Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

111

Розділ 7. Генетика бактерій

Розділ 7

ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ

Генетика бактерій та вірусів – наука, що вивчає механізми успадковування

генетичних ознак та їх фенотипові прояви. Генетичний апарат прокаріотів побу-

дований із двоспіральної суперспіралізованої ДНК. Сукупність генів нуклеоїду і

позахромосомних факторів зумовлює генотип бактерій, а фенотип – це індивіду-

альний вияв генотипу в конкретних умовах існування.

Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову, або модифі-

каційну та спадкову, або генотипову. Неспадкова мінливість виникає під впливом

факторів зовнішнього середовища (зміна морфології клітини, поява L-форм тощо).

Модифікаційні зміни нетривалі, після припинення дії агента вони зникають. При

генотиповій мінливості різноманітні ознаки бактерій успадковуються. Ця мін-

ливість виникає внаслідок мутацій, трансформацій, коньюгацій і трансдукцій.

Вивчення модифікаційної мінливості бактерій. Готують 2 чашки Петрі,

одна з яких містить м’ясо-пептонний агар з 0,1 % фенолу, інша – звичайний МПА.

На поверхню чашок засівають культуру Proteus vulgaris. Посіви інкубують у тер-

мостаті при температурі 37 °С протягом доби. Потім вивчають особливості росту

мікробів на поверхні агару, роблять мазки, забарвлюють їх за Грамом і розгляда-

ють під імерсійним об’єктивом. На контрольному середовищі (МПА) вульгарний

протей представлено невеликими грамнегативними паличками, які мають тенден-

цію до повзучого росту по поверхні середовища. На агарі з фенолом спостері-

гається тенденція до утворення ізольованих колоній, в мазках видно ниткоподібні

форми бактерій, часом із колбоподібними потовщеннями на кінцях.

Фенол як фактор модифікаційної мінливості може викликати втрату рухли-

вості протеїв. Для її перевірки добову культуру P. vulgaris засівають у дві про-

бірки: одна з них містить звичайний МПБ (контроль), інша – 0,1 % феноловий

МПБ. Через добу культивування при температурі 37 °С у висячій краплі перевіря-

ють рухливість збудників.

У контрольній пробірці вони зберігають рухливість, у дослідній – мікроби

нерухомі. Для доведення природи модифікаційної мінливості мікроби засівають

на звичайний м’ясо-пептонний агар і після 18-24-годинного культивування пере-

віряють біологічні ознаки, в яких у цьому випадку спостерігається реверсія.

Метод реплік для виявлення мутантів. На чашку Петрі із повноцінним

м’ясо-пептонним агаром за добу до досліду засівають 0,1 мл добової бульйонної

Отже, DL

відповідатиме розведенню зависі 10

-5,5

. Враховуючи, що при се-

рійних розведеннях послідовно з пробірки в пробірку переноситься 0,1 мл матері-

алу (тобто, додається до 0,9 мл ізотонічного розчину), в 1 мл вихідної зависі бак-

терій міститься 10

6,5

112

Частина І. Загальна мікробіологія

культури E. сolі, розведеної до 10

-3

ступеня із розрахунку, щоб виросло 100 ко-

лоній. На наступний день готують мінімальне живильне середовище, яке не містить

ростових факторів для бактерій (глюкозо-сольовий агар), і чашку з повноцінним

середовищем. Для досліду використовують штамп-реплікатор, який представляє

собою дерев’яний або металевий циліндр товщиною до 1 см з діаметром дещо

меншим, ніж чашка Петрі (рис. 39). Його робоча поверхня вкрита оксамитом, вор-

саланом або іншим матеріалом, що має

дрібні ворсинки. Відкривають чашку

Петрі, на якій виросли колонії мікроор-

ганізмів (матрична чашка), і прикладають

до неї штамп-реплікатор. Після цього пе-

реносять колонії, які прикріпились до вор-

синок, на дослідну і контрольну чашки

Петрі (чашки-репліки) із відповідними се-

редовищами. Необхідно звернути увагу на

точне фіксування положення штампа-ре-

плікатора на матричній чашці і чашках-репліках. Після добової інкубації при тем-

пературі 37 °С вивчають колонії, що виросли на чашках і підраховують їх кількість.

