Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

121

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

гічний попередньому. Для цього готують серію розведень антибіотика в агарі, до-

даючи один об’єм, який містить певну кількість препарату до 9 об’ємів агару. Для

цього зручно розлити агар у флакони або широкі пробірки по 13,5 мл. Перед по-

становкою агар розплавляють на водяній бані і після охолодження до 60-65 °С у

кожну пробірку додають 1,5 мл відповідного розведення антибіотика (в бульйо-

ні), ретельно перемішують і виливають у чашку Петрі. У контрольну пробірку з

агаром замість розчину антибіотика вносять 1,5 мл дистильованої води. Чашку

поділяють на сектори, на кожний з яких засівають досліджуваний штам. Посіви

роблять бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою. Для посіву зручно

використати спеціальний штамп-реплікатор, який дозволяє нанести одночасно на

поверхню агару 25-50 досліджуваних культур. Результати враховують після 18-24

год інкубації в термостаті при оптимальній температурі. За МПК антибіотика для

даного штаму приймають ту, при якій відсутні ознаки росту колоній на поверхні

агару (або замість бляшки є ріст поодиноких колоній).

З двох способів визначення антибіотикочутливості мікробів до антибіотиків

(розведень у густому та рідкому середовищах) більш точним є метод серійних

розведень у рідкому середовищі. Результати, які одержують за допомогою розве-

день в агарі, менш постійні. Метод не слід застосовувати при оцінці чутливості

тих мікробів, які дають тонкий, розріджений ріст на поверхні чашки (стрептоко-

ки, пневмококи) або, навпаки, мають тенденцію до повзучого росту (протей).

Недоліком методів серійних розведень є їх висока трудоємність, що обмежує

використання в звичайних бактеріологічних лабораторіях. З метою спрощення було

запропоновано модифікацію методу із заміною ряду з 10 пробірок, що містять

різні кількості препарату, трьома концентраціями антибіотика. Перша з них відпо-

відає максимальній, що знаходиться у крові при введенні терапевтичних доз, дру-

га – рівню, що спостерігається через Т

1/2

(час зниження концентрації антибіотика

на 50 %). Третя є мінімальною, тобто тою, яка дорівнює МПК для високочутливих

штамів. У відповідності до використаних концентрацій антибіотиків досліджу-

вані штами можна віднести за рівнем чутливості до трьох основних груп: резис-

тентні (МПК для яких перевищує значення максимальної концентрації антибіоти-

ка у крові), помірно чутливі (значення МПК наближаються до максимальної або

середньої концентрації) і високочутливі (чутливість яких до антибіотика знахо-

диться на рівні мінімальної концентрації, що використовується у досліді). Такими

концентраціями при визначенні чутливості до бензилпеніциліну є відповідно 0,05-

0,2, 0,5 і 2,0 ОД/мл, до макролідів – 0,1, 0,5-1,0 і 4,0 мкг/мл, до аміноглікозидів –

0,5-1,0, 6,0-8,0 і 15,0-20,0 мкг/мл.

Прискорені методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіо-

тиків. Використовуючи звичайні методи, відповідь може бути отримана через 18-

20 год від початку дослідження, не враховуючи етапів виділення чистої культури.

Це призводить до того, що у більшості випадків особливо при затяжному та тяж-

кому перебігу хвороби, лікування антибіотиками починають задовго до одержан-

ня даних лабораторного обстеження. Залежно від принципів, на яких вони базу-

ються, прискорені методи передбачають:

122

Частина І. Загальна мікробіологія

• визначення змін ферментативної активності мікроорганізмів під впливом

антибіотиків;

• визначення кольору редокс-індикаторів при зміні окисно-відновного потен-

ціалу під час росту бактерій у живильному середовищі;

• цитологічну оцінку змін морфології бактеріальних клітин під впливом ан-

тибіотиків.

