Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Виділення чистої культури анаеробних бактерій

У лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікро-

організмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, часті-

ше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають припинення доступу

кисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними склад-

ніша, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів.

Важливим є захист матеріалу, що містить анаеробні збудники від токсичного

впливу атмосферного кисню. Тому матеріал із вогнищ гнійної інфекції рекоменду-

ється забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час між взяттям матеріалу

та посівом його на живильне середовище повинен бути максимально коротким.

Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні

живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький окисно-

відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори – резазурин,

метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зрос-

танні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазурин за-

барвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій – в голубий. Такі зміни

свідчать про неможливість використання середовищ для культивування анаероб-

них мікробів.

Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в середовище не

менше 0,05 % агару, який, збільшуючи його в’язкість, сприяє зменшенню надхо-

дження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням свіжих (не

пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних середовищ.

Слід врахувати, що через особливості бродильного типу метаболізму анае-

робних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти і вітаміни

середовищ. Найчастіше використовують серцево-мозковий й печінковий настої,

соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, триптон.

Обов’язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадіон, цільна

або гемолізована кров.

Методи створення анаеробних умов. Враховуючи, що вільний молекуляр-

ний кисень є токсичним для облігатно-анаеробних бактерій, обов’язковою умо-

вою культивування таких мікроорганізмів є обмеження його доступу. Існує ряд

методів (механічних, фізичних, біологічних), які дозволяють це забезпечити.

Фізичні методи. 1. Перед посівом бактерій на живильне середовище його

обов’язково регенерують для видалення надлишку розчиненого кисню. З цією

метою середовище кип’ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, а потім швидко

охолоджують до необхідної температури.

2. Для попередження проникненя кисню в середовище його заливають ша-

ром стерильної вазелінової олії або парафіном.

3. Стовпчик живильного середовища у пробірках повинен бути достатньо

високим (10-12 см). Кисень, як правило, дифундує в товщу стовпчика на глибину

до 2 см, тому нижче створюються сприятливі умови для культивування анаероб-

них мікробів.

Частина І. Загальна мікробіологія

4. Евакуаційно-замісний метод полягає у використанні анаеростатів. Вони

представляють собою герметичні металеві або пластмасові банки, з яких можна

викачати кисень і замінити його інертним газом (гелій, азот, аргон). Допускається

використання трикомпонентної газової суміші, яка складається з 80 % азоту, 10 %

диоксиду вуглецю та 10 % водню. Деколи допустимим вважається використання

природного газу. Для поглинання кисню, який залишається в анаеростаті, викори-

стовують паладієві каталізатори. З метою поглинання водяної пари використову-

ють хлорид кальцію, силікагель тощо, які поміщають на дно анаеростата.

Хімічні методи. 1. Використання речовин, здатних поглинати кисень. З цією

метою допустимим є застосування лужного розчину пірогалолу. При цьому вра-

ховують поглинаючу активність речовини: на 100 мл ємності герметичної посуди-

ни, в якій знаходяться чашки Петрі, використовують 1 г пірогалолу і 10 мл 2,5 N

розчину гідроксиду натрію.

Киснезв’язуючий ефект має також гідросульфіт натрію (Na

). Для зв’язу-

вання кисню в 1 л повітря використовують суміш, яка складається з 100 мл свіжо-

го 20 % розчину Na

і 16 мл 50 % гідроксиду калію.

2. Застосування речовин-редуцентів. Враховуючи, що ріст облігатно-анаероб-

них бактерій відбувається в середовищах з низьким рівнем окисно-відновного

потенціалу, до них додаються спеціальні відновлювачі: цистеїн (0,03-0,0,5 %), тіо-

гліколеву кислоту або тіогліколат натрію (0,01-0,02 %), сульфід натрію, аскорбі-

нову кислоту (0,1 %), різноманітні цукри.

Функції відновлювачів можуть виконувати шматочки паренхіматозних органів

тварин (печінка, нирки, серце) або навіть рослин (картопля, інші коренеплоди).

Ступінь поглинання кисню або ступінь відновлення середовища вимірюють

або електрометрично або за допомогою індикаторів (резазурин, нейтральний чер-

воний, феносафранін).

