Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

271

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

глюкозно-гліцеринового бульйону. Матеріал щільної консистенції емульгують в

ізотонічному розчині хлориду натрію і сіють на гліцериновий чи кров’яний агар з

телуритом калію або поліміксином (1-5 мкг/мл). Якщо досліджуваний матеріал

дуже забруднений сторонньою мікрофлорою, краще спочатку ввести його білим

мишам або гвінейським свинкам і після їх загибелі з печінки і селезінки зробити

мазки-відбитки та посіви. Засіяні середовища інкубують при 37 °С протягом 7 діб,

щоденно контролюючи наявність росту шляхом бактеріоскопії.

У рідких середовищах через добу настає помутніння і утворюється складча-

ста плівка. На триптозному або гліцериновому агарі при дослідженні в косому

освітленні колонії 24-годинного віку мають голубувато-зелений колір. У мазках із

бульйонних і агарових культур лістерії виглядають як короткі, товстуваті кокобак-

терії, які не мають ні спор, ні капсул, розташовуються поодинці або невеликими

групками. Серовари виділених штамів визначають за допомогою реакції аглю-

тинації з антилістеріозними сироватками, в першу чергу 1-го та 4-го сероварів.

Позитивним вважають результат, якщо аглютинація відбулася в розведенні не мен-

ше 1/4 титру.

Ідентифікацію виділених культур здійснюють за морфологічними, тінкторі-

альними, культуральними, біохімічними і антигенними властивостями. Лістерії

слаборухливі, каталазопозитивні, ферментують до кислоти глюкозу, мальтозу, са-

ліцин, не розкладають маніт і гліцерин. Свіжі культури дають позитивну кон’юн-

ктивальну пробу у гвінейських свинок. Через 2 години після внесення краплі буль-

йонної культури лістерій у кон’юнктивальний мішок розвивається гнійне запа-

лення кон’юнктиви.

Серологічне дослідження. Починаючи з другого тижня захворювання вико-

ристовують реакцію аглютинації (титр 1:320-1:5000). При низькому титрі антитіл

цю реакцію слід повторити. Більш достовірною і специфічною є реакція непрямої

гемаглютинації (титр 1:80 і вище). Вона дає позитивні результати у 85-90 % хво-

рих на лістеріоз після 10-13-го дня захворювання. Її застосовують і для виявлення

хронічного лістеріозу. Реакція зв’язування комплементу стає позитивною у більш

віддалені строки, її діагностичний титр 1:10 і вище. З діагностичною метою вико-

ристовують реакцію імунофлуоресценції і рідко – реакцію преципітації.

Біологічна проба. Досліджуваний матеріал, особливо при забрудненні його

супутньою мікрофлорою, вводять підшкірно білим мишам. Через три тижні при

позитивному результаті у тварин виникають паралічі задніх кінцівок і порушення

координації рухів. Із печінки та селезінки тварин, що загинули, роблять мазки-

відбитки та посіви на живильні середовища.

Алергічну пробу із стандартним корпускулярним антигеном, або антигеном,

отриманим шляхом кислотного гідролізу культури лістерій, ставлять на 6-9-й день

захворювання. Його вводять внутрішньошкірно в об’ємі 0,1 мл. Результат врахо-

вують через 24-48 год. Пробу вважають позитивною, якщо виникає гіперемія шкіри

та інфільтрат діаметром 1-2 см.

272

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Туберкульоз

Туберкульоз – первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку

викликають патогенні мікобактерії. Залежно від локалізації уражень виділяють

туберкульоз легень, шкіри, лімфатичних вузлів, мозкових оболонок, кісток і сугло-

бів, органів сечостатевої системи і черевної порожнини. Для сучасного періоду

характерне збільшення захворюваності, тяжкий перебіг, підвищення смертності і

поява значної кількості штамів, резистентних до багатьох протитуберкульозних

препаратів.

В Україні туберкульоз у людини найчастіше викликають Mycobaсterium

tuberculosis і M. bovis. Дуже рідко це захворювання спричиняє M. avium. В країнах

Африки, Америки та інших континентів подібні до туберкульозу захворювання

викликають M. africanum, M. asiaticum, M. kаnsasii, M. fortuitum, M. ulcerans та ін.

