Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

101

Розділ 6. Експериментальна інфекція

2. Виділення та ідентифікації чистої культури, визначення її токсигенності

чи токсичності.

3. Визначення вірулентності мікроорганізмів, встановлення мінімальних смер-

тельних доз мікробів, екзотоксинів та ендотоксинів.

4. При наукових дослідженнях з проблем механізму розвитку інфекційних

хвороб, формування імунітету, специфічного лікування і профілактики.

5. При контролі імуногенності, токсичності, стерильності, нешкідливості,

пірогенності біологічних медичних препаратів (вакцин, анатоксинів, ліків тощо).

6. Для отримання діагностичних імунних сироваток.

Дуже важливим етапом є вибір відповідних тварин для експериментального

зараження. Найчастіше в лабораторній практиці використовують білих мишей,

гвінейських свинок, білих щурів і кроликів. Деякі спеціальні лабораторні дослі-

дження проводять на мавпах, собаках, котах, хом’яках, ховрахах, тхорах, бавовня-

них щурах, мишах-полівках, а також на птахах (голуби, кури, папуги та ін.). Вибір

виду тварин оснований на знанні чутливості їх до тих чи інших мікроорганізмів.

Білі миші високочутливі до пневмококів, клебсієл, деяких видів сальмонел,

збудників сибірки, чуми, туляремії, лістеріозу, меліоїдозу, правця, ботулізму, газо-

вої анаеробної інфекції, коклюшу, орнітозу, висипного тифу, сказу, лейшманіозу,

токсоплазмозу. Новонароджені миші чутливі до арбовірусів, поліовірусів, коксакі-

вірусів. На білих мишах визначають силу екзо- і ендотоксинів.

Гвінейські свинки чутливі до збудників туберкульозу (M.hominis), псевдоту-

беркульозу, дифтерії, чуми, туляремії, бруцельозу, сапу, холери, сибірки, лептоспі-

розу, меліоїдозу, лістеріозу, орнітозу, ботулізму, правця, газової гангрени, кашлюка,

висипного тифу, ящуру.

Білих щурів використовують для експериментального відтворення сказу, со-

доку, амебіазу, меліоїдозу, токсоплазмозу, туберкульозу (M.bovis).

Кролики чутливі до стафілококів, стрептококів, деяких видів сальмонел, збуд-

ників туберкульозу, сибірки, пастерельозу, лістеріозу, ботулізму, правця, сифілісу,

амебіазу, токсоплазмозу, вірусів сказу й простого герпесу.

Мавпи зрідка використовують як експериментальну модель при сифілісі, ту-

беркульозі, дизентерії, лістеріозі, меліоїдозі, цереброспінальному менінгіті, че-

ревному тифі, кашлюку, поліомієліті та ін.

Коти чутливі до збудників амебної дизентерії, сапу, кашлюку, стафілококо-

вих інфекцій, дії ентеротоксинів (кошенята-сисуни).

Сірійських хом’яків використовують для відтворення бруцельозу, сапу, лей-

шманіозу, токсоплазмозу, амебіазу, лептоспірозу, рикетсіозів, сказу, геморагічних

гарячок.

Птахи (голуби, кури, папуги) чутливі до збудників туберкульозу (M.avium),

анаеробної газової інфекції, риносклероми (курчата), ботулінового екзотоксину.

Для отримання високостандартних і легковідтворюючих стабільних резуль-

татів, а також в наукових дослідженнях, особливо вірусологічних, у лабораторній

практиці використовують генетично стандартизованих лінійних (гомозиготних)

тварин. Їх отримують у спеціальних віваріях шляхом багаторазового близькоспорід-

102

Частина І. Загальна мікробіологія

неного схрещування (інбридінга). Уж е виведено біля 700 ліній білих мишей, 170

ліній щурів, 16 ліній гвінейських свинок, біля 70 ліній хом’яків, 7 ліній курчат та ін.

Такі тварини і птахи мають чітко запрограмовані біологічні властивості, такі як

висока чутливість до певних збудників, здатність до імунологічної відповіді тощо.