3. Використання спеціальних газогенеруючих систем, які дозволяють ство-

рити безкисневі умови в мікроанаеростатах, транспортних пластикових пакетах

тощо. Однією з найпоширеніших є система “Gas Generating Box”. До її складу

входять хімічні генератори водню (борогідрит натрію) та вуглекислого газу (таб-

летки бікарбонату натрію та лимонної кислоти), а також паладієвий каталізатор,

який поглинає кисень.

Чашки з посівами поміщаються в мікроанаеростат, на дні якого знаходиться

шар паладієвого каталізатору. Кінчик пакета “Gas Generating Box” надрізають но-

жицями, і в нього наливають 10-15 мл води. Пакет розташовують у мікроанаеро-

статі. Через 15-20 хв у ньому створюються анаеробні умови. Водень, який виді-

ляється, взаємодіє з киснем, утворюючи воду, а вуглекислота продукується при

взаємодії бікарбонату натрію з лимонною кислотою.

Біологічні методи. 1. Метод Фортнера. Метод полягає в спільному культи-

вування на одному середовищі аеробних і анаеробних мікроорганізмів. Спочатку

по діаметру чашки вирізають полоску агару шириною до 0,5-1,0 см. З одного боку

засівають досліджуваний метралі, що містить анаеробні збудники, а з іншого –

мікроби, що є індикатором анаеробних умов (Serratia marcescens або “чудесна па-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

личка”). Краї чашки парафінують або закривають пластиліном. За деякий час на

поверхні середовища виростають колонії як аеробних, так і анаеробних мікробів.

При поглинанні кисню Serratia marcescens дає ріст блідо-рожевих або безбарвних

колоній, а при порушеннях герметичності – яскраво-червоні. На іншій половині

чашки виростають колонії анаеробних мікробів.

2. Метод Хеннеля (“годинникових скелець”). Він є своєрідною модифікацією

попереднього. Матеріал, що містить анаеробні збудники, засівається на поверхню

живильного середовища діаметром 2-2,5 см. Зверху він покривається “годиннико-

вим склом”, заповненим шаром МПА і засіяним Serratia marcescens. Аеробні мікро-

би, поглинаючи кисень, створюють умови для сприятливого росту анаеробних

збудників.

У високо спеціалізованих лабораторіях користуються спеціальною анаероб-

ною технікою, яка включає використання живильних середовищ без кисню із

відновлювачами, виконання посівів і пересівів в атмосфері інертних газів, вугле-

кислоти тощо.

За останні роки створено стаціонарні анаеробні бокси, які містять все необх-

ідне для створення анаеробних умов культивування, включаючи термостати. Як

правило, такі камери заповнюються трикомпонентною газовою сумішшю. Бакте-

ріолог працює в камері, перебуваючи зовні, застосовуючи гумові рукавиці, вмон-

товані в неї. Таке устаткування має незаперечні переваги, які полягають у тому,

що повністю виключається контакт кисню з досліджуваним матеріалом.

Виділення та ідентифікація анаеробних мікроорганізмів

Враховуючи сучасний розвиток мікробіологічної науки, виділяти та іденти-

фікувати культури анаеробних мікроорганізмів можна аналогічно аеробним бак-

теріям. Обов’язковим при цьому є дотримання на всіх етапах дослідження умов

анаеробіозу, використовуючи для цього трикомпонентну газову суміш (у певному

співвідношенні азот, водень та вуглекислий газ) чи систему “Gas Generating Box”.

Однак збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції можна виді-

ляти та ідентифікувати за іншою схемою.

На першому етапі (І день дослідження) вивчають макроскопічні особливості

клінічного матеріалу, роблять мазок і забарвлюють його за методом Грама. Після

цього матеріал засівають на середовище Кітта-Тароцці та молоко. Попередньо

середовище регенерують на киплячій водяній бані протягом 10-20 хв і охолоджу-

ють. Безпосередньо після посіву матеріалу середовище нагрівають на водяній бані

при 80°С протягом 20 хв для знищення вегетативних неспорових форм мікробів.

Середовища ставлять у термостат і при температурі 37 °С культивують 1-3 доби.