Ці хвороби називають мікобактеріозами. Ще один представник із роду мікобак-

терій – M. lepraе – є збудником прокази. Всього нараховують понад 40 видів міко-

бактерій, 24 з них є патогенними і потенційно патогенними.

Лабораторна діагностика туберкульозу і мікобактеріозів включає проведен-

ня мікроскопічних, бактеріологічних, біологічних, серологічних досліджень і по-

становки алергічних проб. Основним методом є виділення чистої культури збуд-

ника, його ідентифікації та визначення чутливості до протимікробних препаратів.

Взяття матеріалу для дослідження. Патологічним матеріалом служать

харкотиння, слиз із задньої стінки глотки, плевральний ексудат, гній, спинномоз-

кова рідина, промивні води бронхів і шлунка, сеча, випорожнення, пунктати, рідше

кров та ін. Хворий збирає харкотиння в баночку або кишенькову плювальницю.

Кращі результати отримують при дослідженні харкотиння, зібраного протягом 12-

24 год. Інші матеріали збирають у стерильні банки або пробірки. На них наклею-

ють етикетку з прізвищем та ініціалами хворого, групу диспансерного обліку, мету

дослідження і направляють до лабораторії. Зібраний клінічний матеріал вважа-

ють потенційно патогенним.

Бактеріоскопічний метод. Безпосередньо з харкотиння або осаду, який отри-

мують після центрифугування гомогенізованого матеріалу, виготовляють мазки.

Харкотиння переносять у чашку Петрі, розташовану на темному фоні. За допомо-

гою пінцета вибирають слизово-гнійні жмуточки, переносять їх на середину пред-

метного скла, накривають другим предметним склом і розтирають матеріал між

скельцями. Так само готують мазки з гною та пунктатів. Спинномозкову рідину

відстоюють протягом 18-20 год у холодильнику і утворену ніжну сіточку фібрину

обережно розправляють на предметному склі. Сечу центрифугують і мазки виго-

товляють з осаду. Саме ці мазки знебарвлюють не лише кислотою, а й спиртом

для диференціації туберкульозних бактерій від M. smegmatis, яка може знаходи-

тися у сечі здорових людей.

Висушені мазки фіксують сухим жаром, забарвлюють за методом Ціля-Нільсе-

на або аурамін-родаміном чи іншим флуорохромом. У препаратах, зафарбованих

за Цілем-Нільсеном, збудник туберкульозу має вигляд тонких суцільних паличок

273

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

рубіново-червоного кольору, що розташовані поодинці або групками переважно

поза клітинами (див. вкл., рис. 2).

Аурамін-родаміном мазки фарбують протягом 15 хв із підігріванням, потім

промивають водою, на 30 с занурюють у солянокислий спирт і знову ретельно

промивають водою. Якщо при мікроскопії фон мазка має сильну флуоресценцію,

потрібно дещо погасити її 0,25 % водним розчином метиленового синього, промити

водою, висушити і досліджувати під люмінесцентним мікроскопом. Туберкульоз-

ні палички світяться золотавим світлом на темно-зеленому фоні. Як флуорохроми

використовують також аурамін, акридиновий оранжевий та ін. Для виявлення

L-форм мікобактерій застосовують переважно фазово-контрастну мікроскопію.

Позитивну відповідь дають при виявленні туберкульозних паличок у мазку

після перегляду не менше 100 полів зору, обов’язково вказуючи кількість бактерій

у кожному полі зору. Негативний результат мікроскопії не дає права виключити

діагноз туберкульозу.

Суттєвим недоліком бактеріоскопічного методу є невисока чутливість: міко-

бактерії можна виявити в мазку лише при наявності 50-100 тис. мікробних тіл в

1 мл патологічного матеріалу. Окрім того, за цим методом неможливо відрізнити

збудника туберкульозу від інших мікобактерій та визначити його чутливість до

хіміопрепаратів. Для підвищення частоти знаходження мікобактерій туберкульо-

зу в досліджуваному матеріалі (особливо в харкотинні) застосовують методи зба-

гачення – гомогенізації та флотації.