У лабораторних тварин можуть виникати спонтанні захворювання бактері-

альної чи вірусної природи, латентні інфекції. Вони також мають свою нормальну

мікрофлору. Все це ускладнює виділення чистих культур від заражених тварин і

визначення їх етіологічної ролі. Цього недоліку позбавлені безмікробні лабора-

торні тварини – гнотобіоти, а також тварини, вільні від спеціальних патогенних

збудників (СПЗ-тварини). Їх використовують для проведення важливих експери-

ментів з проблем вивчення ролі нормальної мікрофлори в інфекції, імунітеті, ут-

ворення вітамінів, ферментів та інших біологічно активних речовин.

Способи зараження експериментальних тварин

Для постановки біологічної проби або відтворення інфекційного захворю-

вання у лабораторних тварин використовують різні методи введення мікроор-

ганізмів, їх токсинів або іншого досліджуваного матеріалу: нашкірний, внутріш-

ньошкірний, підшкірний, внутрішньом’язовий, внутрішньовенний, внутрішньоо-

черевинний. Матеріал можна ввести в носові ходи, рот, шлунок, пряму кишку,

серце, мозок, піхву, яєчко, кон’юнктиву, порожнину суглобів. Спосіб зараження

залежить від типу матеріалу, ймовірних збудників чи їх токсинів і виду тварин.

Нашкірний спосіб – втирання матеріалу в депільовану (позбавлену шерсті)

або скарифіковану ділянку шкіри. Втирання проводять тупим кінцем скальпеля

обережно (краще під прикриттям скляної лійки). Тварину фіксують до повного

висихання матеріалу. Цей спосіб використовують рідко, здебільшого для виявлен-

ня збудників, що проникають через неушкоджену шкіру (палички чуми, туляремії,

лептоспіри).

Внутрішньошкірний спосіб часто використовують при введенні екзотоксинів

(стафілококовий, дифтерійний) для виявлення їх дермонекротичної дії, або при

постановці алергічних проб. Матеріал вводять в об’ємі 0,1-0,2 мл тонкою голкою,

користуючись туберкуліновим шприцом. Шкіру, позбавлену шерсті, протирають

спиртом, розтягують великим і вказівним пальцями, голку вводять під гострим

кутом зрізом доверху, матеріал треба вводити повільно. В місці ін’єкції утворюється

характерний пухирець, що нагадує лимонну кірку, але він досить швидко розс-

моктується (рис. 30).

Підшкірний спосіб використовується найчастіше. У місці введення після

депіляції шкіру обробляють спиртом, захоплюють і підіймають двома пальцями

лівої руки і в основу утвореної складки правою рукою вколюють голку шприца.

Пройшовши голкою кілька міліметрів, її відхиляють в один чи другий бік, прохо-

дять глибше і повільно вводять матеріал, що міститься в шприці (рис. 31). Це

робиться для того, щоб введений матеріал не витікав через прокол шкіри назовні.

Складку опускають, на голку кладуть вату, змочену спиртом або розчином йоду і

103

Розділ 6. Експериментальна інфекція

Рис. 30. Внутрішньошкірне зараження

гвінейської свинки.

Рис. 31. Підшкірне зараження гвінейської

свинки.

швидко виймають голку. Найбільш зручне місце для підшкірного введення матер-

іалу в мишей і щурів – на спині біля кореня хвоста, а в гвінейських свинок та

кроликів – у ділянці спини чи живота. Мишам вводять 0,5-1,0 мл матеріалу, щу-

рам і свинкам – 1,0-1,5 мл, кроликам – не більше 3,0 мл.

Внутрішньом’язове зараження проводять у ділянку тіла з найбільш розви-

неним м’язовим шаром. У кроликів, гвінейських свинок, щурів і мишей – це м’я-

зи верхньої третини задньої лапи, у курей і голубів – грудний м’яз. Ділянку шкіри

в місці ін’єкції обробляють так само, як і при підшкірному введенні. Потім вели-

ким і вказівним пальцями лівої руки захоплюють товсту м’язову складку і вводять

голку майже під прямим кутом в глибину м’язів (рис. 32).

Часто цим методом користуються для експериментального відтворення ана-

еробних клостридіальних інфекцій.

