Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

141

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

нення клітини. Без комплементу лізис клітини неможливий. Розрізняють декілька

реакцій лізису: бактеріолізу, гемолізу, цитолізу. Реакцію бактеріолізу з діагнос-

тичною метою практично не використовують. Частіше ставлять реакції гемолізу

й цитолізу.

Постановка реакції гемолізу. Компонентами є антиген (еритроцити бара-

на), антитіло (гемолітична сироватка), комплемент (свіжа сироватка гвінейської

свинки або стандартний сухий комплемент). Для одержання еритроцитів у барана

беруть кров із яремної вени у стерильний флакон із скляними кульками й енергій-

но струшують, щоб нитки фібрину намотались на кульках, і кров не згорнулась.

Потім ізотонічним розчином хлориду натрію відмивають еритроцити від плазми.

Для цього кров центрифугують 10 хв при 2000 об/хв. Плазму відсмоктують піпет-

кою, а до осаду еритроцитів знову додають ізотонічний розчин, ретельно пере-

мішують і центрифугують. Таке промивання еритроцитів роблять тричі. Рідину

обережно відсмоктують, а з осаду еритроцитів готують 3 % суспензію в ізотоніч-

ному розчині.

Гемолітичну сироватку (гемолізин) одержують шляхом імунізації кроликів

еритроцитами барана. Після циклу імунізації у них беруть кров, з якої готують

сироватку, де містяться антитіла проти еритроцитів. Для інактивації комплементу,

що знаходиться в ній, її прогрівають при 56 °С протягом 30 хв і визначають титр.

Для постановки реакції гемолітичну сироватку беруть у потрійному титрі.

Наприклад, якщо титр сироватки 1:1800, то її розводять до 1:600. Комплемент

беруть у розведенні 1:10 (табл. 23).

Таблиця 23

Схема постановки реакції гемолізу

Пробірки

Компоненти, мл

1 2 3

Гемолізин у потрійному титрі 0.5 0.5 -

3 % суспензія еритроцитів барана 0.5 0.5 0.5

Комплемент 1:10 0.5 - 0.5

0,85 % розчин хлориду натрію - 0.5 0.5

Термостат 37

С – 60 хв

Результат (гемоліз) + - -

Реакція вважається позитивною, якщо всі еритроцити лізувались. Рідина

червоного кольору й абсолютно прозора. Ніякого осаду на дні пробірки немає.

Реакція негативна, якщо еритроцити компактно осіли на дно, рідина над ними

безбарвна.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

Характерною відмінністю РЗК від реакції аглютинації й преципітації є участь

в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у ви-

гляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не завжди зумовлює

візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. Проте відомо, що

142

Частина ІІ. Імунологія

при утворенні комплексу антиген – антитіло до нього завжди приєднується комп-

лемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, комплемент не

зв’язується, залишається вільним у системі. При додаванні комплексу еритроцити

барана – гемолізини вільний комплемент, зв’язуючись з ним, викликає гемоліз

еритроцитів. Цей принцип і покладено в основу РЗК. При відповідності антигена

антитілу з ним зв’язується комплемент. Щоб переконатись в цьому, додають ерит-

роцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності гемолізу роблять висно-

вок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу – реакція негативна (рис. 54).

Для сероідентифікації використовують стандартні діагностичні сироватки

відомого титру. Для серологічної діагностики досліджувану сироватку прогріва-

ють при 56 °С протягом 30 хв, для інактивації власного комплементу, а потім готу-

ють ряд послідовних розведень для визначення титру антитіл. Антигенами мо-

жуть бути бактеріальні клітини, віруси, білкові або полісахаридні речовини, екст-

ракти органів і тканин.

Комплемент представлено свіжою або ліофілізованою сироваткою гвінейсь-

кої свинки, яку розводять 1:10. Гемолітичну сироватку використовують у потрійно-

му титрі, а з еритроцитів барана готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині

хлориду натрію.

Підготовка реагентів. Промисловість випускає стандартні гемолітичні си-

роватки з відомим титром, який вказаний на етикетці. Але при довготривалому

зберіганні з метою перевірки його гемолітичні сироватки перед основним дослі-

дом титрують (табл. 24). У ряді пробірок в об’ємі 0,5 мл готують послідовні роз-

ведення гемолізину до титру. У кожну пробірку вносять по 0,5 мл 3 % зависі ерит-

роцитів, по 0,5 мл комплементу у розведенні 1:10 і по 0,5 мл фізіологічного розчи-

ну. Пробірки ставлять у термостат при 37 °С на 1 годину. При відсутності гемолізу

в контролі оцінюють його ступінь у дослідних пробірках за трьохплюсовою систе-

мою: повний гемоліз (+++), частковий гемоліз (++ або +), відсутність гемолізу (–).