Метод гомогенізації. Добову порцію харкотиння вносять у флакон, добавля-

ють рівний об’єм 1 % розчину NaOH, щільно закривають гумовою пробкою і стру-

шують у шюттель-апараті 10-15 хв до повного розрідження. Гомогенізовану ріди-

ну центрифугують, декантат зливають у розчин хлораміну, осад нейтралізують

2-3 краплями 10 % розчину соляної або 30 % оцтової кислоти. З осаду готують

мазки, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують.

Метод флотації. Порцію харкотиння (10-15 мл) гомогенізують, як вище опи-

сано. Колбочку або флакон із розрідженим матеріалом ставлять на водяну баню

при 55 °С на 30 хв, потім добавляють 0,5-1 мл ксилолу (бензолу, бензину, толуолу),

струшують 10 хв і відстоюють півгодини. Ксилол разом з адсорбованими мікобак-

теріями спливає на поверхню і утворює вершкоподібний шар. Доливають дисти-

льовану воду, щоб цей шар піднявся у горлечко колбочки чи флакона. Стерильною

пастерівською піпеткою частину ксилолового шару переносять на предметне скло,

яке нагрівають на скляній пластинці, що лежить на водяній бані при температурі

60 °С. Висушений мазок покривають новою порцією з вершкоподібного матеріа-

лу, знову висушують і так повторюють до тих пір, поки весь флотаційний шар

перенесуть на мазок. Препарат промивають ефіром, висушують, фіксують сухим

жаром, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Методи гомогенізації та

флотації на 10 % підвищують знаходження мікобактерій туберкульозу в дослі-

джуваному матеріалі. При цьому їх вдається виявити, якщо в 1 мл харкотиння

знаходиться більше тисячі мікробних тіл.

Промивні води бронхів і шлунка також можна досліджувати за допомогою

гомогенізації або флотації.

274

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Бактеріологічний метод діагностики значно ефективніший, ніж бактеріо-

скопічний. Він дає змогу виявити в 1 мл досліджуваного матеріалу 20-100 і більше

мікобактерій. Його використовують не лише для постановки діагнозу хвороби, а й

для контролю ефективності хіміотерапії, визначення вірулентності і стійкості міко-

бактерій до антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів, виявлення

змінених варіантів, особливо L-форм.

Майже всі досліджувані матеріали від хворих на туберкульоз (окрім крові,

спинномозкової рідини) містять супутню мікрофлору. Тому виділити чисту куль-

туру мікобактерій без попередньої їх обробки неможливо. Для знищення сторонніх

мікроорганізмів харкотиння, гній, промивні води та інші матеріали обробляють

20 хв при кімнатній температурі подвійним об’ємом 6 % розчину сірчаної кисло-

ти або 10 % розчином тринатрійфосфату при 37 °С протягом 18-20 год. Потім

оброблений матеріал центрифугують, рідку частину зливають, а осад нейтралізу-

ють, добавляючи 1-2 краплі 3 % розчину NaOH, або трикратно відмивають від

кислоти ізотонічним розчином хлориду натрію.

Після нейтралізації матеріал засівають у 3-6 пробірок із щільним середови-

щем Левенштейна-Йенсена (картопляний крохмаль з гліцерином, солями, яєчною

суспензією і малахітовим зеленим) та Фінна-2, яке має такий же склад, як і попе-

реднє, але в ньому аспарагін замінено на глютамінат натрію. Ці середовища реко-

мендовані ВООЗ як стандартні в усіх країнах світу для первинного вирощування

мікобактерій туберкульозу та визначення їх стійкості до хіміопрепаратів. Для інших

потреб можна також використовувати гліцериновий бульйон, середовище Петра-

ньяні, Павловського, Сотона.

Спинномозкову рідину, ексудат, кров, пунктат вносять піпеткою на живильне

середовище без попередньої їх обробки. Всі ватні пробки зрізають на рівні вінця

пробірки, проштовхують всередину на 1-1,5 см і заливають розтопленим пара-

фіном для попередження висихання середовища.