На другому етапі вивчають прояви росту мікроорганізмів (помутніння,

утворення осаду та газу на середовищі Кітта-Тароцці, пептонізація молока). Оскіль-

ки середовище Кітта-Тароцці зверху залите шаром вазелінової олії для запобіган-

ня доступу кисню, в нього занурюють пастерівську піпетку, набирають рідину, з

якої готують мазок, фарбуючи його за методом Грама. Під мікроскопом у мазку

можна бачити великі грампозитивні паличкоподібні бактерії. Після цього прово-

Частина І. Загальна мікробіологія

дять посів матеріалу за методами Вейнберга або Цейсс-

лера для одержання ізольованих колоній.

За методом Вейнберга готують декілька вузьких

високих пробірок (3-4) з розтопленим і охолодженим до

42-45 °С цукровим м’ясо-пептонним агаром. Можливе

використання середовища Вільсон-Блера. Матеріал із

середовища Кітта-Тароцці вносять у першу пробірку за

допомогою пастерівської піпетки й ретельно перемішу-

ють, потім переносять у другу, а далі – в третю. Для за-

стигання агару їх швидко охолоджують під струменем

холодної водопровідної води. За рахунок цього живі

мікробні клітини фіксуються в певних ділянка агару.

Після застигання агару пробірки культивують при опти-

мальній температурі протягом 1-2 діб для утворення ізо-

льованих колоній (рис. 23).

Вміст кожної пробірки можна, крім того, всмокта-

ти у пастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона, стежачи, щоб не було буль-

башок повітря. Останні мають довжину біля 30 см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній

кінець їх, який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді

капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у

термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаероб-

них бактерій. Для того щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на пев-

ному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею або голкою, пере-

носять у відповідне середовище.

Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера матеріал із сере-

довища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі пастерівською

піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров’яним агаром і роблять посів шпателем за

методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають другу чашку, а потім

і третю. Чашки перевертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, в

якому створюють анаеробні умови, а потім – у термостат при температурі 37 °С на

2-3 доби. На останній чашці виростають ізольовані колонії.

Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливо-

стей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджу-

ються їх форма, величина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо.

З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсіва-

ють у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубу-

ють певний час при оптимальній температурі.

На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури

збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять іден-

тифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів

подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, біохімічними та

біологічними ознаками. Обов’язково використовують визначення токсигенних вла-

стивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лаборатор-

Рис. 23. Ізольовані

за методом Вейнберга

колонії анаеробів.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

них тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроор-

ганізмів.

Таким чином, на підставі вивчення різноманітних властивостей мікроор-

ганізмів робиться висновок про належність їх до того чи іншого виду.

Середовища для культивування анаеробних мікроорганізмів

Середовище Кітта-Тароцці готують на основі бульйону Хоттінгера, до яко-

го додають шматочки бичачої печінки або мяса. Стерилізують його при 1 атмос-

фері протягом 30 хв. Активна реакція середовища – 7,4-7,6. Після посіву матеріа-

лу середовище заливають зверху шаром вазелінової олії товщиною до 1 см.

Анаеробний кров’яний агар готують на основі еритрит-агару. До його складу

входять також спеціальні добавки: середовище 199 (10 %), гемін (10 мкг/мл), твін-

80 (0,1 %), метадіон (10 мкг/мл), цитратна кров (до 5 %) тощо. Після стерилізації

його розливають у чашки Петрі. Використовують не пізніше, як через 2 год після

виготовлення.

Жовтковий агар. У розтоплене і охолоджене до 56-60 °С середовище на ос-

нові еритрит-агару додають суспензію курячого жовтка (20 %), глюкозу (0,2 %),

гемін (10 мкг/мл) і розливають у чашки Петрі. Середовище використовують для

визначення лецитиназної активності збудників, зокрема C. perfringens. При наяв-

ності лецитинази навколо колоній утворюються зони помутніння.

Комерційне середовище для контролю стерильності. Його можна

використовувати як транспортне. Для поліпшення росту анаеробних бактерій до

його складу можна вводити спеціальні добавки, такі як середовище 199, гемін,

твін-80, метадіон, цитратна кров тощо.