Внутрішньоочеревинне зараження. Спочатку вистригають шерсть на жи-

воті в нижній його третині, протирають спиртом або розчином йоду. Для поперед-

ження ушкоджень кишечника тварину тримають вниз головою. З цією ж метою

використовують короткі голки з притупленим кінцем. У кроликів і гвінейських

свинок роблять маленький надріз шкіри (2-3 мм) у нижній третині живота збоку

від середньої лінії. Під гострим кутом вводять голку між шкірою і м’язами, потім

переводять її в перпендикулярне положення до очеревини, буравлячим рухом про-

колюють її, відчуваючи ніби

“провал” у черевну порожни-

ну, і вводять досліджуваний

матеріал. На місце розрізу на-

кладають шов або хірургічну

скрепку. При зараженні ми-

шей і щурів шерсть не голять

і надріз не роблять (рис. 33).

Максимальні дози дослі-

джуваного матеріалу для вве-

дення білим мишам – 1 мл,

Рис. 32. Внутрішньом’язове зараження.

104

Частина І. Загальна мікробіологія

Рис. 34. Бокс для фіксації кроля. Рис. 35. Внутрішньовенне введення.

щурам – 3 мл, гвінейським свинкам – 5 мл і кроликам – 10 мл. Цей метод застосо-

вують для швидкого відтворення інфекційного процесу. Його не слід використо-

вувати, якщо досліджуваний матеріал містить багато сторонніх мікробів (грунт,

вміст кишечника тощо), щоб не викликати смертельний перитоніт.

Внутрішньовенний спосіб введення. У різних видів тварин при цьому кори-

стуються різними венами: кроликів заражають у крайову вену вуха, мишей і щурів

– у вену хвоста, гвінейських свинок – у вену стегна, попередньо надрізавши шкіру

та відсепарувавши її. Для внутрішньовенних ін’єкцій використовують голки з

довгим косим зрізом. Найлегше цей спосіб здійснюється на кроликах завдяки по-

верхневому розташуванню вушних вен. Перед введенням матеріалу тварину фіксу-

ють у спеціальному боксі (рис. 34) або обгортають рушником. Впродовж зовніш-

нього краю вуха вищипують шерсть, злегка вдаряють кінчиками пальців, або зма-

зують ксилолом, щоб вени краще набрякли, протирають 70° спиртом. Помічник

великим пальцем лівої руки натискає на вену біля основи вуха, щоб викликати ще

більший застій крові. Голку вколюють у вену в напрямку від периферії до центру,

тримаючи її майже паралельно до поверхні вуха (рис. 35).

Спочатку вводять невелику кількість матеріалу, щоб перевірити чи правиль-

но вставлена голка. Якщо вона дійсно знаходиться у вені, рідина вводиться легко.

Якщо ж при введенні невеликої кількості матеріалу виникає здуття навколо вени –

голка в неї не потрапила. Тоді її виймають і знову вводять у вену ближче до осно-

ви вуха. Після ін’єкції рідини вену нижче проколу злегка притискають, на місце

Рис. 33. Зараження миші в черевну порожнину: а – фіксація; б – введення.

105

Розділ 6. Експериментальна інфекція

уколу прикладають вату, змочену спиртом, голку виймають. Кровотеча припиняєть-

ся досить швидко.

При внутрішньовенному зараженні щурів і мишей користуються тонкими

короткими (туберкуліновими) голками з косим зрізом. Перед введенням матеріа-

лу хвіст тварини занурюють у теплу воду (50 °С), щоб викликати гіперемію. Корінь

хвоста затискають пальцями, голку

вколюють в одну з бокових вен у

нижній її третині, тримаючи шприц

майже паралельно осі хвоста. Голку

повертають зрізом наверх. Коли вона

введена у вену, перестають натиска-

ти на корінь хвоста і вводять матері-

ал. Цей спосіб дуже часто викорис-

товують при визначенні сили ток-

синів (рис. 36).

У курей і голубів зручно використовувати вени, які розташовані на внутрішній

поверхні крил. Після вищипування пір’я вони стають чітко видимі.

Ентеральне зараження. Найпростіше провести зараження через рот природ-

ним шляхом, добавляючи інфекційний матеріал до корму тварин. Але при цьому

досить важко точно визначити інфікуючу дозу. У зв’язку з цим частіше зараження

проводять примусово. Мишу чи щура тримають вертикально (рис. 37). Культуру

бактерій або інший заразний матеріал вводять за допомогою шприца, голка якого

має незначну кривизну й напаяну на кінці оливу. Рот відкривають пінцетом.