Відмічають колонії мікроорганізмів, які не виросли на мінімальному живильному

середовищі. Вони є ауксотрофними мутантами, тому що нездатні синтезувати

відповідні ростові фактори.

Ідентичний експеримент можна поставити для виділення мутантів, які є ре-

зистентними до антибіотиків, не потрапляючи попередньо під їх вплив (селекцій-

на дія).

Флуктуаційний тест Лурія і Дельбрюка для виявлення частоти спон-

танних мутацій. Для того, щоб виявити частоту спонтанних мутацій, які зумов-

люють стійкість до стрептоміцину (Str

варіанти), відбирають чутливий до цього

антибіотика штам E.coli. З добової культури бактерій у стерильному ізотонічному

розчині хлориду натрію готують суспензію клітин з концентрацією 1000-10000

клітин в 1 мл. Їх засівають у пробірку з 10 мл МПБ і в 10 пробірок з 1 мл аналогіч-

ного середовища так, щоб концентрація мікробів коливалась у межах 100-1000

клітин в 1 мл. Після добової інкубації при оптимальній температурі (37 °С) з 1-ої

пробірки роблять висів по 0,1 мл на 10 чашок Петрі, які містять по 100 ОД стреп-

томіцину в 1 мл агару. Посів проводять за допомогою шпателя. Вміст інших деся-

ти пробірок також засівають на аналогічні окремі чашки Петрі із стрептоміцином,

кожну в об’ємі 0,1 мл, шпателем. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протя-

гом 18-20 год.

Якщо стрептоміцинорезистентні кишкові палички утворюються тільки після

контакту мікробів із антибіотиком протягом доби, то їх число повинно було б бути

приблизно однаковим на всіх 20 чашках Петрі. В іншому випадку, за умови перед-

існування антибіотикостійких варіантів (мутантних), на чашках виростає неодна-

кова кількість колоній мікроорганізмів. Це є прояв коливань (флуктуацій) кількості

мутантних клітин залежно від часу формування мутацій.

Рис. 39. Метод реплік.

113

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

Висів мікробів із пробірки, де знаходилось 10 мл живильного середовища, не

дає таких флуктуацій мутантів, оскільки клітини рівномірно розподіляються в

живильному середовищі.

Моделювання трансформації в мікроорганізмів. У досліді використовуєть-

ся стрептоміциночутлива сінна паличка (Bac. subtilis Str

) і донорська ДНК анало-

гічного мікроба, яка має гени, що кодують стійкість клітини до антибіотиків.

У стерильну пробірку наливають 0,5 мл бульйонної культури штама-реципі-

єнта Bac. subtilis і додають 0,5 мл донорської ДНК з концентрацією 1 мкг/мл. Суміш

інкубують у термостаті при 37 °С протягом 20-30 хв, потім додають 0,5 мл розчину

хлориду магнію для руйнування ДНК, що не встигла проникнути в клітину-реци-

пієнт. Роблять серійні 10-кратні розведення трансформованої культури у стериль-

ному ізотонічному розчині хлориду натрію до 10

-5

-10

-6

і проводять посіви матеріалу

в об’ємі 0,1 мл за допомогою шпателя паралельно на чашки без антибіотика і з

100 ОД/мл стрептоміцину.

Після інкубації протягом 18-24 год при температурі 37 °С оцінюють резуль-

тати досліду, вираховуючи частоту трансформації.

Наприклад, після посіву штама-реципієнта, який було розведено в 10000 (10

-5

)

разів, на поверхні середовища виросло 120 колоній бацил (1,2·10

/мл). Посів 0,1 мл

нерозведеного рекомбінантного штаму на середовище із стрептоміцином дав ріст

60 колоній (6,0·10

/мл). Отже, частота трансформації (ЧТ) дорівнюватиме :

105

102,1

100,6

ЧТ

−

⋅=

⋅

Таким чином, генетичні феномени знаходять широке практичне застосуван-

ня в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біо-

технології, сільського господарства тощо.