До першої групи належить метод Роджерса, орієнтований на здатність анти-

біотиків пригнічувати ферментативну активність чутливих мікроорганізмів, що

супроводжується зміною кольору відповідного індикатора. Суть його полягає у

диференційованій зміні червоного кольору фенолового червоного на жовтий або

фіолетовий залежно від чутливості досліджуваного штаму. У випадку чутливості

до дії антибіотика не відбувається розкладання глюкози при культивуванні у сере-

довищі, яке містить її та певні концентрації препарату. При цьому середовище

забарвлюється у фіолетовий колір внаслідок зсуву рН у лужну сторону. Зміна чер-

воного кольору на жовтий свідчить про розщеплення глюкози з утворенням кис-

лоти внаслідок росту штаму, резистентного до дії антибіотика. Якщо до середови-

ща додати 0,25 % дріжджового екстракту, результати можуть бути врахованими

вже через 2-2,5 год від початку дослідження.

Наступна група методів реєструє зміни окисно-відновного потенціалу сере-

довища в процесі росту мікроорганізмів, про що свідчить зміна кольору резазури-

ну, 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, 2,6-дихлорфеноліндофенолу та інших, які

додаються до середовища. Цей метод технічно простий, а результати одержують

через 2-6 год. Принцип його зводиться до того, що розтоплений та охолоджений

до 50 °С агар засівають досліджуваною культурою бактерій із розрахунку 200 млн.

мікробних тіл, а на поверхню накладають диски з антибіотиками. Чашки інкубу-

ють при оптимальній температурі протягом 3-5 год, потім обробляють індикато-

ром і повторно інкубують при 37 °С протягом 20-30 хв. Результати враховують за

зміною кольору навколо дисків з антибіотиками. Якщо використовують 1 % роз-

чин 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, ділянки агару з бактеріальним ростом

внаслідок утворення формазану набувають червоного кольору, а зони пригнічен-

ня росту навколо дисків залишаються безбарвними.

Судити про ступінь чутливості мікробів до антибіотиків можна з такою ж

точністю, як і за допомогою стандартного методу дисків, проте час дослідження

зменшується до 3-5 год.

Утворення інволюційних форм бактерій під впливом антибіотиків досліджу-

ють під фазово-контрастним чи антоптральним мікроскопом у спеціальних мікро-

капсулах. Вони утворюються внаслідок дії бактеріостатичних концентрацій пре-

парату. Під впливом суббактеріостатичних концентрацій, а також при резистент-

ності досліджуваного штаму на поверхні агару виростають нормальні мікроколонії.

Метод може бути застосований для визначення чутливості штамів кишкової

палички, стафілококів, холерних вібріонів. Отримані дані у більшості випадків

збігаються з тими, які дають класичні методи.

123

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

За останні роки розроблено численні модифікації методу серійних розведень

у живильних бульйонах. Зокрема, експрес-методи з титруванням антибіотика в

об’ємі 0,25 мл.

Випускаються комерційні набори тривалого зберігання, які складаються з

планшетів з ліофільно висушеними розведеннями антибіотика, куди вноситься по

0,1 мл суспензії чистої культури мікроорганізмів. Результати визначення антибіо-

тикочутливості можна оцінювати візуально (при наявності у середовищі індика-

тора) або за допомогою спектрофотометрів, коли реєструється зміна оптичної гу-

стини середовища.

Визначати чутливість бактерій до антибіотиків можна й за допомогою автома-

тизованих мікробіологічних систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”, Quantum 2,

Sceptor та ін.). При їх використанні результати отримують вже через 3-10 год. Одна

з їх переваг полягає в тому, що вони дозволяють отримувати результати одночасно

до 18-20 антибіотиків. Ці методи широко використовують у мікробіологічних ла-

бораторіях, вони добре корелюють з іншими методиками і за їх допомогою можна

не тільки вибирати раціональну схему антибіотикотерапії, але й проводити епіде-

міологічний контроль резистентності.

Однак при користуванні такими автоматизованими системами частота вияв-

лення резистентних штамів може бути знижена внаслідок повільного росту стійких

варіантів. У більшості подібних систем результати враховують шляхом порівнян-

ня росту (або загибелі) бактеріальних клітин у присутності антибіотиків з контро-

лем, де є тільки мікроби. За цих умов досить важко диференціювати клітини, які

гинуть, від тих, що повільно розмножуються.