Кількість матеріалу, що вводять у шлунок мишей, становить 0,5-0,7 мл, для щурів –

2-3 мл.

Кроликам і гвінейським свинкам заразний матеріал вводять через рот спеці-

альним катетером або гумовою трубкою довжиною 7-8 см і шириною 0,3-0,5 см.

Перед введенням трубки в рот вставляють дерев’яну планку з отвором посереди-

ні. Через цей отвір обережно вводять у стравохід катетер, змазаний вазеліном.

Щоб полегшити його проходження по стравоходу в рот тварини піпеткою вливають

декілька крапель фізіологічного розчину хлориду натрію. Це викликає ковтальні

Рис. 36. Введення токсину миші.

Рис. 37. Ентеральне зараження миші (а) і кролика (б).

аб

106

Частина І. Загальна мікробіологія

рухи, під час яких трубка легко рухається по стравоходу й потрапляє до шлунка.

Зовнішній кінець катетера приєднують до шприца, наповненого певною дозою

заразного матеріалу. Його повільно вводять безпосередньо у шлунок в об’ємі

2,5-3,5 мл гвінейським свинкам і 3,5-5,0 мл кроликам.

Інтраназальне зараження. Існує декілька способів зараження тварин через

дихальні шляхи, при яких матеріал вводять або за допомогою інгаляції, або спеці-

альними зондами безпосередньо в трахею чи бронхи. Однак їх використовують

рідко. Найпростішим способом, який можна відтворити в будь-якій баклабора-

торії, є закапування заразного матеріалу або культури бактерій в носові ходи тва-

рин під легким ефірним наркозом. За допомогою шприца матеріал вводять крап-

лями в носові ходи мишей на глибину 1,0-1,5 мм, білих щурів – 2-3 мм, кроликів і

гвінейських свинок – 3,5-4,0 мм. Щоб не пошкодити слизову оболонку, викорис-

товують абсолютно тупі голки. За допомогою цього методу можна заражати ми-

шей збудником кашлюку, міксовірусами, гвінейських свинок – рикетсіями та ін.

Максимальний об’єм матеріалу, що вводиться, становить для мишей 0,03-0,05 мл,

для щурів – 0,05-0,1 мл, для кроликів і гвінейських свинок – до 2 мл.

Інтрацеребральне зараження. Кроликам і гвінейським свинкам роблять

трепанацію черепа й заразний матеріал вводять через трепанаційний отвір безпо-

середньо в мозок або під тверду мозкову оболонку (субдурально). Шкіру в місці

трепанації вистригають від шерсті, протирають спиртовим розчином йоду. Потім

її зміщують вбік і роблять розріз довжиною 1-3 см, паралельно осі черепа трохи

вище задньої орбітальної лінії. Спеціальним інструментом – трепаном – роблять

у кістці круглий отвір, через який вставляють голку і легким повільним натиском

на поршень шприца вводять 2-3 краплі матеріалу. Отвір у кістці закривають,

змістивши на місце шкіру, на яку накладають шви.

Зараження щурів і мишей проводять без трепанації за допомогою туберкулі-

нового шприца з тонкою, тупо обрізаною голкою. На останню надівають метале-

ву муфточку, яка обмежує проникнення голки в мозок лише на глибину 1,5-2 мм.

Мишу тримають лівою рукою так, щоб великий і вказівний пальці відтягували

шкіру голови в напрямку до шиї, а між мізинцем і безім’яним пальцями утриму-

вався хвіст. У місці проколу шкіру обробляють спиртовим розчином йоду, потім

повільно вводять матеріал щоб не викликати раптово підвищення внутрішньоче-

репного тиску. Цей спосіб на мишах-сисунках використовують для діагностики

вірусних енцефалітів, геморагічних гарячок, коксакі-інфекції та ін.

При визначенні результатів дослідів тварин, які загинули протягом першої

доби, не враховують, оскільки їх загибель виникла від травматичних ушкоджень.

