °С трубки розпилюють надфілем, стовпчик агару з характерними

колоніями анаеробів виштовхують у стерильну чашку Петрі. Потім колонії пет-

лею пересівають у середовище Кітта-Тароцці, вирощують чисті культури й іден-

тифікують їх.

У ряді розвинутих країн оранізовані спеціальні лабораторії, в яких викорис-

товують сучасні апарати і тест-системи для культивування й ідентифікації ана-

еробів, а також бокси, де всі посіви, пересіви та інші маніпуляції проводять при

повній відсутності кисню повітря.

Однак у рутинних бактеріологічних лабораторіях виділення і повну ідентифі-

кацію чистих культур проводять рідко, оскільки весь процес займає багато часу,

вимагає складних і дорогих живильних середовищ та спеціальних приладів. У

зв’язку з цим для більш швидкої діагностики анаеробної газової інфекції і вибору

відповідних лікувальних антитоксичних сироваток проводять визначення типів

екзотоксинів за допомогою реакції нейтралізації in vivo.

Біологічні дослідження. Для постановки тесту нейтралізації використову-

ють видові діагностичні антитоксичні сироватки, центрифугати (фільтрати) буль-

йонних культур і білих мишей, масою 16-18 г. У 6 пробірок вносять по 0,9 мл

Рис. 76. Зони гемолізу навколо

колоній C. perfringens.

252

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

центрифугату, потім у 5 з них добавляють по 0,6 мл антитоксичних сироваток до

основних видів збудників (табл. 55). У 6-у пробірку вносять 0,6 мл ізотонічного

розчину хлориду натрію (контроль). Суміші витримують у термостаті протягом

40 хв і кожну з них в об’ємі 0,5 мл вводять внутрішньовенно двом мишам. Видову

належність культури (токсину) визначають за мишами, що вижили, при загибелі

тварин контрольної та інших дослідних груп.

У лабораторіях, де є можливості працювати з культурами тканин, реакцію ней-

тралізації ставлять на трипсинізованих клітинах 10-12 денних курячих ембріонів.

Токсигенність можна визначити ще на етапі росту ізольованих колоній. Для

цього колонію емульгують на склі у краплі акридинового оранжевого, накрива-

ють покривним скельцем і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. На-

явність тільки зелених паличок свідчить про їх токсигенність. Червоні або зелені

з червоними фрагментами бактерії виявляють при слабкій продукції токсинів або

при повній їх відсутності.

Можна встановити вид і тип токсину в реакції преципітації на склі у агарово-

му гелі з фільтратом та відповідними антисироватками в реакції гальмування in

vitro специфічними антитілами лецитиназної чи лейкотоксичної активності

фільтратів або ранових ексудатів.

Ще швидше і точніше встановлюють види збудників газової гангрени за до-

помогою газової хроматографії, яка дозволяє визначати їх за якісним і кількісним

вмістом насичених і ненасичених жирних кислот.

Діагностику харчових токсикоінфекцій, викликаних C. perfringens типів А і

С, проводять за допомогою бактеріологічного дослідження з метою виділення збуд-

ника, визначення масивності контамінації ним харчових продуктів і типу токсинів.

Виділення чистих культур проводять так само, як і при анаеробній газовій

інфекції (висів матеріалу на середовища Цейслера, Вілліса-Хобса або в трубки

Віньяль-Вейона, отримання ізольованих колоній, чистих культур, ідентифікація).

Таблиця 55

Схема постановки реакцій нейтралізації на білих мишах

Антитоксичні сироватки

№

пробірок

Центри-

фугат

культури,

мл

C.perf-

ringens

C.novyi C.septicum C.sordellii

C.histo-

lyticum

0,85%

розчин

NaCl

1 0,9

0,6 мл

50МО

2 0,9

0,6 мл

50МО

3 0,9

0,6 мл

100МО

4 0,9

0,6 мл

100МО

5 0,9

0,6 мл

100МО

6 0,9 0,6 мл

253

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

При цьому обов’язково сіють10 мл крові хворого в 150-200 мл середовища Кітта-

Тароцці з метою виділення C. perfringens. Із фільтратом культури важливо поста-

вити реакцію нейтралізації на мишах для визначення типу екзотоксину.