Середовище Вільсон-Блера. Його готують на основі розтопленого й охо-

лодженого до 60 °С 1 % цукрового (глюкоза) МПА рН 7,4 з додаванням на 100 мл

10 мл стерильного 20 % розчину сульфіту натрію і 1 мл 8 % розчину хлориду

заліза. Го т о ве середовище не стерилізують.

Його використовують для прискореної діагностики газової анаеробної

інфекції, викликаної Clostridium рerfringens. Вже через 1-2 год спостерігають зміну

середовища: воно чорніє внаслідок відновлення сульфіту натрію в сульфат, який

взаємодіє з хлоридом заліза, утворюючи сульфід заліза. З’являються також розри-

ви агару внаслідок інтенсивного газоутворення.

Лакмусове молоко. Готують середовище із свіжого молока. Попередньо його

кип’ятять і залишають у прохолодному місці на одну добу. Знімають верхній шар

жиру і процедуру повторюють. Молоко фільтрують, і 10 % розчином бікарбонату

натрію доводять рН до 7,2. Перед стерилізацією до молока додають 5-10 % лакму-

сової настойки та ідентичну кількість 10 % розчину бікарбонату натрію, щоб піна

молока набула синьо-фіолетового відтінку. При підлужуванні молока воно стає

синьо-фіолетовим, при підкислюванні – рожевим аж до червоного.

Ідентифікація мікроорганізмів за допомогою бактеріофагів

Бактеріофаги мають виражену літичну дію на мікроорганізми. Цю особливість

використовують для визначення їх виду. З цією метою у дві пробірки з м’ясо-

Частина І. Загальна мікробіологія

пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з

них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки інкубують при опти-

мальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність бульйону в конт-

рольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість мікроорганізмів

до літичної дії бактеріофагів.

Можна з цією метою використати щільне живильне середовище, на яке газо-

ном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них

бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповід-

ного розведення бактеріофагу, яке вказане на ампулі. Посіви інкубують в термо-

статі при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям,

які свідчать про літичну дію бактеріофагу. Позитивний результат свідчить про

належність бактерій до певного виду.

Фаготипування мікроорганізмів проводять з метою аналізу епідеміологіч-

ної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при

діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій.

В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для

цього дно чашки з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на

квадрати. Вирощують чотиригодинну бульйонну культуру досліджуваного штаму

і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по

поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті

при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню агару в кожний квадрат капають піпет-

кою бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або зали-

шають при кімнатній температурі протягом 18-20 год, після чого оцінюють ре-

зультати. Облік результатів проводять на темному фоні за допомогою лупи. За-

лежно від ступеня чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені

лізису бактерій, який оцінюється за чотириплюсовою системою: від лізису, який

зливається до його відсутності.

Враховуючи, що чутливість бактерій до фагу є достатньо постійною озна-

кою, порівнюють фаготиии досліджуваних культур з фаготипом мікробів, який

було виділено від вірогідного джерела інфекції. При їх збігу роблять висновок

про виявлене джерело інфекції.

Визначення бактеріоциногенності мікроорганізмів

Бактеріоцини є речовинами антибіотичної природи, які продукуються різни-

ми бактеріями. Вони мають досить вузький спектр протимікробної дії, спрямова-

ний проти філогенетично близьких збудників. Цей тест використовують з епідемі-

ологічною метою для виявлення джерела інфекції, а також для ідентифікації пев-

них груп бактерій.

Для визначення бактеріоциноварів на поверхню агару в чашці Петрі у виг-

ляді смужки по діаметру засівають бактеріологічною петлею культуру збудника.

Чашку інкубують у термостаті при оптимальній температурі протягом 24-48 год,

потім мікроорганізми вбивають за допомогою УФВ або парів хлороформу. Куль-

туру обережно знімають з поверхні агару за допомогою шліфувального скла, і до

Розділ 4. Фізіологія бактерій

неї перпендикулярно штрихами бактеріологічною петлею підсівають 4-годинні

бульйонні культури індикаторних штамів. Після 18-24-годинної інкубації при опти-

мальній температурі оцінюють чутливість індикаторних штамів до бактеріоцинів

за величиною зон затримки росту. Такий підхід дозволяє визначити бактеріо-

цинотип досліджуваних мікроорганізмів.