Зараження в передню камеру ока. При цьому способі матеріал вводять на

кон’юнктиву або в передню камеру ока. Найкраще цю операцію виконати на кро-

ликах. Попередньо в кон’юнктивний мішок закапують 2 % розчин новокаїну. Тва-

рину фіксують спиною доверху. Через 1-2 хв тонким очним пінцетом захоплюють

складку кон’юнктиви зовні від поверхневого краю рогівки. Потім вводять тонку

голку в рогівку біля її краю (лімба) і просувають у центральному напрямку до тих

пір, поки в просвіті голки не появиться рідина з передньої камери ока. Після вито-

107

Розділ 6. Експериментальна інфекція

ку 2-3 крапель рідини на голку насаджують шприц і вводять інфікуючий матеріал

в об’ємі не більше 0,05 мл. Голку швидко виймають, маленька ранка сама закри-

вається. Око промивають стерильною водою або 3 % розчином борної кислоти.

З діагностичною метою часто ставлять так звану кератокон’юнктивну пробу

на гвінейських свинках. З цією метою у кон’юнктивний мішок вводять петлю ага-

рової культури (або краплю бульйонної), не травмуючи рогівку. Одні бактерії (ши-

гели) викликають кератит, інші (сальмонели) – кон’юнктивіт. Поява виразки на

рогівці або її помутніння виникають на 2-5 добу. Пробу використовують для ви-

значення належності культури до роду шигел. Такий спосіб на кролях використо-

вують для відтворення герпетичної інфекції.

Утримання заражених тварин. Після зараження лабораторні тварини на-

зиваються “піддослідними”. Їх утримують в ізольованому приміщенні (віварії),

окремо від розплідника, де розміщені здорові тварини. Приміщення для піддос-

лідних тварин повинно бути теплим (10-15 °С) і сухим. Слід пам’ятати, що кроли-

ки чутливі до вогкості, білі миші – до холоду, а гвінейські свинки і до вогкості, і до

холоду. Дрібних тварин після зараження вміщують у високі скляні банки, які закри-

вають металевими сітками, а кроликів і свинок – у клітках. Банки і клітки повинні

мати етикетки з позначенням дати зараження або номер експерименту, під яким

він записаний в лабораторному журналі. Тварини повинні регулярно отримувати

корм із достатнім вмістом вітамінів, воду або молоко. При спостереженні за ними

відмічають в’ялість, відсутність апетиту, понос, які є ранніми симптомами захво-

рювання. При огляді тварин змушують рухатись, щоб непропустити паралічі. Що-

денне спостереження дає змогу своєчасно відібрати захворілих тварин для розти-

ну і подальших досліджень.

Мікробіологічне дослідження трупа

Розтин і мікробіологічне дослідження загиблих тварин має велике, часом

вирішальне діагностичне значення. Воно проводиться з метою виявлення і визна-

чення локалізації збудника інфекційного захворювання. Трупний матеріал дослі-

джують за допомогою бактеріоскопічних (вірусоскопічних) і бактеріологічних

методів. Досліджуваний матеріал беруть під час розтину трупа, яке проводять,

дотримуючись встановлених правил.

Розтин трупа та його мікробіологічне дослідження потрібно робити якомога

скоріше після смерті. До цього його необхідно зберігати на холоді, оскільки мікро-

флора кишечника при низькій температурі повільніше проникає в кров, тканини й

паренхіматозні органи. Розтин трупа та забір матеріалу необхідно проводити в

умовах, які виключають його забруднення сторонніми мікроорганізмами. Взятий

матеріал до посіву не повинен контактувати з дезінфікуючими речовинами, а після

посіву – знезаражуватись. Результати досліджень обов’язково протоколюються.

Під час розтину трупа та дослідження його матеріалів необхідно абсолютно попе-

редити всіляку можливість інфікування як самих працюючих, так і інших осіб, а

також контамінації оточуючого середовища.

108

Частина І. Загальна мікробіологія

Тварин, що загинули від експериментальної інфекції, також досліджують з

дотриманням правил асептики. При цьому використовують лише стерильні

інструменти. Їх переносять із стерилізатора в склянку зі спиртом і ватою на дні,

перед кожним використанням обпалюють на вогні.