За титр гемолітичної сироватки приймають те найбільше її розведення, яке в

присутності комплементу викликає повний гемоліз еритроцитів. В РЗК беруть

робочу дозу гемолітичної сироватки у потрійному титрі. Якщо титр сироватки

складав 1:1800, то робочою дозою буде 1:600.

Рис. 54. Схема реакції зв’язування комплемента.

Дослідна система

АНТИГЕН

(Бактерія, клітина,

вірус тощо)

КОМПЛЕМЕНТ

АНТИТІЛО

(сироватка)

Комплемент зв’язався з комплексом

антиген-антитіло

Індикаторна гемолітична система

ЕРИТРОЦИТИ БАРАНА

(АНТИГЕН)

ГЕМОЛІТИЧНА СИРОВАТКА

(АНТИТІЛО)

Комплемента немає – зв’язався з дослідною

системою.

Без комплемента гемоліз еритроцитів

неможливий.

143

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Титрування комплементу проводять в день постановки РЗК для визначення

дози, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути такою, щоб повністю

зв’язалась комплексом антиген-антитіло. Якщо якась частина комплементу зали-

шиться незв’язаною, то при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, ос-

танні будуть лізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про негативний

результат РЗК. Ось чому так важливо визначати титр комплементу.

Перед початком титрування в ампулу з сухим комплементом додають 1 мл

ізотонічного розчину. Одержаний розчин додатково розводять 1:10 і використову-

ють як вихідний для визначення титру комплементу.

Для цього в ряд пробірок вносять зростаючі на 0,05 мл дози комплементу,

починаючи від 0,05 мл до 0,5 мл, і в кожну пробірку до кінцевого об’єму 1,5 мл

додають ізотонічний розчин хлориду натрію.

Попередньо готують гемолітичну систему, яка складається з рівних об’ємів

3% суспензії еритроцитів барана і гемолітичної сироватки в робочому титрі. Її

витримують при температурі 37 °С протягом 30 хв, що необхідно для зв’язування

еритроцитів із гемолізином (табл. 25).

Після приготування відповідних розведень комплементу в усі пробірки вно-

сять по 1,0 мл гемолітичної системи і до об’єму 2,0 – 0,5 мл ізотонічного розчину.

Суміш змішують і ставлять в термостат при 37 °С на 1 годину.

Результати реакції оцінюють за появою гемолізу. Титром комплементу буде

та його найменша кількість, при якій спостерігається повний гемоліз (+++). Робо-

ча доза комплементу завжди буде більшою від титру на 25 %, і практично вона

буде міститись у наступній пробірці. Наприклад, якщо в першій пробірці, де є

повний гемоліз, знаходилось 0,2 мл комплементу, за робочу дозу приймають 0,25,

ту кількість, що знаходиться в наступній пробірці.

Таблиця 24

Схема титрування гемолітичної сироватки

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5

компле-

менту

гемолі-

тичної

сиро-

ватки

еритро-

цитів

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,5

Гемолітична сироватка

в розведенні 1:150

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

↓

- 0,5 -

Розведення сироватки 1:300 1:600 1:1200 1:2400 1:4800 - 1:150 -

3 % суспензія

еритроцитів барана

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Комплемент у

робочому титрі (1:10)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - -

Термостат 37

С – 60 хв

Результат

144

Частина ІІ. Імунологія

Постановка основного досліду РЗК. Класичну методику постановки РЗК

запропонували Ж. Борде і О. Жангу для діагностики хронічної гонореї. Згідно з

цією методикою кожен компонент реакції беруть в кількості 0,5 мл, і загальний

об’єм її становить 2,5 мл.

При постановці РЗК компоненти вносять у певній послідовності. Спочатку в

пробірки, у яких міститься розведена сироватка хворого, додають рівні об’єми

антигена і комплементу в робочій дозі. Пробірки ретельно струшують і ставлять у

термостат при 37 °С на 1 год. За цей час з’єднується антиген з антитілом, і на

цьому комплексі фіксується комплемент. Одночасно в термостаті інкубують гемо-

літичну систему. Через годину в усі пробірки основного досліду додають по 1 мл

гемолітичної системи і знову ставлять у термостат. Через 30-45 хв проводять облік

реакції при умові повного гемолізу в контролях сироватки, антигена і комплемен-

ту (табл. 26).