Для визначення чутливості досліджуваного штаму до певних бактеріоцинів

у щільне живильне середовище уколом засівають індикаторні бактерії, які проду-

кують певні типи бактеріоцинів. Після інкубування в термостаті мікроби, які ви-

росли, інактивують за допомогою парів хлороформу або ультрафіолетового опро-

мінення. Потім на поверхню чашки заливають розтоплений і охолоджений до 45°С

МПА, змішаний з 0,2 мл 4-годинної бульйонної культури досліджуваного штаму.

Після того, як агар застигне, чашку знову поміщають у термостат і інкубують при

оптимальній температурі протягом доби. За діаметрами зон затримки росту куль-

тури оцінюють чутливість її до бактеріоцинів.

Молекулярно-генетичні методи

Для виявлення та ідентифікації бактерій, вірусів, грибів і найпростіших

останнім часом почали широко використовувати молекулярно-генетичні методи.

Реакція гібридизації ДНК і РНК (реакція генних зондів). Послідовність нук-

леотидів ДНК і РНК є унікальною для геномів всіх мікроорганізмів. Будь-яку ділян-

ку нуклеїнової кислоти можна визначити за допомогою комплементарної копії

ДНК чи РНК, міченої ферментом або радіоактивною міткою (ДНК- і РНК-зонди).

Такі зонди отримані для більшості патогенних бактерій і вірусів. За їх допомогою

проводять ідентифікацію ДНК або РНК збудників бактеріальних і вірусних

інфекцій у клінічному матеріалі. Реакція молекулярної гібридизації є дуже чутли-

вою і високоспецифічною. Вона дає змогу виявляти ДНК або РНК в дуже малих

кількостях (1-10 пг).

Методика реакції генних зондів зводиться до того, що виділені з патологіч-

ного матеріалу ДНК або РНК збудників денатурують і наносять на спеціальні мем-

брани з нітроцелюлози. Після чого вносять ДНК- або РНК-зонди, витримують

певний час, роблять багаторазову промивку, щоб видалити реагенти, що не проре-

агували. Якщо використовували зонди з радіоактивною міткою, результат визначають

за допомогою γ-лічильника. У випадку, коли зонд мічений ферментом (наприк-

лад, пероксидазою), то до такого зонда додають субстрат (наприклад, ортофеніл-

діамін). Ферментація субстрату призводить до зміни кольору, який можна спосте-

рігати неозброєним оком.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – один із найновіших методів вияв-

лення та ідентифікації бактерій і вірусів у досліджуваних матеріалах. Принцип

реакції базується на багаточисленному копіюванні (селективній ампліфікації) до-

сліджуваної ДНК ферментом ДНК-полімеразою. Утворені копії ДНК ідентифіку-

ють за допомогою методу електрофорезу.

Реакцію проводять в три етапи. На першому етапі при температурі 95 °С про-

ходить денатурація двониткової молекули ДНК, її розплетення і розходження ниток.

Частина І. Загальна мікробіологія

На другому етапі (ренатурація) відбувається гібридизація праймерів, тобто

утворення дволанцюгових комплексів праймер-матриці, які необхідні для ініцію-

вання синтезу ДНК. Температура суміші при цьому знижується до 55 °С.

На етапі синтезу (75 °С) проходить подовження комплементарних ниток ДНК

за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Проводять 15-35 циклів синтезу.

Багаторазове повторення приводить до збагачення ДНК у досліджуваному

матеріалі.

Метод ПЛР дуже чутливий. Його використовують для виявлення будь-якого

інфекційного агента, якщо відома нуклеотидна послідовність гена (або його фрагмен-

та), специфічного виключно до даного збудника. Доцільно використовувати ПЛР у

тих випадках, коли бактерії чи віруси мають високу мінливість і знаходяться у до-

сліджуваному матеріалі в малій кількості (навіть одна молекула геномної ДНК).