Засіяні пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 3-4 тижнів. Ті

пробірки з середовищами, на які матеріали сіяли петлею і втирали в поверхню

агару, розміщують вертикально. Якщо посіви робили пастерівською піпеткою,

пробірки вміщують у термостаті в похилому положенні на 2-3 доби, потім верти-

кально. Посіви проглядають кожні 5-7 днів. Всі пробірки з раннім ростом сторон-

ньої мікрофлори вилучають. У випадках раннього росту характерних колоній (до

5-го дня) роблять висновок про наявність швидкоростущих мікобактерій, тобто

негативну відповідь щодо туберкульозу.

Ріст туберкульозних бактерій частіше всього появляється через 3 тижні, але

бувають випадки й через 2-3 місяці. На щільних середовищах виростають грубі,

шорсткі, сухі, безпігментні колонії, що мають зморщену поверхню, потовщений

центр і тонкі, нерівні краї. За зовнішнім виглядом вони нагадують дольки цвітної

капусти або бородавки.

Це типові R-форми колоній, властиві патогенним штамам. S-форма колоній

жовтого або оранжевого кольору, як правило, характерна для інших видів міко-

бактерій. Але під впливом антибактеріальних препаратів M. tuberculosis також

275

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

може утворювати м’які, вологі, пігментовані S-форми колоній. Необхідно відмічати

швидкість і рясність росту.

Значно рідше досліджуваний матеріал сіють на гліцериновий бульйон, рідкі

середовища з плазмою крові, бичачою сироваткою або синтетичне середовище

Сотона. На них мікобактерії туберкульозу ростуть дещо швидше, мають вигляд

ніжної плівки, яка з часом потовщується, грубішає, стає крихкою і випадає в осад.

Із рідких середовищ роблять висів у пробірки із щільним середовищем, що

збільшує число позитивних результатів, але дослідження триває довше.

Щоб підвищити частоту висівання збудника туберкульозу, досліджуваний

матеріал обробляють детергентами, які мають бактерицидну дію на іншу мікро-

флору (лауросепт, лаурисульфат натрію, родолан, теапол, цетавлон тощо). При

цьому покращується гомогенізація матеріалу, виключається центрифугування,

швидше виростають колонії.

Прискорені методи культивування. Щоб значно швидше отримати ріст міко-

бактерій туберкульозу, запропоновані методи мікрокультур Прайса і Школьнікової.

Метод Прайса полягає в тому, що харкотиння, гній, осад сечі, промивні води та

інший матеріал наносять товстим шаром на декілька вузьких предметних скелець

(звичайні скельця розрізають навпіл по довжині). Висушені мазки беруть стериль-

ним пінцетом і занурюють на 15-20 хв у пробірки з 2 % розчином сірчаної кисло-

ти, а потім тричі промивають стерильним розчином хлориду натрію для видален-

ня кислоти. Після цього препарат вміщують у пробірки або флакони з рідким сере-

довищем Сотона або цитратною кров’ю. Мазок повинен повністю покриватись

живильним середовищем. Для пригнічення сторонньої мікрофлори, яка може

інколи залишатись після обробки мазків кислотою, в середовище добавляють

10 ОД/мл пеніциліну. Посіви вирощують у термостаті при 37-38 °С. Через 3-4 доби

скельця з мазками виймають, фіксують сухим жаром, забарвлюють за Цілем-

Нільсеном або родаміном і мікроскопують. Вірулентні мікрокультури в препара-

тах утворюють джгути або “коси”, що формуються під впливом корд-фактора.

Максимальний ріст мікрокультур відмічається на 7-10 день (див. вкл., рис. 21).

Глибинне культивування мікобактерій у гемолізованій крові за методом Школь-

нікової отримують шляхом посіву матеріалу, обробленого, як звичайно, сірчаною

кислотою і промитого 0,85 % розчином хлориду натрію. Через 6-8 днів вирощу-

вання культуру центрифугують, з осаду виготовляють мазки, забарвлюють за мето-

дом Ціля-Нільсена або флуорохромом і мікроскопують. У препаратах виявляють

типові мікрокультури з характерним розташуванням у вигляді кіс і джгутів.