Таблиця 26

Схема постановки основного досліду РЗК

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5

компле-

менту

сиро-

ватки

анти-

гена

Розчин хлориду

натрію

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Сироватка хворого

в розведенні 1:50

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

→

0,5

↓

0,5 0,5 -

Розведення сироватки 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:100 1:100 -

Специфічний антиген 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5

Комплемент у робочому

титрі

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5 0,5

Термостат 37 °С – 60 хв

Гемолітична система 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Термостат 37 °С – 60 хв

Результат

Таблиця 25

Схема титрування комплементу

Пробірки Контроль

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Комплемент у

розведенні 1:10

0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,5 -

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1,0 1,0 1,5

Термостат 37 °С – 30 хв

Гемолітична система 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Термостат 37

С – 60 хв

Результат

145

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

РЗК оцінюють за чотириплюсовою системою: різко позитивна реакція (++++,

+++) – повна затримка гемолізу, рідина безколірна або блідо-рожевого кольору,

еритроцити осідають на дно; позитивна реакція (++) – часткова затримка гемолі-

зу, рідина рожевого кольору, компактний осад еритроцитів; сумнівна реакція (+) –

незначна затримка гемолізу, на дні ледь помітний осад, рідина рожевого кольору;

негативна реакція (–) – повний гемоліз, осад відсутній, рідина червона і прозора.

Реакція зв’язування комплементу відзначається більш високою специфічні-

стю ніж реакція аглютинації, проте вона менш чутлива. Антитіла, які зв’язують

комплемент, виявляються на 2-4 тижні від моменту захворювання, в той же час

аглютиніни можна знайти вже через 1-2 тижні.

РЗК набула широкого розповсюдження для діагностики багатьох інфекцій-

них захворювань, алергічних станів. Вона використовується для серологічної діаг-

ностики захворювань бактерійної етіології (сифілісу, лептоспірозу, бруцельозу,

туляремії, лістеріозу, озени, орнітозу та ін.), вірусного походження (грипу, паро-

титу, цитомегалії, поліомієліту, лімфоцитарного менінгіту, енцефаліту тощо), гриб-

кових (кандидозу, асперігельозу), а також токсоплазмозу, пневмоцистозу тощо.

Реакція імунофлуоресценції (РІФ)

Позитивні результати реакцій аглютинації, преципітації, лізису, РЗК й інших

спостерігають тільки при оптимальному співвідношенні реагентів. Якщо ця умова

не виконується, зафіксувати видимий позитивний результат не завжди вдається.

Чутливість імунологічних реакцій значно зростає завдяки використанню міче-

них реагентів, наприклад, антитіл, кон’югованих з флуохромом. При зв’язуванні

таких імуноглобулінів з антигеном в люмінесцентному мікроскопі спостерігають

світіння об’єктів (бактерій, вірусів, клітин), покритих міченими антитілами. Імуно-

флуоресцентним методом можна також визначати антитіла в сироватці хворого,

на поверхні клітин і тканин. У цьому випадку використовують мічені флуоресцеї-

ном сироватки проти глобулінів людини (антиглобулінові), якими обробляють ком-

плекс антиген-антитіло. Внаслідок цього він під дією ультрафіолетових променів

починає світитись зеленим світлом.

У першому випадку говорять про прямий, у другому – про непрямий імуно-

флуоресцентний метод (рис. 55).

Імунофлуоресцентні методи вживаються для виявлення аутоантитіл до тка-

нинних і клітинних антигенів. Використовуючи зрізи тканин, на предметному склі

можна виявити антитіла до декількох різних антигенів.

З допомогою імунофлуоресцентних методів можна ідентифікувати окремі

клітини в суспензії клітин з допомогою виявлення антигенів на поверхні живих

клітин. Для цього суспензію живих клітин, які були попередньо пофарбовані флуо-

ресцентними барвниками, пропускають через спеціальний прилад (цитофлуори-

метр), який заміряє інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектра

і потім розділяє клітини за параметрами світіння.

146

Частина ІІ. Імунологія

Імуноферментні методи (ІФА)

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один

з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний

відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і анти-

тіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка

залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону

може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людсь-

ких тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як

пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні

технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці;

особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулю-

ючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діаг-

ностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міче-

ним пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат

(наприклад, Н

, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу,

в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста,

проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з інши-

ми методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утво-

рюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять про-

тиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплек-

сом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсор-

бованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення (рис. 56).