Важливо провести і кількісний мікробіологічний аналіз. Для цього дослі-

джуваний матеріал розводять у пептонній воді від 10

-1

до 10

-10

і по 1 мл кожного

розведення засівають у розтоплене і охолоджене до 45 °С середовище Вільсона-

Блера. Через 6-8 год інкубації при температурі 45-46 °С (або 20 год при 37 °С)

відбирають ті проби, в яких виросло 10-30 колоній, і обчислюють кількість бак-

терій в 1 мл посівного матеріалу, враховуючи ступінь розведення і посівну дозу.

Для швидкого виявлення C. perfringens досліджуваний матеріал сіють у про-

бірку з лакмусовим молоком. Через 4-5 год відбувається характерне утворення

губчастого згустка і просвітлення сироватки.

Діагноз харчової токсикоінфекції встановлюють тоді, коли виявляють значне

обсіменіння (10

і більше в 1 г) тих продуктів, що спричинили захворювання, виді-

ляють C. pergringens типів А і С і відповідні екзотоксини, або ж висівають з крові

хворого C. perfringens будь-якого серотипу ( A, B, C, D, E, F).

Діагностика псевдомембранозного коліту. C. difficile є частим нозокоміаль-

ним патогеном, який у 90-100 % випадків викликає це захворювання на фоні нераці-

ональної терапії антибіотиками (ампіцилін, кліндаміцин, цефалоспорини). Вказані

препарати викликають глибокий дисбаланс мікрофлори кишечника і колонізацію

слизової C. difficile. Бактерії продукують 2 види токсинів – ентеротоксин (токсин

А) і цитотоксин (токсин В).

Лабораторний діагноз псевдомембранозного коліту потребує взяття псевдо-

мембран при колоноскопії і виділення збудника з біоптатів слизової оболонки сліпої

кишки або випорожнень. C. difficile висівається майже від усіх хворих за допомо-

гою тих же методів, що і при інших анаеробних інфекціях. “Золотим стандартом”

є цитотоксичний тест: фільтрат фекалій або культури вносять у флакон з моноша-

ром культури клітин, в результаті цього виникає цитопатична дія, що нейтралі-

зується специфічною антисироваткою. На жаль, він досить громіздкий і забирає

багато часу.

Швидка латекс-аглютинація застосовується часто, але вона не є високо-спе-

цифічною і часто дає хибно-позитивні і хибно-негативні результати. Більш точним

і високоспецифічним є імуноферментний аналіз, який дає змогу надійно виявляти

цитотоксин і ентеротоксин C. difficile.

Бактероїдози

Анаеробні інфекції можуть викликати не лише клостридії, а й грамнегативні

поліморфні аспорогенні бактерії з родини Bacteroidaceae. Найчастіше гнійно-сеп-

тичні процеси спричиняють представники родів: Bacteroides (B. fragilis); Prevotella

(P. melaninogenicus та ін.); Fusobacterium (F. nucleatum, F. necrophorum); Veillonella

(V. atipica, V. parvula). Захворювання, що вони викликають, дістали назву бакте-

роїдозів, фузобактеріозів, вейлонельозів. Це можуть бути септицемії, апендици-

254

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ти, перитоніти, менінгіти, абсцеси, гангрени органів, виразки шкіри, ураження

дихальних і сечостатевих шляхів тощо. Часто вони виникають як ускладнення

після оперативних втручань на товстому кишечнику, сечових шляхах, матці, в ро-

товій порожнині.