Щоб виявити L-форми мікобактерій туберкульозу, посів матеріалу після відпо-

відної обробки кислотою проводять у спеціальне напіврідке середовище, розлите

в пробірки у вигляді стовпчика. Вирощують при 37 °С протягом 1-2 міс. Ріст L-форм

нагадує хмаринку з дуже дрібними включеннями, що подібні до манної крупи.

Виготовлені мазки досліджують під фазово-контрастним мікроскопом, за допо-

могою якого найкраще виявляють різноманітні за морфологією L-форми. Їх мож-

на виявити і шляхом послідовних пасажів на гвінейських свинках або за допомо-

гою імунофлуоресцентного методу з використанням сироваток, що містять мічені

антитіла проти антигенів L-форм.

276

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

Для ідентифікації виділених культур збудників туберкульозу і диференціації

їх від інших видів мікобактерій використовують багато ознак. Основними з них є

вірулентність, швидкість росту, форма колоній, утворення пігменту, каталази, уре-

ази, нікотинамідази, нітратредуктази (табл. 58).

Таблиця 58

Властивості мікобактерій, що використовуються для їх ідентифікації

Вид

Час росту,

дні

Каталаза,

Уреаза

Нікотин-

амідаза

Ніаци-

наза

Нітратре-

дуктаза

Піг-

мент

M. tuberсulosis

M. bovis

M. africanum

M. kansasii

M. avium

M. smegmatis

12-25

24-40

31-42

10-20

10-12

3-5

Найважливіша ознака M. tuberсulosis – ніациновий тест – здатність синтезу-

вати значну кількість нікотинової кислоти (ніацину). Каталазна активність відносно

слабка і втрачається при 68 °С. Для швидкої диференціації збудників туберкульозу

людини рекомендують посів на середовище Левенштейна-Йенсена з 500 мкг/мл і

1000 мкг/мл саліцилового натрію. Мікобактерії туберкульозу за таких умов на

цьому середовищі не ростуть.

Питання про вірулентність мікобактерій вирішується на основі біологічних

проб і виявленні корд-фактора. Останній визначають методом мікрокультур Прайса,

а також на основі міцного зв’язування таких барвників, як нейтральний червоний

або нільський голубий. При нанесені на мазок розчину NaOH туберкульозні палич-

ки зберігають колір барвника, в той час як невірулентні мікобактерії змінюють

відповідне забарвлення.

Для надійної ідентифікації видів мікобактерій у сучасних умовах розроблені

прогресивні, швидкі й дуже точні методи визначення у таких досліджуваних ма-

теріалах, як харкотиння, плевральна рідина, ліквор, гній, сироватка крові, вміст

шлунка, тканини тощо. Ці об’єкти, знезаражені нагріванням, зберігаються необ-

межений час і в будь-який момент можуть бути досліджені. Серед них найбільшої

уваги заслуговує молекулярно-генетичний метод полімеразної ланцюгової реакції.

Він грунтується на виявленні в біологічному матеріалі ДНК мікобактерій. Навіть

якщо в матеріалі знаходиться всього 5-10 мікробних клітин, за допомогою оліго-

нуклеотидів-праймерів запускають синтез специфічних фрагментів ДНК у цик-

лотермостаті, які потім можна ідентифікувати методом гельелектрофорезу. Резуль-

тати досліджень отримують через 3-4 години.

Специфічні антигени в тих же матеріалах можна також швидко виявити і за

допомогою імуноферментного аналізу, якщо мати відповідні антитіла, адсорбо-

вані на твердій фазі у полістиролових планшетах.

Визначення стійкості мікобактерій до хіміопрепаратів. Лікарську

стійкість збудників туберкульозу визначають способом серійних розведень перед

277

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

Стійкі при рості на середовищах, що містять препарат, мгк/мл

Препарат

щільних рідких

Стрептоміцин

Тубазид

ПАСК

Циклосерин

Канаміцин

Етіонамід

Біоміцин

початком лікування, через 3 місяці і надалі при продовженні виділення туберку-

льозних паличок через кожні 6 місяців. Це роблять шляхом вирощування культур

на середовищах із різною концентрацією туберкулостатиків.