До інших факторів, які впливають на результати, належить дія субінгібітор-

них концентрацій препаратів на ультраструктуру бактеріальних клітин. Вони при-

зводять до зміни форми, набухання клітин, що може супроводжуватись зміною

оптичної густини суспензії та спотворенням результатів. В свою чергу, це дає не-

правильну інформацію про чутливість збудників.

Таким чином, застосування будь-якого методу дозволяє визначити антибіо-

тикограму збудника – спектр його чутливості та антибіотикостійкості.

Усі методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків мають свої перева-

ги і свої недоліки. Тому постійний контроль за об’єктивністю результатів і дотри-

манням правил проведення досліджень сприяють одержанню достовірних даних.

У більшості випадків результати визначення антибіотикостійкості in vitro

збігаються з клінічними наслідками антибіотикотерапії. Випадки розбіжності по-

яснюються рядом причин, серед яких найчастіше зустрічається помилкове трак-

тування одержаних лабораторних даних.

Причиною таких ситуацій може бути використання при посіві не чистої куль-

тури бактерій, а патологічного матеріалу. Тому визначається не чутливість інфек-

ційного агента, а мікробної асоціації, в тому числі й сапрофітної флори. Помилки

зустрічаються при дослідженні вмісту дванадцятипалої кишки, фекалій, харко-

тиння, виділень з ран, сечі тощо.

124

Частина І. Загальна мікробіологія

Плазміди роблять бактерії нечутливими до переважної більшості антибіо-

тиків, які використовуються у клініках, оскільки кодують синтез ферментів, що

руйнують препарати. Одним з найдослідженіших ферментів є бета-лактамаза, яка

руйнує антибіотики, що належать до групи бета-лактамів. Розроблено декілька

методичних прийомів, що дозволяють швидко визначити її активність. Один з них

полягає в тому, що на фільтрувальний папір розміром 2×2 см, що знаходиться в

чашці Петрі, капають одну краплю 2 % водного розчину крохмалю. Потім на цей

папір наносять петлею агарову культуру мікробів і розтирають її, формуючи бляшку

діаметром до 5 мм. На її поверхню наносять робочий йодний розчин пеніциліну.

Облік результатів проводять через 10 хв інкубації системи при кімнатній

температурі. При наявності бета-лактамази на темно-синьому фоні спостерігаєть-

ся яскраво виражена чітка зона просвітління навколо бляшки, що містить агарову

культуру мікробів. При негативному результаті зона просвітління відсутня, а краї

бляшки нечіткі.

Визначення концентрації антибіотиків у біологічних рідинах. При тяж-

ких інфекційних процесах, наприклад, сепсисі інколи доводиться визначати кон-

центрацію антибіотиків у біологічних рідинах, зокрема, сироватці крові, сечі. Для

цього використовують метод серійних розведень (табл. 16) на рідкому середовищі

з глюкозою та індикатором Андреде. У двох паралельних рядах готують серійні

розведення сироватки і стандарту антибіотика. Потім до кожної пробірки, вклю-

чаючи контрольні, додають стандартну суспензію тест-мікробів. Пробірки інку-

бують у термостаті при температурі 37 °С протягом 18 год. У тих пробірках, де

концентрація антибіотика пригнічує мікроби, середовище залишається безбарв-

ним і прозорим. Якщо мікроорганізми проростають, про це свідчить помутніння

середовища і поява рожевого забарвлення.

Можна використати також фенол-сироваткове середовище з індикатором фено-

ловим червоним. У цьому випадку при відсутності росту мікроорганізмів середо-

вище залишається червоним, а при наявності ознак росту стає мутним і набуває

жовтого кольору.

Виходячи із даних таблиці, розчин стандарту пеніциліну затримує ріст тест-мікро-

бів у концентрації 0,025 ОД/мл, а досліджувана сироватка – в розведенні 1:8. Отже,

вміст пеніциліну в сироватці крові буде дорівнювати 0,2 ОД/мл (0,025 ОД/мл×8).