Загиблу тварину захоплюють пінцетом, кладуть спиною донизу на дерев’яну

дощечку, вміщену в металеву клювету з дезрозчином. До дощечки її прикріплюють

булавками або гострими гвіздочками за чотири лапки, широко розтягуючи її. Шкіру

в місці розтину змочують дезінфікуючим розчином, щоб не розліталась шерсть,

яка містить автохтонну мікрофлору. Трупи тварин, які загинули від чуми та інших

особливо небезпечних інфекцій, перед розтином занурюють у керосин для інак-

тивації комах – перенощиків хвороби. Перед першим розрізом шкіру ретельно

протирають дезрозчином, спиртом або обпалюють полум’ям газового пальника.

Розтин і дослідження трупа тварини проводять у певній послідовності: спочат-

ку розрізають і досліджують зовнішні покриви, потім грудну й черевну порожнини.

Розтин зовнішніх покривів починають з розрізу шкіри від нижньої щелепи

до лобка, потім роблять бокові надрізи в напрямку до лапок. Шкіру відсепарову-

ють і відкидають в обидва боки, відкриваючи всю передню поверхню тіла (рис. 38).

В підшкірній клітковині відмічають такі зміни як гіперемію судин, крововиливи,

набряки, стан лімфатичних вузлів. При їх збільшенні або нагноєнні роблять по-

сіви на живильні середовища та мазки-відбитки, притискаючи поверхню розрізу

вузла до предметного скла.

Перед розтином грудної порожнини її

відкриту від шкіри поверхню змочують

спиртом і запалюють. Пінцетом захоплю-

ють мечоподібний відросток, роблять по-

перечний надріз під ним, вставляють но-

жиці і проводять два бокові розрізи в місцях

сполучення ребер із грудною кісткою. Утво-

рений лоскут відкривають доверху й огля-

дають легені та серце, відмічають наявність

ексудату. Обов’язково роблять посів крові

з серця. Для цього розжареним скальпелем

припікають стінку шлуночка або перед-

сердь і в даній ділянці роблять прокол пас-

терівською піпеткою з тонко відтягнутим у

полум’ї пальника кінцем. Кров, що потра-

пила в капіляр, сіють в цукровий бульйон і

на агар, а із залишку роблять мазки. При по-

требі проводять також посіви та роблять

мазки-відбитки з легень, плеври та ексудату.

Розтин і дослідження черевної порож-

нини проводять дуже обережно, щоб не по-

шкодити кишечник. Черевну стінку захоп-

Рис. 38. Послідовні етапи розтину

білої миші.

109

Розділ 6. Експериментальна інфекція

люють і трохи підіймають вверх, ножицями розрізають її від діафрагми до лобка

і по два бокових надрізи в напрямку до лапок. Утворені лоскути відвертають в

обидва боки. Оглядають внутрішні органи, відмічаючи в протоколі величину, колір

і консистенцію печінки, селезінки, нирок, надниркових залоз, лімфатичних вузлів

брижі та наявність ексудату.

В разі потреби роблять посіви тканин вказаних органів та ексудату. Для цьо-

го припікають поверхню органа розжареним скальпелем і в цій ділянці проводять

розріз. Бактеріологічною петлею з поверхні розрізу роблять зскрібок паренхіми і

сіють на живильні середовища. Для виготовлення мазків-відбитків вирізають

шматочок органа й поверхнею розрізу притискають до предметного скла, або роз-

мазують по ньому тонким шаром.

Трупи тварин і залишки органів після бактеріологічного дослідження спа-

люють або стерилізують. Якщо тварини загинули від особливо небезпечних

інфекцій, їх розтини й посіви проводять у спеціальних режимних лабораторіях із

дотриманням особливо пильних заходів безпеки.

Вирощування посівів, виділення чистих культур та визначення видів збуд-

ників проводять за загально прийнятими методами.

Визначення вірулентності мікроорганізмів,

смертельної дії екзотоксинів та ендотоксинів

Майже в усіх бактеріологічних лабораторіях в дослідах на тваринах часто

визначають патогенні й вірулентні властивості збудників інфекційних захворю-

вань. Патогенність – це потенційна здатність певного виду мікроорганізмів вик-

ликати інфекційний процес. Вона не є абсолютною і стабільною. Ступінь або міру

патогенності визначають вірулентністю. Для її кількісного визначення запропо-

новані три умовні одиниці вірулентності.