Діагностика бактероїдозів. Єдиним ефективним методом розпізнавання

захворювань, викликаних бактероїдами, є бактеріологічний. Принцип взяття і

транспортування досліджуваних матеріалів (кров, ліквор, гній, харкотиння, сеча,

кал, шматочки уражених тканин та ін.) такі самі, як і при анаеробній газовій

інфекції. Слід уникати контакту проб з атмосферним повітрям. Найбільш опти-

мальним є взяття аспіратів і доставка їх у шприцах з видаленим повітрям.

Після первинної мікроскопії матеріалу його сіють на спеціальні живильні

середовища (кров’яний, сироватковий, тіогліколевий агар з додаванням екстрактів

з мозкової тканини, геміну, вітаміну К). Культивують у строгих анаеробних умо-

вах в атмосфері 10 % CO

при 37 °С.

У мазках, забарвлених за Грамом, B. fragilis мають вигляд прямих або трохи

зігнутих грамнегативних паличок, без спор і капсул, розташованих поодинці, па-

рами або короткими ланцюжками з 3-4 клітин (див. вкл., рис. 18). При забарв-

ленні метиленовим синім часто фарбуються біполярно.

Бактероїди ростуть повільно (5-7 днів). Колонії B. fragilis дрібні (до 1 мм),

трохи вгнуті, сірувато-білі, без зон гемолізу. B. melaninogenicus на кров’яних

середовищах утворює гладенькі або шорсткі колонії діаметром 1-3 мм чорного

кольору, інколи із зоною гемолізу навколо них.

Виділені чисті культури ідентифікують за морфологічними, культуральними

і біохімічними властивостями. Штами B. fragilis розкладають глюкозу, лактозу,

сахарозу, не ферментують рамнозу, не утворюють індолу, але виділяють сірково-

день. Ключові ознаки для ідентифікації виду – ріст на середовищі з 20 % жовчних

солей, резистентність до канаміцину (100 мкг), ванкоміцину (5 мкг) і колістину

(10 мкг), яку визначають методом дисків.

Культури B. melaninogenicus розкладають глюкозу, лактозу і сахарозу, не фер-

ментують маніт, гідролізують крохмаль і глікоген. Ключовими ознаками виду є

утворення пігменту, відсутність росту на жовчних середовищах, чутливість до

колістину, стійкість до ванкоміцину і канаміцину.

Слід пам’ятати, що бактероїдози є класичними поліінфекціями. У зв’язку з

цим монокультури виділяються рідко, а частіше у вигляді асоціацій із клостриді-

ями, фузобактеріями, вейлонелами. Це значною мірою ускладнює проведення

мікробіологічної діагностики. Монокультури бактероїдів легко виділити при по-

сівах крові та спинномозкової рідини.

При септицеміях, тяжких запальних і гангренозних процесах у крові хворих

швидко і в значних кількостях виробляються антитіла. Це дає можливість провес-

ти серологічні дослідження. Високі титри антитіл визначають за допомогою ре-

акцій аглютинації, преципітації в гелі і непрямої гемаглютинації.

Діагностика фузобактеріозів. Гнійні і гангренозні процеси, особливо в ро-

товій порожнині, в верхніх дихальних шляхах і сечостатевих органах можуть спри-

255

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Рис. 77. F. nectophorum (1)

i T. vincetii (2).

чинити і фузобактерії. Лабораторну діагностику захворювань проводять за тими

ж методами, що і при інших анаеробних інфекціях. Використовують мікроскопіч-

ний, бактеріологічний і біологічний методи.

Бактеріоскопічні дослідження проводять при діагностиці уражень шкіри

і слизових оболонок. Матеріал для виготовлення мазків беруть на межі здорової і

ураженої тканини. Для забарвлення використовують метод Грама або Лефлера.

При мікроскопії F. nucleatum і F. necrophorum виглядають як довгі грамнегативні

бактерії веретеноподібної форми із загостреними кінцями, інколи з гранулами в

середині клітин. Вони не мають ні спор, ні капсул.