Розділ 8

ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ БАКТЕРІЙ

ДО АНТИБІОТИКІВ

Антибіотики – це речовини мікробного, рослинного або тваринного похо-

дження, їх напівсинтетичні та синтетичні аналоги і похідні, що вибірково при-

гнічують життєдіяльність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також

затримують ріст пухлин.

Антибіотикам притаманна висока біологічна активність. Вони спричиняють

біологічний ефект у дуже малих кількостях (наприклад, пеніцилін викликає вира-

жену бактерицидну дію на бактерії у концентрації 0,000001 г/мл). Антибіотики

мають високу вибіркову специфічність, оскільки проявляють свою дію тільки

114

Частина І. Загальна мікробіологія

відповідно до певних груп організмів, не завдаючи шкоди іншим. Так, бензилпе-

ніцилін затримує ріст грампозитивних бактерій (стафілококів, стрептококів) і прак-

тично не впливає на грамнегативні мікроби, гриби.

Біологічну активність антибіотиків оцінюють в умовних одиницях, які міс-

тяться в 1 мл розчину (ОД/мл) або в 1 мг препарату (ОД/мг). У таких антибіотиків,

як еритроміцин, новобіоцин, ністатин, трихоцетин та ін. одна одиниця активності

еквівалентна 1 мкг препарату. За одиницю антибіотичної активності пеніциліну

приймають мінімальну кількість препарату, здатну затримувати ріст штаму

Staphylococcus aureus 209 у 50 мл поживного бульйону. Активність стрептоміцину

вимірюється мінімальною кількістю антибіотика, який інгібує ріст Escherichia coli

в 1 мл поживного бульйону. Фактично для більшості антибіотиків 1 ОД відповідає

1 мкг хімічно чистого препарату. Однак є антибіотики, для яких існують винятки.

Так, наприклад, для пеніциліну 1 ОД відповідає 0,6 мкг, поліміксину В – 0,1 мкг,

ністатину – 0,333 мкг хімічно чистих антибіотиків.

Оцінка чутливості мікробів до антибіотиків та вивчення їх фармакокінетики

в організмі хворого є основними лабораторними показниками, які при їх співстав-

ленні дозволяють прогнозувати ефективність антибактеріальної терапії. Крім того,

результати визначення антибіотикочутливості використовують як маркер, що доз-

воляє виявляти та контролювати зміни антибіотикограми збудників у динаміці,

використовувати детермінанти резистентності, які найчастіше зустрічаються, або

їх сполучення як додаткові маркери при діагностиці внутрішньолікарняних інфек-

цій, для виявлення джерел інфікування та шляхів розповсюдження полірезистент-

них штамів. Такі дані, одержані та узагальнені у різних регіонах країни протягом

фіксованих проміжків часу, використовуються при формуванні політики антибак-

теріальної терапії та визначенні номенклатури антибіотиків, які випускаються

в країні.

Найрозповсюдженішими методами визначення антибіотикочутливості збуд-

ників інфекцій є диско-дифузійний (метод дисків) та серійних розведень.

Живильні середовища для визначення чутливості бактерій до антибіотиків

повинні відповідати таким вимогам:

• бути стандартними та забезпечувати оптимальні умови росту мікроорганізмів;

• не містити інгібіторів бактеріального росту і великої кількості стимуляторів;

• не мати речовин, що пригнічують активність препаратів.

На результати дослідження може суттєво впливати значення рН середовища.

Найдоцільніше вибирати нейтральне або дещо лужне середовище (рН 7,0-7,4),

оскільки ці значення придатні для більшості антибіотиків. При визначенні чутли-

вості бактерій використовують бульйон і 1,5-2 % агар на переварі Хоттінгера, зви-

чайний м’ясо-пептонний бульйон і 1,5-2 % агар на ньому, середовище АГВ (агар

Гівенталя-Вєдьміної), агар Mueller-Hinton 2. Вони придатні при визначенні анти-

біотикочутливості стафілококів, ентеробактерій, псевдомонад. Однак стрептоко-

ки та гемофільні бактерії вимагають добавки ростових факторів; дріжджі та ана-

еробні бактерії – спеціальних середовищ і певних умов культивування. На резуль-

тати визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків-аміноглікозидів,

115

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

поліміксинів, тетрациклінів впливає вміст у живильних середовищах катіонів каль-

цію, магнію, що особливо важливо при дослідженні P. aeruginosa. Оптимальний

вміст – 50 мг/л Са

і 25 мг/л Mg

. Більшість середовищ, що випускаються країна-

ми СНД, за цим показником, як правило, не стандартизуються. Це призводить до

суттєвих коливань вмісту двовалентних катіонів у різних серіях середовищ, навіть

якщо вони випускаються одним підприємством, і спотворює результати.

