Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

2. Лофотрихи – пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

3. Амфітрихи – поодинокі або пучки джгутиків на обох кінцях бактерій (спірили);

4. Перитрихи – багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник

черевного тифу, кишкова паличка).

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для

певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При

прямих методах джгутики забарвлюють барвниками або солями металів. Обов’яз-

ково вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла

або заліза, що призводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають ви-

димими під світловим мікроскопом. До прямих методів виявлення джгутиків відно-

сяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надав-

леній краплі за допомогою світлової, темнопольної, фазово-контрастної та анопт-

ральної мікроскопії.

Забарвлення джгутиків – одна з найтонших, складних і вимогливих бактеріоско-

пічних методик. Запропоновано багато складних методів їх фарбування: Леффлера,

Грея, Морозова, Уварова, Бенін’єтті та ін. Найнадійнішим із них є метод Леффлера.

Метод Леффлера. Важливою умовою для успішного забарвлення є виготов-

лення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежи-

рених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і

вносять її в 5-6 мл водопровідної води, не емульгуючи, а залишаючи петлю до тих

пір, поки бактерії самі розійдуться в рідині. Пастерівською піпеткою з тонко відтяг-

нутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у

воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши

препарат через полум’я.

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

1. Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл

20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірча-

нокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання,

перед використанням обов’язково фільтрують.

2. Концентрований феноловий фуксин Циля, наполовину розведений водою і

профільтрований.

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протя-

гом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави.

Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою,

висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-ко-

ричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

Метод Бенін’єтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за

методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчи-

ном, який завжди готують ex tempore: розчин 1 – сірчанокислого цинку 1 г, таніну

10 г, дистильованої води 100 мл; розчин 2 – насичений спиртовий розчин генціана

фіолетового.

Частина І. Загальна мікробіологія

Змішують 5 мл першого і 3 мл другого розчинів. Суміш наносять на препа-

рат-мазок, тричі нагрівають до появи парів, охолоджують, добре промивають во-

дою. Висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в темно-фіолетовий

колір, джгутики мають більш ніжне забарвлення.

Мікроскопічне дослідження живих мікробів

Для прижиттєвого вивчення мікроорганізмів використовують методи надав-

леної й висячої краплі та спеціальні камери для тривалого спостереження за їх

ростом, розмноженням, дією різних хіміотерапевтичних препаратів тощо. Пере-

вагою цих методів є можливість досліджувати бактерії в неушкодженому вигляді,

тоді як обробка мазків при їх висушуванні, фіксації та забарвленні часто супро-

воджується зміною мікробних клітин. Значно легше, простіше і швидше можна

виявити рухливість, що свідчить про наявність джгутиків. Цим широко користу-

ються в практичних лабораторіях при диференціально-діагностичному визначенні

видів збудників.

Однак, ці методи мають і ряд недоліків. У живих бактерій, що активно руха-

ються, важко виявляти деталі структури. При такому дослідженні можна мати лише

загальне уявлення про їх морфологію. Разом з тим, дослідження у живому стані

крупніших мікроорганізмів (гриби, найпростіші) дає змогу вивчати тонку струк-

туру їх клітин краще, ніж у забарвлених препаратах. Ця перевага стає особливо

виразною при дослідженні живих незабарвлених мікробів за допомогою фазово-

контрастної та аноптральної мікроскопії.

Необхідно завжди пам’ятати, що робота з живими збудниками більш небез-

печна, вимагає виняткової обережності і навику. Після мікроскопії потрібно

обов’язково занурювати препарати в дезінфікуючий розчин.

Надавлена крапля. На середину предметного скла бактеріологічною петлею

або піпеткою наносять краплю молодої (12-18 год) теплої бульйонної культури

або іншого досліджуваного матеріалу. При густому рості культури її розбавляють

фізіологічним розчином, оскільки наявність великої кількості мікробних тіл у полі

зору утруднює спостереження за окремими бактеріями та їх рухливістю. Нанесе-

ну краплю накривають покрівним скельцем, обережно накладаючи його пінце-

том, щоб у надавленій краплі не з’являлись бульбашки повітря. Для цього по-

крівне скельце краще не накладати зверху, а ставити його ребро біля краю краплі

і повільно опускати, витісняючи повітря між предметним і покрівним скельцями.

Вдало зроблена крапля заповнює весь простір між ними, але при цьому рідина не

виступає за краї покрівного скельця. Якщо вона виступає, зайву її частину відсмок-

тують шматочком фільтрувального паперу, утримуючи його пінцетом, після чого

папір занурюють у дезінфікуючий розчин. Недоліком надавленої краплі є її швид-

ке висихання. При необхідності довго розглядати препарат, краї покрівного скла

заздалегідь змащують вазеліном.

Висяча крапля – метод мікроскопічного дослідження живих мікроорганізмів,

розроблений Р. Кохом в 1876 р. За його допомогою можна спостерігати розмно-

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів

ження бактерій, характер їх рухливості, проростання спор у вегетативні форми,

явище хемотаксису, дію фізичних і хімічних факторів, імунних сироваток тощо.