Для бактеріологічного дослідження беруть гній із виразок або порожнин при

ураженні внутрішніх органів. Посіви роблять на сироваткові і кров’яні середови-

ща. Асцитична рідина, цистеїн, екстракт із дріжджів і вуглекислий газ стимулю-

ють ріст фузобактерій. Вони ростуть у присутності генціанового фіолетового та

інших барвників, що використовують для виготовлення селективних середовищ.

На печінковому або серцево-мозковому бульйоні з глюкозою під вазеліновим мас-

лом фузобактерії утворюють гранулярний і слизовий осад та помутніння з харак-

терним запахом сиру. На сироватковому агарі в строго анаеробних умовах вони

ростуть у вигляді маленьких (1-2 мм), круглих, опуклих, непрозорих колоній із

жовтуватим центром. На кров’яному агарі навколо них виникають зони гемолізу.

В разі отримання чистих культур їх ідентифікують за морфологічними, куль-

туральними і біохімічними ознаками. Ріст фузобактерій пригнічують жовчні кис-

лоти, колістин і канаміцин, але не ванкоміцин. Вони утворюють велику кількість

масляної кислоти.

Практичне значення має виявлення симбіозу Fusobacterium necrophorum і

Treponema vincentii при ерозивно-некротичній ангіні Симановського-Плаута-Вен-

сана, а також при ерозивно-некротичних ураженнях чоловічих і рідше жіночих

статевих органів.

Мікробіологічна діагностика цих захворювань часто обмежується мікроско-

пічним дослідженням патологічного матеріалу (рис. 77).

Біологічний метод частіше використовують при роботі з сильно забрудненим

сторонньою мікрофлорою матеріалом, який вво-

дять білим мишам підшкірно біля кореня хвоста.

Після загибелі тварин у місці некрозу на межі здо-

рової і ураженої тканини легко виявляють збудни-

ка мікроскопічно або виділяють його чисту куль-

туру при некротичній ангіні.

Діагностика вейлонельозу. Дрібні, грамнега-

тивні аспорогенні анаеробні коки (вейлонели) по-

стійно знаходяться в ротовій порожнині, дихаль-

них шляхах і кишечному тракті як представники

фонового мікробіоценозу. Самостійно вони рідко

спричиняють розвиток патологічних процесів. Ча-

стіше в асоціації з іншими патогенними анаероба-

256

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ми і аеробами здатні викликати абсцеси м’яких тканин, ранові інфекції і навіть

септичні стани.

При лабораторній діагностиці вейлонельозу патологічний матеріал досліджу-

ють мікроскопічно і бактеріологічно. У мазках, забарвлених за Грамом, V. atipica

і V. parvula мають вигляд кокоподібних бактерій діаметром 0,3-0,5 мкм, що розта-

шовуються парами, короткими ланцюжками або хаотичними скупченнями.

На молочному агарі в анаеробних умовах основні види вейлонел утворюють

непрозорі, ромбо- або зіркоподібні колонії розміром 1-3 мм. Вони не виділяють

каталазу, не розкладають вуглеводів, не розріджують желатин, не утворюють індол,

стійкі до ванкоміцину (500 мкг). Виділено декілька сероварів кожного виду, але

серологічна ідентифікація вейлонел у звичайних бактеріологічних лабораторіях

не проводиться.

Пептококові і пептострептококові анаеробні інфекції. В окремих випад-

ках гнійні і гнійно-септичні захворювання (плеврит, тонзиліт, пієліт, цистит, апен-

дицит, післяпологовий сепсис, нагноєння ран та ін.) викликають грампозитивні

коки родини Peptоcoccaceae. Ці умовно-патогенні мікроорганізми належать до

двох родів: Peptococcus (основні види – P. niger, P. activus) і Peptostreptococcus

(P. anaerobius, P. productus, P. prevotii). Вони належать до фонової мікрофлори сли-

зових оболонок і порожнин здорових людей. Від хворих виділяються переважно в

асоціаціях з іншими бактеріями і дуже рідко як монозбудники.