Диско-дифузійний метод визначення антибіотикочутливості є найпростішим

якісним методом і широко використовується для епідеміологічного контролю ре-

зистентності. Достовірність результатів забезпечується шляхом стандартизації

проведення тесту на всіх етапах дослідження: вибір і виготовлення живильних

середовищ із врахуванням всіх властивостей можливих збудників, взяття проб і

умови їх доставки, виготовлення і розливання посівного матеріалу на поверхню

агару, вибір дисків (використання набору дисків у відповідності до виду виділе-

ного збудника та локалізації інфекції).

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків слід визначати тільки у чистій

культурі. Однак у ряді випадків для швидкого одержання орієнтовних даних про

антибіотикограму бактерій використовують безпосередньо патологічний матері-

ал. Щільні субстрати (харкотиння, гній, кал та ін.) розтирають, рідини (сеча, ексу-

дати та ін.) центрифугують, а для посіву використовують осад. Досліджуваний

матеріал наносять на поверхню живильного середовища петлею або ватним там-

поном. Після одержання чистої культури дослідження повторюють.

Для виготовлення інокулюму 5-10 однорідних колоній суспендують у 2 мл

рідкого середовища або фізіологічного розчину. Бактеріальну суспензію (10

-10

КУО/мл залежно від виду мікробів) в об’ємі 1 мл рівномірно розподіляють по

поверхні середовища при похитуванні чашки, надлишок рідини видаляють піпет-

кою. Чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 20-30 хв, а потім на

них на однаковій віддалі кладуть диски з антибіотиками.

Рівномірність газону, яка визначається величиною посівної дози, – найголов-

ніший фактор одержання достовірних результатів і підлягає кількісній оцінці та

якісній стандартизації. Ступінь нестандартності результатів дослідження, який

пов’язаний із зміною величини дози інокулюму, варіює залежно від виду збуд-

ників, властивостей антибіотика та інших факторів. При невеликій дозі інокулю-

му при визначенні чутливості до бета-лактамних препаратів пеніциліназо-утво-

рюючих бактерій можна одержати великі розміри зон затримки росту, які створю-

ють уявлення про високу чутливість штамів. І, навпаки, розмір зон різко знижується

при збільшенні щільності інокулюму. Вирішальне значення має його величина

при визначенні чутливості до бета-лактамних антибіотиків метицилінорезистент-

них варіантів стафілококів внаслідок гетерогенності їх саме за показником чутли-

вості. Для виявлення стійкості до метициліну необхідно дотримуватись певних

температурних режимів (30-35 °С). Оскільки ці стафілококи повільніше ростуть

при 37 °С, слід їх культивувати на середовищах з додаванням 5 % хлориду натрію.

Результати враховують через 24 та 48 год (рис. 40). Для контролю стандартності

проведення досліджень у кожному досліді використовують тест-культури з відо-

116

Частина І. Загальна мікробіологія

мою чутливістю до антибіотиків. ВООЗ рекомен-

дує три штами типових культур: Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

При визначенні антибіотикочутливості виділених

штамів слід співставляти отримані дані з розмі-

рами зон пригнічення росту навколо дисків з ан-

тибіотиками для контрольних культур (табл. 12).

Їх порівнюють з допустимими контрольними зна-

ченнями.