Таблиця 16

Визначення концентрації пеніциліну в сироватці крові

Пробірки 1 2 3 4 5 6

Розведення сироватки 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64

Ріст тест-мікробів - - - + + +

Концентрація стандарту

пеніциліну в середовищі,

ОД/мл

0,2 0,1 0,05 0,025 0,0125 0,0063

Ріст тест-мікробів - - - - + +

Примітка: “+” – ріст тест-мікробів, “-” – відсутність росту

Розділ 9

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ

ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ

У захисті організму від чужорідних агентів вирішальну роль відіграють іму-

нологічні механізми, які здійснюються антитілами (імуноглобулінами) та імуно-

компетентними клітинами (лімфоцитами).

Основою імунологічних механізмів є те, що антитіла і лімфоцити, які утво-

рились при попаданні в організм антигену, реагують тільки з ним, а не з іншими

антигенами. Головною функцією антитіл є зв’язування антигену і його подальше

видалення з організму.

Проте такі реакції між антигенами і антитілами можуть відбуватись і поза

організмом (in vitro) у присутності електроліту. Виходячи з їх специфічності, ре-

акції можливі лише тоді, коли антитіло та антиген комплементарні один одному.

Маючи специфічні антитіла проти певного антигена, можна розпізнати і визначи-

ти його серед інших. І, навпаки, можна виявити в сироватці крові антитіла проти

конкретного антигена. На цьому принципі базуються всі імунологічні діагностичні

реакції, які назвали серологічними, тому що антитіла знаходяться в сироватці крові

людей і тварин (serum – сироватка).

Реакція антиген-антитіло in vitro супроводжується виникненням декількох

феноменів – аглютинації, преципітації, лізису. Зовнішній прояв реакції залежить

від фізико-хімічних властивостей антигена, класу антитіл і умов середовища.

Аглютинація і преципітація характеризуються утворенням видимих агрегатів

внаслідок об’єднання багатьох комплексів антиген-антитіло. Лізис зумовлений

зв’язуванням комплементу комплексом антиген-антитіло з наступним руйнуван-

ням клітини.

Антитіла, що беруть участь у реакції, відповідно до кожного феномена нази-

вають аглютинінами, преципітинами, лізинами.

Таким чином, всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою:

1) для виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-

діагностикумів – для серологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для виз-

начення невідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартни-

ми сироватками-антитілами – для серологічної ідентифікації збудників. При цьо-

му невідомий компонент визначають за відомим. Наприклад, якщо сироватка

Частина ІІ

ІМУНОЛОГІЯ

126

Частина ІІ. Імунологія

хворого реагує з конкретним мікробним антигеном, це означає, що в сироватці є

антитіла проти даного мікроорганізму. А вид збудника, виділеного із патологічно-

го матеріалу, визначають за допомогою відомої імунної сироватки (антитіла).

Відповідно до цього, в серологічних реакціях завжди використовують один

компонент стандартний, інший, який виявляють, одержують від хворого. Так, для

серологічної діагностики беруть стандартні антигени – діагностикуми: суспензії

інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному

розчині. Для серологічної ідентифікації застосовують стандартні імунні сироват-

ки. Їх одержують шляхом гіперімунізації тварин відповідними бактерійними чи

вірусними антигенами, в результаті якої в крові проти них з’являється значна

кількість антитіл. Одержавши сироватку крові імунізованої тварини і очистивши

від баластних речовин, її використовують як імунну сироватку. При одержанні

такої сироватки визначають її титр – найбільше розведення, в якому ще прояв-

ляється реакція з відповідним антигеном. Набори із різноманітних діагностикумів

та імунних діагностичних сироваток є в кожній бактеріологічній лабораторії.

Усі імунологічні методи, що вживаються для діагностики інфекційних захво-

рювань можна поділити на три групи:

1. Тести, в яких відбувається безпосередня взаємодія антигена з антитілом.

До цієї групи належать: імунофлуоресценція, радіоімунні та імуноензимні тести.