Його також широко використовують для вивчення морфології грибів, найпрості-

ших і спірохет. Як і в методі надавленої краплі, досліджують молоді культури,

вирощені в рідкому або на щільному середовищі.

Для виготовлення висячої краплі необхідні спеціальні предметні скельця, в

центрі яких є напівсферичне заглиблення (лунка). Невелику краплю негустої сус-

пензії бактерій петлею або піпеткою наносять на середину чистого, але не знежи-

реного покрівного скельця. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо зма-

щують вазеліном, обережно накладають на покрівне скельце, слідкуючи, щоб крап-

ля культури знаходилась в центрі заглиблини, і швидко перевертають його. Крапля

повинна звисати в лунці, але не торкатись її дна. Звідси походить назва препарату

висяча крапля. Змащування країв лунки вазеліном створює своєрідну герметичну

вологу камеру. Така крапля не висихає і придатна для спостереження протягом

довгого часу (рис. 14).

Мікроскопічне дослідження живих об’єктів як в надавленій, так і висячій

краплях проводиться за допомогою сильних сухих або імерсійних систем при опу-

щеному конденсорі, звуженій діафрагмі та освітленні плоским дзеркалом. Спо-

чатку при малому збільшенні (×8) знаходять край краплі, чітко видимий як лінія в

дещо затемненому полі зору. По один бік цього краю є багато дрібнесеньких крап-

линок конденсату, які осіли на внутрішній поверхні покрівного скельця. По дру-

гий бік лінії видно рівномірний сіруватий фон. Це й є крапля. Знайдений край

краплі переміщують у центр поля зору мікроскопа й переходять на сильніший

сухий (×40), а при потребі й на імерсійний об’єктив (×90). Трохи відкривають

діафрагму конденсора й починають спостерігати характер руху. Рухливі бактерії

проходять з однаковою швидкістю значну віддаль, часом через усе поле зору, роб-

лячи кругові та гвинтові рухи. Найбільш швидкі й прямолінійні рухи роблять мо-

нотрихи й лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна й без-

ладна рухливість. Мікроскопіст-початківець може помилково прийняти молеку-

лярний (броунівський) рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії постійно

коливаються між двома близькими точками, ніби “танцюють” на місці.

Одним із суттєвих недоліків методу висячої краплі є слабка чіткість контурів

мікробів через кривизну лунки. Для усу-

нення цього недоліку можна користува-

тись камерою Беттхера. Її легко виготови-

ти в будь-якій лабораторії. До звичайного

предметного скла за допомогою воску,

парафіну або відповідного клею при-

кріплюють скляне або пластмасове кільце

з діаметром отвору біля 10 мм і висотою

6-7 мм. Верхній край приклеєного кільця

змащують вазеліном і на нього наклада-

ють покрівне скельце з живими бактерія-

Рис. 14. Висяча крапля:

а – вид зверху; б – вид збоку.

Частина І. Загальна мікробіологія

ми в краплі, що звисає донизу в цій вологій камері. За допомогою такої камери

можна навіть проводити цейтраферну кінозйомку живих об’єктів.

Для збільшення контрастності досліджуваних об’єктів в надавленій чи ви-

сячій краплях можна застосувати прижиттєве (вітальне) забарвлення. Для цього

використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і то-

луїдиновий синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус

зелений та ін. Суспензію мікробів вносять у краплю 0,001 % водного розчину

барвника, готують надавлену або висячу краплю і мікроскопують.

Можна проводити прижиттєве забарвлення бактерій і флуорохромами. Тоді

дослідження проводять за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Ще кращі можливості для довготривалого вивчення живих мікроорганізмів

створюються у спеціально сконструйованих камерах. Найбільш відомі з них зап-

ропонували Пєшков і Фонбрюн.

Ш-подібна камера Пєшкова. На предметне скло наливають шар розтопле-

ного агару товщиною 0,2 мм. Після застигання стерильним скальпелем вирізають

дві канавки і отримують Ш-подібний шар середовища. Посів мікробів проводять

методом стікаючої краплі лише на середню смужку агару і негайно закривають

стерильним покрівним скельцем. Середовище, що виступає за межі покрівного

скла, обрізають і розтопленим парафіном герметично закривають краї препарату.

Смужка агару, що межує з боків із повітрям канавок, гарантує нормальний розви-

ток аеробних і факультативно анаеробних мікробів.

Масляна камера Фонбрюна. На предметному склі товщиною 0,5 мм за до-

помогою густого спиртового розчину Шеллака приклеюють дві вузенькі скляні

смужки такої ж товщини на відстані 10 мм одна від одної. Покрівне скельце з

тонким шаром засіяного мікробами агару накладають на скляні бортики поперед-

ньо змазані сумішшю воску й каніфолю. Гумовою грушею продувають камеру,

щоб випарувати конденсаційну вологу, і пастерівською піпеткою негайно заливають

її вазеліновим маслом, обережно підпускаючи його під покрівне скельце. Масло

заливають доти, поки весь шар агару знизу буде ним покритий. Краплю масла не

слід доводити до країв камери, необхідно завжди залишати невеличкий зазор.