Якщо діаметри зон пригнічення росту конт-

рольних штамів знаходяться у певних межах, це

свідчить про достатню стандартизацію і точність

проведених експериментів. Не слід розміщати на

чашці Петрі понад 6 дисків, так як при великих

діаметрах зон затримки росту це може бути джерелом помилок і впливати на

кількісну інтерпретацію результатів. Правильний підбір набору дисків є факто-

ром, який визначає коректність досліджень і, без сумніву, інтерпретацію резуль-

Таблиця 12

Граничні межі діаметрів зон затримки росту еталонних штамів

Діаметри зон затримки росту, мм

на середовищах № 1 і № 2 на середовищі АГВ

Антибіотики

S. aureus

ATCC

25923

E. coli

ATCC

25922

P. aeruginosa

ATCC

27853

S. aureus

ATCC

25923

E. coli

ATCC

25922

P. aeruginosa

ATCC

27853

1 2 3 4 5 6 7

Бензилпеніцилін - - - 29-38 - -

Ампіцилін 24-35 13-20 - 30-36 14-20 -

Карбеніцилін (25 мкг) - - - 32-38 19-25 -

Карбеніцилін (100 мкг) - 21-26 20-24 35-42 23-29 18-24

Метицилін - - - 22-30 - -

Оксацилін 27-32 - - 24-30 - -

Цефалотин 24-37 15-22 - 30-40 15-20 -

Стрептоміцин 17-25 14-22 - 20-25 14-19 -

Неоміцин 19-27 18-24 - 20-27 13-17 -

Канаміцин 20-27 18-26 - 20-27 15-19 -

Гентаміцин 20-28 20-27 16-24 22-32 21-30 16-26

Тетрациклін 20-29 19-26 - 22-31 17-26 -

Еритроміцин 23-31 - - 22-31 8-15 -

Олеандоміцин 20-29 - - 22-29 - -

Лінкоміцин 24-32 - - 24-32 - -

Левоміцетин 21-27 26-28 - 19-25 19-27 -

Рифампіцин - - - 26-34 7-11 -

Поліміксин - 12-17 - - 16-20 15-20

Ристоміцин 14-18 - - 12-16 - -

Рис. 40. Визначення антибіотико-

чутливості за допомогою

методу стандартних дисків.

117

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

татів. Орієнтовні дані щодо вибору наборів дисків із врахуванням виду виділено-

го збудника і локалізації інфекції наведено у таблиці 13.

Таблиця 13

Основні набори дисків, які рекомендуються для визначення чутливості

залежно від виду виділеної культури та патологічного матеріалу

Попереднє вивчення

чутливості мікрофлори

Дослідження чистої культури (штами)

Антибіотики

харко-

тиння

гною сечі

стафіло-

коків

стреп-

тококів

ентеро-

бактерій

псевдо-

монад

Бензилпеніцилін + +* +* +*

Метицилін,

Оксацилін

+* +* +* +*

Ампіцилін +* +* +*

Карбеніцилін (25 мг) +* +

Карбеніцилін (100 мг) +* +*

Цефалексин +* +* +* +* +* +*

Цефалотин + + +* +* +*

Еритроміцин +* +* +*

Олеандоміцин + +* +*

Лінкоміцин + +

Ристоміцин +

Фузидин +

Стрептоміцин +

Канаміцин +* + +

Гентаміцин +* + + +*

Тетрациклін +* +* + + +*

Левоміцетин + + + +

Поліміксин + +*

Примітка. * – антибіотики, чутливість до яких визначають у першу чергу.

Оцінку результатів проводять за таблицею 14, яка містить граничні значення

діаметрів зон затримки росту для резистентних, помірно резистентних та чутли-

вих штамів, а також значення мінімальної пригнічуючої (інгібуючої) концентрації

(МПК, МІК) антибіотиків для стійких і чутливих штамів.

Одержані значення діаметрів зон затримки росту порівнюють з контрольни-

ми значеннями таблиці 14 і відносять досліджувані штами до однієї з трьох кате-

горій чутливості.