Матеріалом для дослідження служить гній, слиз, кров, сеча, випорожнення,

рановий вміст тощо. Лабораторна діагностика включає мікроскопію клінічного

матеріалу і посіви з метою виділення чистих культур чи їх асоціацій.

У мазках, забарвлених за Грамом, пептококи дуже нагадують стафілококів. Вони

розташовуються групками, парами, тетрадами. Петострептококи мають кулясту або

овоїдну форми, розташовуються у вигляді ланцюжків, рідше парами.

Для посівів найчастіше використовують кров’яний агар (краще з додаванням

геміну, вітаміну К, неоміцину), рідше – агар на основі настою серця бика і тканини

мозку, середовище для вирощування бруцел, тіогліколевий бульйон. На кров’яних

середовищах в анаеробних умовах через 48 год колонії пептококів і пепто-

стрептококів дрібні, круглі, опуклі, як правило, прозорі. Колонії Peptostreptococcus

anaerobius дещо більші за розміром, каламутні, мають характерний солодкуватий

запах. Штами Peptococcus niger утворюють чорні колонії. Культури анаеробних коків

не чутливі до дії неоміцину, який пригнічує ріст грамнегативних бактерій, особливо

протею, що полегшує виділення культур із матеріалів, густо контамінованих супут-

ньою мікрофлорою. Peptostreptococcus anaerobius дуже чутливий до атенолсульфа-

ту натрію, що використовують для диференціальної діагностики методом дисків.

Виділені культури анаеробних коків ідентифікують за морфологічними, куль-

туральними і біохімічними ознаками. Пептококи не розкладають вуглеводів, не

розріджують желатин, але виділяють сірководень. Peptostreptococcus anaerobius

ферментує лише глюкозу, а Peptostreptococcus productus – глюкозу, лактозу, маль-

тозу, маніт і ксилозу, звурджує молоко.

Серологічні методи діагностики поки що тільки розробляються.

257

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Дифтерія

Дифтерія – гостра, переважно дитяча інфекційна хвороба, яка проявляється

характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника та сильною

інтоксикацією організму дифтерійним екзотоксином. Збудником її є Coryne-

bacterium diphtheriaе, що належить до роду коринебактерій. До цього роду вхо-

дить ще біля 20 видів бактерій, патогенних для людей, тварин і рослин. З них

найбільше значення для практичної медицини мають наступні:

1. C. ulcerans – може викликати фарингіти, ураження шкіри; її виявляють і в

здорових людей, у молочних продуктах і тарі для їх перевезення; деякі штами

токсигенні.

2. C. jeikeium (раніше коринебактерії JK) – спричиняє пневмонію, ендокар-

дит, перитоніт, інфікує рани, шкіру.

3. C. cistitidis (раніше коринебактерії групи D2) – ініціює утворення камінців

у сечовивідних шляхах та пневмонію.

4. C. minutissimum – викликає еритразми, абсцеси легень, ендокардити.

5. C. haemolyticum – може викликати тонзиліти, целюліти, абсцеси мозку,

остеомієліти, хронічні дерматити.

6. С. xerosis – раніше вважали збудником ксерозу (хронічного кон’юнктиві-

ту), тепер її відносять до сапрофітів.

7. C. pseudodiphtheriticum – сапрофіт, проживає на слизовій оболонці носо-

глотки людини.

Взяття і доставка матеріалу до лабораторії. Матеріалом для досліджен-

ня є плівка з мигдаликів, дужок, піднебіння, язичка, слиз із зіва та носа, рідше

виділення з ока, вуха, рани, піхви, ураженої ділянки шкіри. На вимогу епідеміоло-

га досліджують змиви з іграшок та інших предметів, деякі харчові продукти (мо-

локо, морозиво тощо). Матеріал потрібно брати до початку етіотропного лікуван-

ня натще або через 2 год після прийому їжі.