Зараз ПЛР належить до високоефективного молекулярно-генетичного методу,

який доступний багатьом лабораторіям. Тривалість дослідження становить 2-3

години. Особливо доцільно використовувати його при визначенні та ідентифікації

збудників туберкульозу, сифілісу, гонореї, мікоплази, вірусів СНІДу, герпесів, ге-

патитів, рота- та ентеровірусів.

Розділ 5

ЕКОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Живий мікросвіт людини і нашого довкілля зазнав великих змін. Продов-

жується інтенсивна мікробна корозія землі, колонізація різних об’єктів зовнішнь-

ого середовища й харчових продуктів зміненими бактеріями, грибами, вірусами.

З року в рік зростають носійство патогенних бактерій серед медичного персоналу

та різноманітні дисбактеріози відносно здорових і хворих людей. Все частіше

виникають шпитальні інфекції, спричинені патогенними й умовно-патогенними

мікроорганізмами. Все це вимагає розробки нових і вдосконалення існуючих ме-

тодів лабораторного дослідження мікрофлори води, повітря, грунту, інших об’єктів

оточуючого середовища, харчових продуктів. Важливого значення набуває визна-

чення дисбактеріозів людини, носійства золотистих стафілококів, менінгококів,

збудників дифтерії, холери, черевного тифу, дизентерії. Лікар будь-якого профілю

повинен знати, як правильно взяти досліджуваний матеріал, доставити його до

профільної лабораторії, провести мікробіологічне дослідження, правильно оці-

нювати його результати.

Мікробіологічне дослідження води

Мета проведення санітарно-мікробіологічного дослідження води може бути

різною:

1. Вибір джерела водопостачання.

Розділ 5. Екологія мікроорганізмів

2. Контроль знезараження питної води центрального водопостачання.

3. Визначення придатності для вживання криничної й джерельної води.

4. Перевірка якості і ступеня очищення стічних вод.

5. Розслідування водних спалахів інфекційних хвороб.

6. Контроль знезараження води плавальних басейнів.

7. Спостереження за санітарно-епідеміологічним станом відкритих водоймищ.

Санітарно-мікробіологічне дослідження води, перш за все, повинно вирішу-

вати питання про наявність або відсутнісфть у ній патогенних бактерій, вірусів і

грибів. Але їх безпосереднє виявлення має ряд методичних труднощів. У зв’язку з

цим широкого розповсюдження набули методи непрямої оцінки її епідеміологіч-

ного благополуччя шляхом виявлення так званих санітарно-показових мікроор-

ганізмів і визначення загального мікробного числа (ЗМЧ).

Основним джерелом збудників заразних хвороб є люди й теплокровні твари-

ни, які виділяють їх в оточуюче середовище фекальним або повітряно-краплин-

ним шляхом разом з численними представниками нормальної мікрофлори кишеч-

ника й верхніх дихальних шляхів. Тому санітарно-показові мікроорганізми для

різних об’єктів довкілля відібрані саме з представників нормальної мікрофлори.

Для води такими санітарно-показовими мікроорганізмами в усіх лабораторіях світу

прийняті бактерії групи кишкової палички (БГКП).

До категорії БГКП належать бактерії родини Enterobacteriaceaе, що об’єднує

роди Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Це грамнегативні, безспорові, оксидазо-

негативні палички, які ферментують глюкозу і лактозу до кислоти й газу при 37 °С.

Вони виділяються в зовнішнє середовище з випорожненнями людей і теплокров-

них тварин і є кількісним показником ступеня фекального забруднення води. Тому

чим більше її фекальне забруднення, тим вища ймовірність контамінації води відпо-

відними патогенними мікроорганізмами.

Серед БГКП окремо виділяють групу коліформних бактерій, а в ній – фе-

кальні кишкові палички (ФКП), які розкладають лактозу при 44,5 °С. До E. coli

відносять бактерії, що не ростуть на цитратному агарі. Саме вони є показником

свіжого фекального забруднення. Для його визначення можна використати S. fae-

calis, який порівняно швидко гине в оточуючому середовищі.

При повноцінному санітарно-мікробіологічному дослідженні води визнача-

ють ЗМЧ, БГКП, E. coli, ентерококи, стафілококи, патогенні мікроорганізми (хо-

лерні вібріони, сальмонели, шигели, лептоспіри, ентеровіруси та ін.).