Є два способи визначення резистентності мікобактерій: прямий і непрямий.

При прямому способі безпосередньо сіють відповідно оброблений матеріал на

середовища з різними концентраціями антибіотиків чи інших хіміопрепаратів. Він

ефективніший, але ним можна користуватися лише тоді, коли в матеріалі виявля-

ють не менше 5 мікобактерій в кожному полі зору. При непрямому способі на

середовище з протитуберкульозними препаратами сіють попередньо виділені куль-

тури мікобактерій. В обох випадках обов’язковий контроль – посів на таке саме

середовище без туберкулостатиків.

У сучасних умовах найбільш поширені такі методи визначення лікарської

стійкості мікобактерій:

1) культивування на щільному середовищі Левенштейна-Йенсена;

2) мікрокультивування на скельцях за Прайсом;

3) глибинні посіви в напівсинтетичні середовища.

У пробірки, які містять різну концентрацію препаратів, і в одну контрольну

(без туберкулостатика) засівають завись виділеної культури (500 млн мікробних

тіл в 1 мл). Культуру вважають чутливою, якщо в пробірці з препаратом виросло

менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Якщо виросло більше 20 колоній,

культуру вважають стійкою. Резистентність даного штаму виражають тією макси-

мальною концентрацією антибактерійного препарату, при якій ще відбувається

ріст, наближений до росту в контролі (табл. 59)

Таблиця 59

Шкала оцінки резистентності мікобактерій до лікарських засобів

Біологічний метод діагностики туберкульозу – зараження гвінейських сви-

нок – є найчутливішим. Інфікуюча доза збудника для цих тварин складає всього

декілька бактерійних клітин. Досліджуваний матеріал обробляють 2 % розчином

сірчаної кислоти протягом 20 хв, включаючи центрифугування. Потім осад тричі

відмивають 0,85 % розчином хлориду натрію і емульгують його в 1-2 мл ізотоніч-

ного розчину. Емульгований осад вводять підшкірно в пахвинній ділянці двом

гвінейським свинкам масою 250-300 г з негативною пробою Манту. При малій

кількості матеріалу його вводять у черевну порожнину або паранхіму яєчка. Та-

кий спосіб зараження підвищує чутливість біопроби, особливо в тих випадках,

278

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

коли в матеріалі містяться маловірулентні палички туберкульозу, стійкі до ізоніа-

зиду та інших хіміопрепаратів.

Через 2-3 тижні заражених тварин зважують, визначають розміри збільше-

них лімфатичних вузлів і ставлять пробу Манту, яку повторюють через 6 тижнів.

Місцеві патологічні зміни, зменшення маси тіла дають підставу для розтину

гвінейських свинок і дослідження їх внутрішніх органів. При негативних резуль-

татах тварин умертвляють через 3-4 міс, гістологічно досліджують паренхіматозні

органи і роблять посіви на елективні середовища.

Гвінейських свинок використовують і для виявлення L-форм мікобактерій

туберкульозу. В таких випадках потрібно зробити декілька послідовних заражень,

оскільки L-форми мають меншу вірулентність і викликають у тварин доброякіс-

ний перебіг туберкульозу, який при реверсії L-форм може перейти в генералізова-

ний процес.

Останнім часом все ширше використовують біопробу на білих мишах, зара-

жаючи їх інтрацеребрально. Постановка біологічних проб на лабораторних тва-

ринах – це своєрідний “золотий стандарт” при діагностиці туберкульозу.

Серологічна діагностика. Для виявлення протитуберкульозних антитіл спо-

чатку були запропоновані реакції аглютинації, преципітації та зв’язування комп-

лементу. Тепер їх використовують рідко. Натомість стали широко практикувати

реакцію непрямої гемаглютинації. Як антиген у ній використовують сенсибілізо-

вані еритроцити барана або людини О-групи. Їх навантажують екстрактом із ту-

беркульозних бактерій або очищеним туберкуліном. До 1 мл осаду еритроцитів

додають 20 мл екстракту мікобактерій, витримують при 37 °С протягом 2-ох год і

відмивають центрифугуванням для видалення надлишку антигену. Перед поста-

новкою РНГА сироватку хворого виснажують еритроцитарною масою для усу-

нення неспецифічного реагування. Потім сироватку розводять від 1:2 до 1:272.