Для взяття матеріалу використовують тампони, сухі або попередньо змочені

5 % розчином гліцерину, вміщені в пробірку й простерилізовані разом з нею. До-

сліджуваний матеріал із ротоглотки і носа беруть двома окремими тампонами,

намагаючись взяти його на межі здорової й ураженої ділянки обертальними руха-

ми, не торкаючись тампоном слизової щік, зубів та язика, який притискають шпа-

телем. При ларингоскопії плівку або слиз беруть безпосередньо з гортані. Плівки

та слиз із рота і носа беруть обов’язково в усіх випадках, навіть при дифтерії

рідких локалізацій (шкіра, рана, око, вухо, вульва).

Якщо необхідно провести первинну бактеріоскопію на вимогу лікаря, матеріал

беруть окремим (додатковим) тампоном або направляють частину знятої плівки,

ретельно розтертої між двома предметними скельцями.

Тампони після забору матеріалу вміщують у ті ж самі пробірки, на яких над-

писують номер, дату і час відбору, прізвище лікаря. Вони повинні бути доставлені

до лабораторії не пізніше 3-х год після взяття матеріалу. Якщо схема забору перед-

бачає посів біля ліжка хворого, то пробірки і чашки з посівами негайно направля-

258

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

ють до лабораторії або інкубують при 37 °С і доставляють через 20-23 год, в хо-

лодну пору в сумках із грілками.

Бактеріоскопічне дослідження матеріалу від хворого проводять лише на

вимогу лікаря і тільки для того, щоб розпізнати некротичну ангіну Симановсько-

го-Плаута-Венсана (виявлення веретеноподібних паличок і спірохет Венсана, які

при звичайних методах культивування не ростуть).

Впродовж багатьох років мікроскопічне дослідження і виявлення зерен во-

лютину, забарвлених за методами Леффлера і Нейссера, було основою лаборатор-

ної діагностики дифтерії та виявлення бактеріоносійства. Тепер, у зв’язку з мінли-

вістю дифтерійних бактерій під впливом антибіотиків, первинна мікроскопія

досліджуваного матеріалу не рекомендується.

Бактеріоскопічне дослідження проводиться з метою ідентифікації нетипо-

вих колоній на кров’яно-телуритових середовищах та при перевірці чистоти виді-

лених культур. Мазки забарвлюють за Грамом, Леффлером і Нейссером. Можна

також фарбувати їх оцтовокислим метиловим фіолетовим, толуїдиновим синім

або бентіазоловим і тіазиновим барвниками.

Дифтерійні палички в мазках розташовуються під кутом, у вигляді латинсь-

ких літер V, X, Y, або утворюють скупчення, що нагадують купку розкиданих

сірників. Волютинові зерна розташовуються, як правило, на полюсах мікробних

клітин. (див. вкл., рис. 17 і 18). Псевдодифтерійні бактерії та дифтероїди розмі-

щуються паралельно (у вигляді “частоколу”) і, звичайно, не мають зерен волюти-

ну. Зерна Бабеша-Ернста можна також виявити за допомогою люмінесцентної

мікроскопії при забарвленні мазків корифосфіном. Зерна набувають оранжево-

червоного кольору на фоні жовто-зелених тіл бактерійних клітин.

Бактеріологічне дослідження. Клінічний матеріал засівають на кров’яний

агар і кров’яно-телуритовий агар (або середовище Клауберга ІІ), розлиті у чашки

Петрі. Посів на кров’яний агар необхідний для виявлення й іншої мікрофлори.

Крім того, деякі штами C.diphtheriae чутливі до дії телуриту калію, тому їх ріст на

телуритових середовищах може пригнічуватись. Для виявлення дифтерійного бак-

теріоносійства посіви роблять тільки на кров’яно-телуритовий агар, оскільки в

посівному матеріалі може міститись невелика кількість дифтерійних паличок, ріст

яких на неселективних середовищах буде пригнічуватись іншою мікрофлорою.