Взяття проб води. Для проведення мікробіологічного аналізу відбирають

500 см

води у стерильні флакони, закриті ватно-марлевою пробкою, покритою

зверху паперовим ковпачком. Взяття проб з водопровідних кранів проводять після

обпалювання їх спиртовим факелом і наступного випускання води протягом 10 хв.

Проби хлорованої води беруть у флакони з дехлоратором (на 500 см

води 2 см

1,5 % розчину гіпосульфіту натрію, простерилізованого в автоклаві).

Якщо дослідження проводять на виявлення не лише індикаторних, а й пато-

генних мікроорганізмів, потрібно брати пробу об’ємом 2500 см

води. Коли виз-

начають ще й індекс коліфагів об’єм проби збільшують до 3500 см

Частина І. Загальна мікробіологія

У відкритих водоймах проби беруть за допомогою бато-

метра. Цей прилад має металевий каркас із масивним дном-

грузилом, всередині якого вміщують стерильний флакон, за-

критий гумовим або скляним притертим корком (рис. 24).

На потрібній глибині корок відкривають, потягнувши за

шнур. Після заповнення флакона його відпускають, завдяки

чому ємність автоматично закривається. Після виймання фла-

кона з батометра притертий корок замінюють ватно-марле-

вою пробкою. Як правило, пробу води беруть на глибині 15 см,

але не ближче як за 10-15 см від дна водойми.

На флакон із відібраною водою наклеюють етикетку, на

якій вказують місце взяття проби, її номер, дату і час, темпе-

ратуру води й повітря, прізвище санітарного лікаря чи його

помічника, мету дослідження й адресу лабораторії, яка буде

проводити аналіз.

Мікробіологічне дослідження води необхідно провести

не пізніше 2 год після її відбору. Якщо це неможливо, вказа-

ний строк може бути продовжений до 6 год, але при умові

транспортування проби при температурі 1-5 °С, що досяга-

ють за допомогою пакетів з теплою водою взимку і льоду –

влітку. Після доставки проб до лабораторії негайно проводять дослідження, яке

включає визначення загального мікробного числа в 1 см

води, числа бактерій

групи кишкових паличок у 1 дм

(індекс БГКП), число термостабільних кишко-

вих паличок (фекальних коліформ – індекс ФК) у 100 см

, число патогенних мікро-

організмів у 1 дм

, число коліфагів у 1 дм

води, що досліджується.

Визначення загального мікробного числа води. Цей показник визначає

кількість мезофільних, мезотрофних аеробів і факультативних анаеробів, які ви-

ростають на МПА при 37 °С протягом 24 год. Залежно від ступеня ймовірного

бактерійного забруднення воду сіють із таким розрахунком, щоб на агарі в чашках

виростало від 30 до 300 колоній. Звичайну водопровідну або артезіанську воду

сіють у нерозведеному стані в об’ємі 1 см

. Проби з відкритих водойм, криниць,

джерел і т.п. сіють після попереднього їх розведення від 10

-1

до 10

-3

і більше (особ-

ливо стічних вод). Для цього в ряд пробірок наливають по 9 мл стерильної води, в

першу з них вносять 1 см

досліджуваної води, ретельно перемішують, із цієї про-

бірки переносять 1 см

у другу, потім у третю і всі наступні по 1 см

попереднього

розведення. Для виготовлення кожного розведення необхідно брати нову стериль-

ну піпетку.

Нерозведену або розведену воду в об’ємі 1 см

вносять, рівномірно розкапую-

чи, на дно стерильної чашки Петрі, потім заливають її 10-12 см

розтопленого й

охолодженого до 45 °С м’ясо-пептонного агару. Обережними круговими рухами

змішують воду з агаром. Як правило, сіють не менше двох розведень і для кожно-

го з них використовують дві чашки. Після застигання середовища посіви вирощу-

ють у термостаті при 37 °С протягом 24 год. Через добу підраховують число коло-

Рис. 24. Батометр:

а – стерильний

флакон; б – пробка;

в – шнур для відкри-

вання флакона; г –

грузило; д – шнур для

опускання приладу.