Метод дифузії за допомогою дисків є якісним методом. Він дозволяє встано-

вити лише факт чутливості або резистентності збудників інфекції. Однак вста-

новлений корелятивний зв’язок розмірів зон пригнічення росту досліджуваних

штамів і значень МІК (мінімальна концентрація препарату, яка інгібує ріст дослі-

джуваного штаму) антибіотиків дозволяє оцінити ступінь чутливості і кількісно,

використовуючи дані, наведені у таблиці 14. За своїм ступенем чутливості до ан-

тибіотиків мікроорганізми поділяються на три групи:

118

Частина І. Загальна мікробіологія

Таблиця 14

Граничні значення діаметрів зон затримки росту і значення МПК антибіотиків для інтерпретації результатів

Діаметри зон для середовища АГВ, мм МПК, мкг/мл

Антибіотики

Вміст

антибіотика

в диску, мкг

Код

диску

стійкі помірно-стійкі чутливі стійкі чутливі

Бензилпеніцилін:

при дослідженні стафілококів

при дослідженні інших мікробів

ПЕН

≤

21-28

11-16

≥

≤

0,1

≤

1,5

Ампіцилін при дослідженні:

стафілококів

грамнегативних бактерій та ентерококів

АМП

≤

21-28

10-13

≥

≥32

≤

0,2

≤

Карбеніцилін при дослідженні:

кишкової палички та протея

синьогнійної палички

100

КАР

≤

15-18

12-14

≥

250

≤

125

Метицилін 10 МЕТ

≤

14-18

≥

≤

Оксацилін 10 ОКС

≤

16-19

≥

≤

Цефалексин 30 ЦФЛ - - -

≥32 ≤10

Цефалотин 30 ЦФТ

≤

15-18

≥

≤

Стрептоміцин 30 СТР

≤

17-19

≥

≤

Неоміцин 30 НЕО

≤12

13-16

≥17

≤10

Канаміцин 30 КАН

≤

15-18

≥

≤

Мономіцин 30 МОН

≤

14-17

≥

≤

Гентаміцин 10 ГЕН

≤15

≥16 ≥6 ≤4

Сизоміцин 10 СИЗ - - -

≥

≤

Тетрациклін 30 ТЕТ

≤

17-21

≥

≤

Доксициклін 10 ДОК - - -

≥12 ≤2

Еритроміцин 15 ЕРИ

≤

18-21

≥

≤

Олеандоміцин 15 ОЛЕ

≤

17-20

≥

≤

Лінкоміцин 15 ЛІН

≤19

20-23

≥24 ≥8 ≤2

Левоміцетин 30 ЛЕВ

≤

16-18

≥

≤

Рифампіцин 5 РІФ

≤

13-15

≥

≤

Фузидин 10 ФУЗ - - -

≥

≤

Поліміксин 300 ОД ПОЛ

≤

12-14

≥

50 ОД/мл

Ристоміцин 30 РІС

≤

10-11

≥

≤

119

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

1 група – чутливі до антибіотиків (збудники знищуються в організмі при ви-

користанні звичайних терапевтичних доз препаратів);

2 група – помірно-резистентні (для них лікувальний ефект може бути досяг-

нутий при використанні максимальних терапевтичних доз препаратів);

3 група – резистентні (бактерицидних концентрацій препаратів в організмі

створити неможливо, тому що вони будуть токсичними).

При визначенні стійкості до антибіотиків, близьких за хімічною будовою і

спектром антибактеріальної дії, можливе використання клас-диска, просякнутого

одним з антибіотиків певної групи. Так, за допомогою диска з бензилпеніциліном

можна визначати чутливість до біцилінів, феноксиметилпеніциліну; цефалекси-

новим – до цефазоліну, цефаклору, цефалотину. Однак, не рекомендується вико-

ристовувати тетрациклінові диски для визначення чутливості до доксицикліну.

Строки та температура зберігання дисків вказані на етикетці упаковок. Дис-

ки з малостабільними антибіотиками (бензилпеніциліном, ампіциліном, карбені-

циліном, метициліном, оксациліном) слід зберігати при 4 °С або 14 °С. Після того,

як флакон із дисками відкрито, його зберігають протягом тижня при 4 °С. Перед

застосуванням його протягом 1 год залишають при кімнатній температурі для по-

передження утворення конденсату на внутрішніх стінках флакона. Диски із про-

строченим терміном зберігання, де сілікагель має рожевий колір, використовува-

ти не можна.