2. Тести, в яких відбуваються різні фізико-хімічні реакції або беруть участь

додаткові елементи (носії, комплемент). До них належать: імунодифузія, імуно-

електрофорез, пряма аглютинація (бактерійна), непряма аглютинація з викорис-

танням еритроцитів (пасивна гемаглютинація), латексу (латексна аглютинація) або

інших часточок, таких як бентоніт, холестерол, деревне вугілля, коаглютинація

(використання білка А Staphylococcus aureus) і реакція зв’язування комплементу.

3. Тести, що базуються на використанні певних біологічних ефектів, наприк-

лад, опсонізація, фагоцитоз, хемотаксис. До них належать: опсонофагоцитарна

проба, хемотаксис, імуноадгезія, клітинна дегрануляція.

Реакція аглютинації (РА)

Аглютинація – це серологічна реакція між антитілами (аглютинінами) і анти-

генами (аглютиногенами), розміщеними на поверхні бактеріальної клітини. Ця

реакція призводить до утворення специфічного комплексу антиген – антитіло

(аглютинат).

Клітини з приєднаними до них аглютинінами з’єднуються в агрегати, внаслі-

док чого рівномірна суспензія клітин, спочатку мутна, склеюється в пластівці, які

зависають у прозорій рідині або осідають на дно. В аглютинації беруть участь

виключно поверхневі антигени, які доступні антитілам. Антигени, розміщені у

внутрішніх структурах клітини, не беруть участі в цій реакції. Механізм аглюти-

нації полягає в тому, що під впливом іонів електроліту зменшується негативний

поверхневий заряд бактерійних клітин, і вони можуть зблизитись на таку відстань,

при якій виникає склеювання бактерій (рис. 42).

127

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Реакцію проводять на склі, пластмасо-

вих пластинках, у пробірках, лунках полі-

стиролових планшет.

Аглютинацію на склі або пластинках

найчастіше використовують для ідентифі-

кації бактерій з допомогою відомих сиро-

ваток; аглютинація в пробірках і планше-

тах – з метою виявлення титру аглютинінів

у сироватці хворого з допомогою відомих

діагностикумів.

Найбільше розведення сироватки, при

якому ще спостерігається аглютинація бак-

терій, приймається за її титр, який характе-

ризує рівень специфічних аглютинінів.

Макроскопічний і мікроскопічний вигляд аглютинації бактерій залежить від

виду поверхневих антигенів, які беруть участь у реакції. Аглютиніни, які реагу-

ють з О-соматичним антигеном, дають дрібнозернисту аглютинацію. Соматична

аглютинація в пробірках завершується через 24 години, при цьому виникають ком-

пактні зерна, крупинки, які важко розбити при струшуванні. При мікроскопії вид-

но, що бактерії склеюються полюсами, утворюючи сітку.

В аглютинації з поверхневими Vi-антигенами спостерігається склеювання

бактерій між собою всією поверхнею, що дає рівномірний осад. У певній мірі

макроскопічно Vi-аглютинація нагадує соматичну.

Сироватки, які містять антитіла проти джгутиків бактерій, аглютинують знач-

но швидше. Вже через 30-40 хв окремі конгломерати бактерій у вигляді пластівців

вільно осідають на дно пробірки. Аглютиніни анти-Н безпосередньо взаємодіють

з джгутиками, знерухомлюючи бактерії. Мікроскопічно можна спостерігати скле-

ювання бактерійних клітин з допомогою джгутиків. Це крупнопластівцева, або

Н-аглютинація (рис. 43).

Постановка РА. Існує дві різновидності постановки реакції: орієнтовна аглю-

тинація на склі й розгорнута аглютинація в пробірках.

Реакція аглютинації на склі. На предметне скло наносять роздільно 2 краплі

специфічної сироватки і краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. В краплю

Рис. 42. Реакція аглютинації.

Рис. 43. Аглютинація бактерій: а – О-аглютинація (соматична), дрібнозерниста;

б – Vi-аглютинація; в – Н-аглютинація (джгутикова), крупнопластівцева.