При цьому допускається використання і транспортного середовища.

Кров’яно-телуриновий агар. До 100 мл 2 % розплавленого й охолодженого до 50 °С

живильного агару рН 7,6 добавляють 10-15 мл дефібринованої крові та 2 мл 2 % розчину

телуриту калію. Суміш ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі ша-

ром, товщиною 3-4 мм.

Середовище Клауберга ІІ. До 100 мл 3 % живильного агару рН 7,6, розплавленого й

охолодженого до 50 °С, додають 3 мл 2 % розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової

суміші та 50 мл гемолізованої крові. Гліцеринову суміш готують шляхом додавання 20 мл

стерильного гліцерину до 40 мл дефібринованої крові. Суміш можна зберігати в холо-

дильнику протягом 4-х місяців. Для приготування гемолізованої (“лакової”) крові до 34

мл стерильної дистильованої води додають 16 мл дефібринованої крові.

259

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Транспортне напіврідке середовище. До 100 мл перевару Хоттінгера або м’ясо-пеп-

тонного бульйону додають 1 г будь-якого комерційного агару, встановлюють рН 7,6, сте-

рилізують в автоклаві при 112 °С 30 хв, асептично додають 10 мл сироватки та 1 мл 2 %

телуриту калію. Середовище розливають у пробірки по 5 мл. При можливості використову-

ють і більш складне транспортне середовище ЕМЕС (AMIES), модифіковане Стюартом.

Посів від одного хворого роблять на одну чашку, використовуючи при цьому

одну половину середовища для посіву із ротоглотки (мигдаликів, дужок, язичка),

а другу – для посіву іншим тампоном із носа. Якщо є досліджуваний матеріал із

шкіри, ока, вуха та інших локалізацій – додають ще одну чашку. Не можна засіва-

ти матеріал від кількох хворих на одну чашку. Середовища перед посівом зігріва-

ють у термостаті 15-20 хв.

При посіві досліджуваного матеріалу його втирають тампоном спочатку в

окрему ділянку кров’яного агару площею 2×1 см, потім аналогічно на кров’яно-

телуритовому агарі (або середовищі Клауберга ІІ), при цьому тампон весь час по-

вертають, щоб засіяти з нього весь матеріал. Потім тим же тампоном штрихами

засівають решту поверхні середовища (половину чашки). Така техніка посіву доз-

воляє отримати ізольовані колонії (чисту культуру), які використовують безпосе-

редньо з чашки для визначення токсигенності та подальшої їх ідентифікації. Засі-

яні чашки або пробірки з транспортним середовищем інкубують у термостаті при

37 °С протягом 20-24 год.

На другий день за допомогою стереоскопічного мікроскопа досліджують ха-

рактер колоній. Якщо ріст відсутній на обох середовищах, роблять повторний забір

матеріалу.

Чашки з типовими і підозрілими на C.diphtheriae колоніями відбирають для

подальшої ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопію підозрілих ко-

лоній можна і не проводити.

Колонії дифтерійних паличок на кров’яному агарі білуватого або жовтуватого

кольору, непрозорі, круглої, злегка опуклої форми, діаметром 1-2 мм. Звичайно

вони мають маслянисту консистенцію, хоч деякі можуть утворювати крихкі шорсткі

R-колонії.

На кров’яно-телуритових середовищах колонії C.diphtheriae через 24 год росту

мають сірий колір, опуклі, з рівним краєм, в’язкі. Через 48 год вони набувають

темно-сірого або чорного кольору з металевим блиском, рівними або злегка фестон-

частими краями, гладенькою або з радіально посмугованою поверхнею (R-фор-

ми), в’язкі чи крихкі при дотику петлею.