Метод серійних розведень. Показаннями для визначення антибіотикочутли-

вості за методом серійних розведень є необхідність одержання кількісних даних

(переважно при тяжкому перебігу інфекційних процесів) для проведення регульо-

ваної антибіотикотерапії.

Встановлення ступеня чутливості мікробів до антибактеріальних препаратів

впливає на вибір антибіотика (наприклад, відмова від ліків з високою токсичні-

стю при помірному ступені чутливості збудника до них), його дозування (концен-

трація антибіотика в крові повинна в 2-3 рази перевищувати його мінімальну при-

гнічуючу концентрацію по відношенню до збудника) і режим введення. Крім того,

її кількісне визначення необхідне також для встановлення бактерицидної дії об-

раного препарату (як гарантії швидкого терапевтичного ефекту та безрецидивно-

го перебігу) по відношенню до даного збудника.

Існують дві модифікації методу серійних розведень – визначення чутливості

на рідкому та густому живильних середовищах. Метод дає можливість визначити

МПК препарату для виділеного штаму збудника.

Для визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень у

рідкому живильному середовищі готують ряд (8-10 і більше) пробірок з двократ-

ними послідовними розведеннями препарату (табл. 15).

Середовище попередньо розливають у пробірки по 2 мл. У першу додають 2

мл розчину антибіотика певної концентрації, перемішують і переносять до на-

ступної пробірки, продовжуючи розведення до передостанньої, з якої видаляють

2 мл суміші. Остання пробірка служить контролем росту культури. У тому ж бульй-

оні, який використовують для розведення антибіотиків, готують суспензію добо-

120

Частина І. Загальна мікробіологія

Таблиця 15

Схема визначення антибіотикочутливості за методом серійних розведень

Пробірки

Компоненти, мл

Контроль

бактерій

Контроль

анти-

біотика

МПБ 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Пеніцилін, 100 ОД/мл 2,0

→

↑

- 2,0

Концентрація

антибіотика, ОД/мл

50 25 12,5 6,3 3,2 1,6 0,8 0,4 - 50

Суспензія бактерій,

/мл

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -

Інкубація в термостаті при 37

С 18-24 год

Результат

вої агарової або бульйонної культури бактерій з розрахунку 10

-10

мікробних тіл

в 1 мл залежно від виду збудника. Потім до кожної пробірки з розведеннями, а

також до контрольної додають по 0,2 мл виготовленої суспензії. При визначенні

чутливості до пеніцилінів пеніциліназоутворюючих стафілококів рекомендують

використовувати одночасно велике й мале мікробне навантаження (100, 100000 та

вище мікробних тіл в 1 мл). Залежно від величини посівної дози значення МПК

препарату може коливатись: при збільшенні дози чутливість знижується за раху-

нок зростання кількості пеніцилінази, що утворюється в середовищі.

Пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 18-24 год. Результати

враховують, визначаючи наявність або відсутність росту в середовищі з різними

розведеннями препарату. (рис. 41). Остання пробірка, в якій спостерігають зат-

римку росту культури (прозорий бульйон), відповідає МПК (мінімальній пригнічу-

ючій концентрації) або МБсК (мінімальній бактеріостатичній концентрації) пре-

парату відносно даного мікроба і вказує на ступінь його чутливості. Якщо ознаки

росту з’являються в усіх пробірках, досліджуваний штам резистентий до макси-

мальної концентрації препарату, яку було взято у дослід. Відсутність росту бак-

терій в усіх пробірках, крім контрольної, свідчить, що МПК препарату нижча, ніж

та, що використовується в досліді.

Для визначення бактерицидного ефек-

ту антибіотика з декількох останніх про-

бірок, в яких немає ознак росту, роблять

висів на сектори агару в чашках Петрі. Че-

рез 24-48 год інкубації при оптимальній

температурі відмічають ту найменшу кон-

центрацію препарату в пробірці, посів з якої

не дав росту. Її вважають мінімальною бак-

терицидною концентрацією (МБцК).

Принцип методу серійних розведень у

густому живильному середовищі анало-

Рис. 41. Визначення антибіотикочутли-

вості методом серійних розведень.