Рис. 55. Реакція імунофлуоресценції (прямий і непрямий методи).

Флуоресцуюче

антитіло

Антитіло

Антиген

фіксований

на слайді

Антиген

фіксований

на слайді

Фіксоване

антитіло

Флуоресцуючий

анти-імуноглобулін

ПРЯМИЙ МЕТОД НЕПРЯМИЙ МЕТОД

147

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші анти-

тіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші

спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості сис-

теми авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінан-

ти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати

для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн

або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали за-

стосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може

бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пе-

роксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже

розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні анти-

тіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точні-

шої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпо-

пуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних

антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пер-

оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне анти-

тіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюєть-

ся продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим

моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксида-

за, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох

випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в на-

ступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових

планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген

чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджувану

сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів

людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат

промивка промивка

Рис. 56. Схема імуноферментного методу:

1 – тверда фаза з фіксованим антигеном; 2 – немічене антитіло, зв’язане з антигеном;

3 – антиглобулін, кон’югований з ензимом, зв’язаний з комплексом антиген-антитіло;

4 – внесення субстрату; який розкладається ензимом; 5 – зміна забарвлення в лунці

свідчить про присутність ензиму, а значить, відповідно антитіла.

12 3 4 5

148

Частина ІІ. Імунологія

для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція,

після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчас-

тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики спе-

цифічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є моди-

фікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердо-

му носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сиро-

ватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні анти-

тіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном,

мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в

луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних ан-

титіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном,

фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостері-

гається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких засто-

совують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій –

H і йод –

125

J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників γ-проміння, в

яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи анти-

тіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного

зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена,

який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість

досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв’язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розмі-

щене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають

антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в

матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись з антитілом міче-

ний антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У

даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До

утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке

зв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості

зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення ан-

тигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді

антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений

антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є пропорційною кількості дослі-

джуваних антитіл.

149

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergo-

sorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST

(paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (фільтрувальний

папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані анти-

тіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї

реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифіка-

ція цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів,

вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх

виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення

роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню

стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, од-

нак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені

при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах

гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметр пор мат-

риці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методи-

ку, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на

поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким

чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій

фазі), стають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх

на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток –

блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють

з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично переносять

на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. Фіксовані

блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають

радіоактивно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з

рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться

смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла або

антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму

(хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну мембрану.

Існує багато різноманітних методів, в яких використовується блотинг, наприк-

лад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, Western блотинг.

Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких використовується

гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на феномені реакції анти-

ген-антитіло.

150

Частина ІІ. Імунологія

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у викорис-

танні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка

комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК. Генетичні зонди, що

застосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, штучного

синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на відміну

від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділити

дві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним ізо-

топом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою

міткою генетичного зонду є біотин. Біотин – розчинний у воді вітамін Н, в структурі

якого знаходиться залишок деоксиуридинтрифосфата, який є структурним аналогом

трифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце

тимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде

комплементарну йому нитку нуклеїнової кислоти, то його можна виявити, додаючи

авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який знаходиться

в яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має

чотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагу-

ють з біотином, який знаходиться в гібридизованому зонді, свідченням чого є зміна

забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфічний субстрат. Зонди з біотином

можна виявити, використовуючи мічені флуорохромом антитіла проти біотину.

Реакції гібридизації блотинг проводяться на мембранах, які містять мікропо-

ри і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних,

антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій,

вірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В

останньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі

дуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги

електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою,

на якій можна буде виявити антитіла проти індивідуальних білків. Мембрану ріжуть

на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх

певний час з досліджуваною сироваткою, яка містить антитіла проти білків. Смуги

промивають для усунення антитіл, які не зв’язались, і додають мічену антиглобулі-

нову сироватку. Після чого смуги повторно промивають для видалення антиглобу-

лінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де насту-

пила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна використовува-

ти мічені ізотопом антитіла (рис. 57).

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є біотин, за-

стосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає небезпеку, пов’я-

зану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування біотину вимагає до-

даткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно

зв’язується з біотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної ре-

акції наступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для дослі-

дження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку інфекційного