Діагностичним титром вважають розведення 1:8. При туберкульозі РНГА буває

позитивною у 70-90 % випадків.

Хороші результати дає також імуноферментний аналіз, імуноблотинг і реакція

агрегат-гемаглютинації для визначення циркулюючих імунних комплексів. Ще точ-

нішим є радіоімунний метод, але через високу вартість діагностикумів і відсутність

радіометричної апаратури він рідко використовується в лікувальних закладах.

Для вдосконалення серологічної діагностики туберкульозу важливо налаго-

дити випуск моноклональних антитіл до різних антигенів мікобактерій. З їх допо-

могою можна було б виявляти специфічні епітопи бактерій, а також відповідні їм

антитіла. Виявлення таких антитіл буде мати важливе діагностичне значення.

Алергічний метод. Туберкулінова внутрішньошкірна проба Манту є специ-

фічним діагностичним тестом. Його використовують для визначення інфікованості

населення туберкульозом, масового обстеження на туберкульоз дітей і підлітків,

відбору осіб, яким потрібно проводити ревакцинацію, перевіряти її ефективність,

а також із метою діагностики туберкульозу та визначення активності процесу. Для

постановки проби використовують туберкулін. У 1890 р. Роберт Кох запропону-

вав перший препарат, так званий старий туберкулін Коха (Alttuberkulin Koch або

279

Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань

АТК). Його виготовляють із суміші культур мікобактерій людського й бичачого

типів, вирощених у гліцериновому бульйоні протягом 5-6 тижнів. Культуру стери-

лізують текучою парою 30 хв, випарюють при 70 °С до 1/10

первинного об’єму,

фільтрують через бактерійний фільтр і розливають в ампули. Туберкулін Коха

містить ряд баластних речовин і важко піддається стандартизації. Починаючи з

1934 р., для постановки алергічних проб Зейберт запропонував високоочищений

препарат туберкуліну, який назвали РРD-S (Purified protein derivative – Seibert).

Через 5 років М.А. Ліннікова виготовила очищений туберкулін під назвою ППД-Л.

Його дозують у туберкулінових одиницях (ТО). 1 ТО вміщує 0,00006 мг сухого

препарату. Випускають ППД-Л у двох формах: сухий очищений туберкулін по

50000 ТО в ампулі і ППД-Л у стандартному розведенні в ампулах по 3 мл. У 0,1 мл

розчину міститься одна доза (2 ТО).

Препарат вводять внутрішньошкірно однограмовим туберкуліновим шпри-

цом в об’ємі 0,1 мл у середній третині передпліччя. Перед ін’єкцією шкіру проти-

рають 70 % етиловим спиртом. Тонку голку зрізом вверх вводять у поверхневий

шар шкіри під кутом 15° до її поверхні.

Результати алергічної проби оцінюють через 72 год за такою схемою: нега-

тивна проба – повна відсутність папули; сумнівна – папула розміром 2-4 мм або

лише гіперемія будь-якого розміру; позитивна – папула діаметром 5 мм і більше;

гіперергічна – у дітей і підлітків папула діаметром 17 мм і більше, у дорослих –

21 мм і більше.

Лепра (проказа)

Лепра – первинно-хронічна генералізована інфекційна хвороба людини, яка

характеризується специфічними ураженнями шкіри, слизових оболонок, перифе-

ричних нервів і внутрішніх органів. Збудник захворювання – Mycobacterium leprae.

Окрім того, у щурів лепру викликає M. lepraemurium, морфологічно і тинкторі-

ально дуже подібна до палички прокази людини.