За структурою 48-годинних колоній на телуритових середовищах і деякими

ферментативними ознаками збудника дифтерії поділяють на чотири культураль-

но-біохімічних варіанти (біовари) – gravis, mitis, belfanti, intermedius.

Біовар gravis звичайно утворює сірі або чорні матові сухі колонії, крихкі,

плоскі, гладенькі, діаметром 1,5-2 мм, із радіально посмугованою поверхнею; він

високотоксичний, не викликає гемолізу, розкладає крохмаль і глікоген.

Біовари mitis та belfanti ростуть у вигляді сірих або чорних, круглих гладень-

ких опуклих колоній з рівними краями, діаметром 1-1,5 мм; ці варіанти менш ток-

сичні, викликають гемоліз, але не розкладають крохмаль і глікоген.

260

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Біовар intermedius утворює дрібні, сірі, прозорі колонії, діаметром 0,5-1 мм,

із плоскою гладенькою поверхнею; він слаботоксичний, не розщеплює крохмалю

і глікогену (див. вкл., рис. 19 і 20).

Якщо типовий ріст відсутній, з інших, сумнівних колоній готують мазки. При

виявленні в них спорових паличок, коків, дріжджів та ін., дослідження на дифте-

рію припиняють і дають негативну відповідь. Проте, важливо пам’ятати, що диф-

терійні бактерії, які утворили нетипові колонії на середовищах з інгібіторами росту

(телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, але зберігають поліморфізм

та характерне розташування.

При рості типових колоній відразу ж приступають до вивчення їх токсиген-

ності та ідентифікації. Токсигенні властивості досліджують не менше як у 2-х

ізольованих колоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середови-

ще для визначення токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а

другої половини – на скошений сироватковий агар для виділення чистої культури

та збереження її до закінчення лабораторної діагностики. В разі, якщо на чашці

виростають одночасно токсигенні та нетоксигенні різновиди C. diphtheriaе, необ-

хідно при множинному рості підозрілих колоній дослідити токсигенні властивості

біля 20 колоній, засіваючи в одну бляшку матеріал із 5-6 колоній. При рості лише

однієї колонії, її засівають на середовище для визначення токсигенності і, не про-

жарюючи петлю, – у пробірку із середовищем Пізу.

Якщо застосовували транспортне середовище, висів із нього роблять на щільні

кров’яно-телуритові середовища.

На третій день, при появі специфічних ліній преципітації в агаровому гелі й

позитивній пробі на цистиназу, виділену культуру визначають як токсигенну

С. diphtheriае. Якщо лінії преципітації через 24 год відсутні, чашки інкубують ще

протягом доби. В разі негативної проби Пізу культуру ідентифікують як інший

вид коринебактерій.

Чисту культуру на скошеному сироватковому агарі висівають на вуглевод-

неві середовища з глюкозою, сахарозою, розчинним крохмалем, ставлять проби

на виявлення уреази, піразинамідази та нітратредуктази.

На четвертий день роблять облік результатів усіх посівів і видають аргумен-

тований бактеріологічний висновок про виділену культуру.

Використовують такі методи ідентифікації коринебактерій.

Визначення токсигенності in vitro. В його основі лежить взаємодія токси-

ну з антитоксином в агаровому гелі. В місцях оптимального кількісного співвідно-

шення токсину й антитоксину в товщі агару випадає преципітат у вигляді тонких

ніжних білих ліній (“стріли”, “вусики”). Цей тест в багатьох країнах за кордоном

називають Елек-тестом.

Пробу на токсигенність, як правило, проводять із чистими культурами. Мож-

на визначити її і з культурами, забрудненими сторонньою мікрофлорою, що на

добу прискорює лабораторну діагностику дифтерії. Але при негативній пробі її

повторюють з виділеною чистою культурою.

Для постановки цієї проби мікробіологічна промисловість випускає спеці-

альне сухе стандартне середовище для визначення токсигенності дифтерійних