абв

128

Частина ІІ. Імунологія

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

сиро-

ватки

анти-

гена

0,85 % розчин хлориду

натрію

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - 1,0

ОК-колі сироватка

в розведенні 1:50

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

↓

1,0 -

Розведення

сироватки

1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:100 -

Cуспензія E.coli

(краплі)

2 2 2 2 2 2 - 2

Термостат 37 °С – 2 год.

Результат

ізотонічного розчину й одну з крапель сироватки бактеріологічною петлею вно-

сять досліджувану культуру й ретельно її емульгують. Після внесення культури в

одну із крапель необхідно простерилізувати петлю, знову набрати культуру і вне-

сти її у другу краплю. Крапля сироватки, куди не вносили культури, є контролем

сироватки.

Реакція проходить досить швидко при кімнатній температурі. Якщо конт-

рольна крапля сироватки залишається прозорою, в краплі ізотонічного розчину –

рівномірне помутніння, а в краплі, де культура змішана з сироваткою, з’являються

зернистість або пластівці, реакція вважається позитивною.

Проте орієнтовна реакція аглютинації дозволяє зробити лише попередній

висновок про виділену культуру, тому що багато бактерій мають спільні антигени.

Щоб остаточно підтвердити або відкинути попередній висновок ставлять

розгорнуту реакцію аглютинації (табл. 17). Діагностичні аглютинуючі сироватки,

які одержані шляхом гіперімунізації тварин, мають високий титр (1:20000-1:40000

і вище).

Таблиця 17

Постановка реакції аглютинації для ідентифікації E. coli

Спочатку готують робоче розведення сироватки (1:50 або 1:100), із якого на-

далі одержують двократні розведення від 1:100 до титру, вказаного на ампулі з

сироваткою. Для цього в ряд пробірок розливають по 1 мл ізотонічного розчину,

потім у першу пробірку вносять такий же об’єм сироватки робочого розведення і

після перемішування 1 мл переносять у другу, звідти в третю і т.д., а в передостан-

ню пробірку додають 1 мл сироватки робочого розведення. В останню пробірку

сироватку не вносять. Потім у всі пробірки додають по дві краплі досліджуваної

культури.

Контрольні пробірки – дві останні. Передостання – контроль сироватки, остан-

ня – контроль антигену. Після струшування штатив із пробірками поміщають у

термостат при 37 °С на дві години і згодом залишають при кімнатній температурі

до наступного дня. Після чого проводять облік результатів. Якщо реакція вияви-

лась позитивною до титру або до половини титру, вона вважається достовірною.

129

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Розгорнуту реакцію аглютинації ставлять і при серологічній діагностиці захво-

рювання. Тільки в цьому випадку роблять ряд послідовних розведень сироватки

хворого (1:100-1:1600) і до кожного розведення додають по дві – три краплі діаг-

ностикуму.

При деяких інфекційних захворюваннях реакції аглютинації, що вживають-

ся з діагностичною метою, мають свої назви: при черевному тифі – реакція Віда-

ля, висипному тифі – реакція Вейгля, при бруцельозі – реакція Райта (табл. 18).

Таблиця 18

Схема постановки реакції аглютинації Райта

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6

сиро-

ватки

анти-

гена

Розчин хлориду натрію 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - 1,0

Сироватка хворого

в розведенні 1:50

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

→

1,0

↓

1,0 -

Розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:100 -

Бруцельозний

діагностикум (краплі)

3 3 3 3 3 3 3 3

Термостат 37

С 18-20 год

Результат

Реакція непрямої аглютинації (РНГА). За своєю чутливістю значно пере-

вищує пряму реакцію аглютинації і дозволяє виявити мінімальну кількість ан-

титіл і антигенів. Така висока чутливість досягається завдяки адсорбції антигенів

або антитіл на спеціальних інертних частинках (латекс, бентоніт) або клітинах

(еритроцити). Якщо антигени адсорбовані на еритроцитах, така реакція називається

реакцією непрямої (пасивної) гемаглютинації (рис. 44).