Розрізняють дві основні клінічні форми хвороби: туберкулоїдну і лепрома-

тозну. Остання має більш тяжкий прогресуючий перебіг. Прокажений виділяє збуд-

ника при кашлі, чханні і розмові, оскільки він у великій кількості знаходиться у

слизовій оболонці носоглотки. Зараження людей відбувається частіше повітряно-

краплинним шляхом при тісному контакті з хворими на проказу.

При лабораторній діагностиці лепри використовують переважно бактеріо-

скопічний метод дослідження, значно рідше біопробу на мишах і броненосцях-

армадилах та алергічну пробу з лепроміном.

Матеріалом для дослідження служать зскрібки слизової оболонки носа, ска-

рифікати з уражених ділянок шкіри, особливо з надбрівних дуг, мочок вушних

раковин, підборіддя, а також біоптати лепром і ліфматичних вузлів.

Зіскоб слизової оболонки з обох боків носової перегородки проводять метале-

вою ложечкою до появи краплі крові. Для взяття скарифікату шкіру в місці уражен-

ня затискають двома пальцями в складку,здовж якої скальпелем роблять невеликий

280

Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія

розріз глибиною 1-2 мм. Зскріб зі стінок надрізу переносять на предметне скло.

Виготовлені мазки забарвлюють за Цілем-Нільсеном або за методом Семеновича-

Марциновського. При проведенні гістологічних досліджень біоптатів частину зрізів

також фарбують одним із вказаних методів для виявлення мікобактерій.

У мазках лепрозні бактерії мають вигляд рубіново-червоних прямих або ледь

зігнутих паличок з округленими кінцями. При мікроскопії гістологічних зрізів

видно їх скупчення всередині клітин, де палички розташовуються паралельно,

нагадуючи пачки сигар. Це дає змогу диференціювати їх від мікобактерій тубер-

кульозу, які за своїми морфологічними і тинкторіальними властивостями подібні

до збудника лепри (див. вкл., рис. 22).

При посівах лепрозних матеріалів на елективні для мікобактерій середовища

ріст відсутній. Гвінейські свинки не чутливі до M. lepraе.

Біологічну пробу ставлять на мишах (особливо чутлива японська танцююча

миша). Гомогенат досліджуваного матеріалу вводять у подушечку задньої лапки

тварин, імунологічну реактивність яких понижують введенням Т-імунодепресантів.

У позитивних випадках на місці інокуляції матеріалу через декілька місяців вини-

кає інфільтрат, що містить гранулеми із розташованими всередині клітин міко-

бактеріями. При зараженні броненосців (армадил) у них розвиваються типові

множинні вузли (лепроми) в тканинах і органах, де мікроскопічно виявляють ба-

гато лепрозних бактерій.

Алергічну пробу з лепроміном використовують, в основному, для диферен-

ціації лепроматозної від туберкулоїдної форм прокази. Алерген готують із про-

стерилізованих в автоклаві гомогенатів уражених тканин, що містять величезну

кількість мікобактерій. Лепромін вводять внутрішньошкірно в середній третині

передпліччя в об’ємі 0,1 мл.

Через 48 год у позитивних випадках розвивається пляма гіперемії або папула

(реакція Фернандеса). Значно пізніше (1-2 міс.) може утворитися горбик, часто з

некрозом (реакція Міцуди). У хворих на лепроматозну форму алергічна проба буде

негативна, а у хворих на туберкулоїдну форму та у здорових людей – позитивна.

Отже лепромінова проба діагностичного значення не має, її використовують лише

для визначення клінічної форми хвороби і прогнозу.

Мікобактеріози

У навколишньому середовищі існує багато атипових потенційно патогенних

мікобактерій. Частина з них виділяється від людей і тварин при різноманітних

захворюваннях легень, шкіри, лімфатичних вузлів, інших тканин і органів. Вони

отримали загальну назву мікобактеріози. Роль умовно-патогенних мікобактерій в

інфекційній патології людини зростає з кожним роком. У цю групу захворювань

не входять туберкульоз і проказа, хоч деякі з них мають подібний перебіг. Існуючі

методи лікування туберкульозу і мікобактеріозів різні, у зв’язку з чим мікробіоло-

гічна ідентифікація збудників набуває особливого значення.