1. Dosis letalis minima (DLM) – мінімальна смертельна доза, тобто найменша

кількість живих мікроорганізмів або найменша доза токсину, яка здатна виклика-

ти загибель 95 % тварин стандартної маси і віку через певний проміжок часу. Ця

величина відносна й залежить від виду тварин. DLM для мишей, щурів, гвінейсь-

ких свинок і кроликів буде різною.

2. Dosis certa letalis (DCL) – безумовно смертельна доза, яка викликає заги-

бель 100 % взятих у дослід тварин; вона також є відносною.

3. Dosis letalis

(DL

) – кількість мікроорганізмів (або токсину), яка викли-

кає загибель 50 % взятих у дослід тварин. Остання величина є статистично

найбільш достовірною летальною дозою. Вона визначається на основі обробки

конкретних результатів загибелі тварин за методом Ріда і Менча, у якому реалізу-

ються кумулятивні принципи обліку результатів.

Інколи визначають і мінімальну інфікуючу дозу (ІД

), тобто найменшу

кількість мікробів, яка викликає захворювання у 50 % заражених тварин.

Титрування мінімальних смертельних доз, як правило, проводять на білих

мишах як найбільш доступних і дешевих тваринах (рідко на гвінейських свинках

110

Частина І. Загальна мікробіологія

З них Розведення

зависі мікробів

Кількість

заражених тварин

загинуло вижило

% тварин,

що загинули

-4

6 6 0 100

-5

6 4 2 66,7

-6

6 2 4 33,3

-7

6 0 6 0

і кроликах). Мікроби (токсини) вводять внутрішньоочеревинно або внутрішньо-

венно. Щоб отримати стабільні результати використовують тварин стандартної

маси і віку. Мишей відбирають масою 16-18 г, гвінейських свинок – 200-250 г,

кроликів – 1500 г.

Завись бактерій для зараження готують із молодих агарових культур після

18-20 год їх вирощування в термостаті. Для цього в пробірку з культурою на ско-

шеному агарі вносять 5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію й ретельно стру-

шують. Частину густого змиву переносять в іншу пробірку такого ж діаметру як і

пробірка зі стандартом мутності. Завись розводять 0,85 % розчином хлориду на-

трію до мутності, яка відповідає вибраному стандартові.

Централізованим шляхом готують такі еталонні стандарти мутності: № 5 –

на п’ять одиниць мутності, що відповідає 500 млн мікробів у 1 мл; № 9 – 900 млн

мікробів у 1 мл; № 10 – 1 млрд мікробів у 1 мл; № 11 – 1,1 млрд мікробів у 1 мл.

Виготовляють також стандарти мутності для коклюшних бактерій на 9, 10 і 11 млрд

мікробів у 1 мл.

При визначенні вірулентності мікроорганізмів, як правило, виготовляють

вихідну завись, в якій знаходиться 1 млрд бактерій в 1 мл. Тоді для введення миші

100 млн мікробів беруть 0,1 мл зависі, для введення 200 млн – 0,2 мл і т.д. Стан-

дартизовані зависі готують так, щоб бажані дози бактерій містились в однакових

об’ємах, а загальної кількості їх повинно вистачити на всю групу тварин (наприк-

лад, по 0,2 мл на 4-6 тварин).

Через 24-48 год після зараження відмічають кількість тварин, що загинули в

кожній групі і вираховують DL

за методом Ріда і Менча.

Наприклад, із наведених в таблиці даних видно, що DL

знаходиться між

розведеннями зависі мікробів 10

-5

і 10

-6

. Для точного підрахунку DL

визначають

величину х, яку додають до логарифму того розведення, яке менше 50 % дози (у

наведеному прикладі 5) за формулою:

50A

−

де А – % тварин, які загинули від розведення менше 50 % (у даному випадку

66,7 %); В – % тварин, що загинули від розведення більше 50 % дози (за даними

таблиці – 33,3 %). Підставивши у формулу отримані числові значення, одержимо

5,0

3,337,66

507,66

X =

−

Таблиця 11

Обчислення DL

за методом Ріда і Менча