Навантажені антигеном еритроцити склеюються в присутності специфічних

антитіл і випадають у вигляді пухкого осаду з нерівним фестончастим краєм (пе-

ревернутої “парасольки”) на дні пробірок або лунок.

Антигени для РНГА називаються еритроцитарними діагностикумами. Це стан-

дартні препарати, які складаються з антигенів різних бактерій і вірусів, адсорбо-

ваних на поверхні еритроцитів. За допомогою еритроцитарних діагностикумів

можна виявляти в сироватці хворих антитіла до будь-якого збудника.

Рис. 44. Схема реакції непрямої гемаглютинації.

130

Частина ІІ. Імунологія

РНГА можна використовувати й для серологічної ідентифікації збудника. У

цьому випадку як індикатор використовують еритроцити, навантажені відповід-

ними антитілами. При додаванні до них культури збудника виникає феномен гема-

глютинації. На відміну від попередньої реакції, її називають реакцією оберненої

(зворотної) непрямої гемаглютинації (РОНГА).

Недоліком непрямої (пасивної) гемаглютинації є те, що антитіла, які знахо-

дяться на поверхні еритроцитів, можуть не викликати їх склеювання. Частково це

можна пояснити тим, що поверхня еритроцитів має негативний електричний за-

ряд, який заставляє їх триматися на відстані близько 25 нм один від одного. Вони

можуть аглютинуватись у присутності специфічного антигену лише тоді, коли не-

гативний заряд зменшиться настільки, щоб еритроцити могли зблизитись. Цього

можна досягти, додаючи до середовища альбумін (5-30 %), декстран або полівініло-

вий піримідон. Ці сполуки мають позитивний заряд, який нейтралізує негативні

заряди еритроцитів. Зняти негативний заряд можна також, діючи на еритроцити

такими ферментами як трипсин, папаїн та ін. Завдяки цьому, еритроцити зближу-

ються між собою і можуть утворювати зв’язки між антигенами та антитілами.

Реакція непрямої гемаглютинації широко використовується у діагностиці ві-

русних, бактеріальних, грибкових і паразитарних інфекцій. Для навантаження ерит-

роцитів найчастіше використовують полісахаридні антигени бактерій або грибів,

які легко адсорбуються на поверхні свіжих еритроцитів барана і людини групи О

Rh(-). Поверхню еритроцитів можна змодифікувати, використовуючи хімічні спо-

луки (танін, двоазобензидин) і тоді на них можна адсорбувати і білкові антигени.

РНГА відноситься до найбільш чутливих реакцій у порівнянні з аглютина-

цією, преципітацією і зв’язуванням комплементу. З допомогою цієї реакції анти-

тіла в сироватці хворого при деяких захворюваннях виявляють вже з третьої доби

від моменту зараження.

Методика постановки РНГА. У ряд лунок полістиролової планшети нали-

вають по 0,5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, потім у першу лунку вно-

сять 0,5 мл сироватки хворого (1:50) і одержують розведення сироватки 1:100. З

першої лунки переносять 0,5 мл у другу, одержують розведення 1:200, з другої в

третю і т.д., крім останньої. З передостанньої лунки 0,5 мл виливають, потім в усі

лунки додають по 0,25 мл відповідного еритроцитарного діагностикуму (табл. 19).

Планшети поміщають у термостат при 37 °С на 2-3 год.

Результат реакції оцінюють за виглядом осаду еритроцитів, починаючи з кон-

тролю, де вони повинні осісти на дно у вигляді круглого компактного осаду з

рівними краями. У лунках із сироваткою при позитивній реакції осад буде мати

нерівні краї і покриватиме майже всю лунку.

Інтенсивність РНГА оцінюють за чотириплюсовою системою: якщо майже

всі еритроцити аглютинувались і утворився осад, який нагадує перевернуту “па-

расольку”, – реакція позитивна (++++, +++); не всі еритроцити аглютинувались,

мереживоподібний осад меншого розміру (++); більшість еритроцитів не склеїлись

і утворюють у центрі дна лунки компактний диск з нерівними краями – реакція

слабопозитивна (+) (рис. 45).