За допомогою камер Пєшкова й Фонбрюна можна вивчати найтонші зміни

клітинних структур при розмноженні бактерій і проводити їх цейтраферну кінозйом-

ку особливо при використанні фазово-контрастної й аноптральної мікроскопії.

Макроскопічне виявлення рухливості бактерій. Окрім забарвлення джгу-

тиків, дослідження за допомогою надавленої та висячої крапель, рухливість мікро-

організмів можна досить просто встановити й неозброєним оком. Для цього дос-

ліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середови-

ща. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 год. Якщо бактерії не мають

джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рух-

ливі бактерії дадуть дифузний ріст по всій товщині живильного середовища.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

Розділ 4

ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів як окремий розділ мікробіології вивчає біохімічні

й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують

відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби. Адже бактерії є

складними живими організмами, в яких відбуваються різноманітні біохімічні пе-

ретворення. Вони зумовлюють ріст, розмноження, продукцію ферментів, токсинів

та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію функціональ-

ної активності клітин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов

зовнішнього середовища.

Культивування мікроорганізмів

Вимоги до живильних середовищ. Для вирощування бактерій у лаборатор-

них умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання

використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стан-

дартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності

мікроорганізмів.

У першу чергу, бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови

власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту висту-

пають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче,

риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони.

Можна використовувати й замінники м’яса – плаценту, кров’яні згустки, дріжджі.

Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і

вода, а також ростові фактори (вітаміни групи В, ферменти). Універсальним дже-

релом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові

гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу се-

редовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєч-

ний жовток, шматочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і

містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму

складі неорганічні фосфати.

Допускається застосування речовин, які усувають дію інгібіторів росту і ток-

синоутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо).

Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності та

рівень окисно-відновного потенціалу (Еh), який для аеробних мікроорганізмів

досягає понад 0,08 В, а для анеробних бактерій коливається в межах 0,12-0,60 В.

Середовища повинні мати певну в’язкість, густину, мати певну вологість (до

20 % води), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.

Основні живильні середовища. Численні потреби мікроорганізмів зумовлю-

ють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існу-

ють спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо

Частина І. Загальна мікробіологія

перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища за-

водського виготовлення (сухі), які здатні задовольнити найвибагливіші потреби

мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використову-

ють згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища ство-

рюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи

інші потреби мікроорганізмів. Їх використовують в основному для експеримен-

тального вивчення окремих ланок метаболізму бактерій.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та

щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно

0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал,

який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %),

білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропеп-

тин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає

середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бак-

терій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіо-

логічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також же-

латин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Залежно від потреб бактеріологів живильні середовища поділяються на п’ять

основних груп.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясо-пеп-

тонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наяв-

ністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випад-

ках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, си-

роватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон, асцит-агар та інші.

Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду

ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види

бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для

холерних вібріонів, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії.

Четверта група селективні середовища, які завдяки додаванню певних ком-

понентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних

видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. Так, середовище Мюллера

є селективним для тифо-паратифозних бактерій, фуразолідоно-твіновий агар – для

коринебактерій і мікрококів. Додавання антибіотиків до складу середовищ ро-

бить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).

П’ята група – диференціально–діагностичні середовища. Це велика група се-

редовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів

і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення

протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, ре-

дукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).

Все ширше застосування в мікробіологічних лабораторіях знаходять численні

комерційні тест-системи для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів, виготов-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

лені на основі різноманітних диференційно-діагностичних середовищ. В одному

варіанті виконання вони вносяться в спеціальні полістиролові або інші планшети

та висушуються для видалення води. До них належать системи АРІ-20 для іденти-

фікації стафілококів, коринебактерій, ентеробактерій, анаеробних мікробів,

Enterotest 1 і 2, російська система ПБД (пластина біохімічна диференційна) для

ідентифікації ентеробактерій (див.вкл., рис. 29). Непогано зарекомендували себе

тест-системи Roche та інші.

Інші варіанти подібних тест-систем передбачають адсорбцію диференціюю-

чих субстратів на паперових або полімерних носіях. Серед них розповсюджені

системи Auxtab, Minitek, Morlok, Micro-ID.

Подібні системи зручні в користуванні, вони дозволяють одночасно досліди-

ти широкий спектр мікробних ознак, завжди готові до використання в будь-яких

мікробіологічних лабораторіях, вони прості й надійні, вимагають невеликих

об’ємів посівного матеріалу, тому економлять лабораторний посуд, піпетки.

Комп’ютерна обробка одержаних результатів дає змогу швидко визначити й оці-

нити вид невідомого збудника.

Виготовлення живильних середовищ. До складу будь-яких середовищ вхо-

дять переважно натуральні тваринні або рослинні продукти і компоненти – м’ясо,

рибна мука, яйця, молоко, кров, дріжджовий екстракт, картопля тощо. З них готу-

ють спеціальні напівфабрикати у вигляді екстрактів, настоїв, ферментативних і

кислотних гідролізатів (м’ясна вода, дріжджовий екстракт, триптичний гідролізат

Хоттінгера, пептон та інші), які є основою для подальшого конструювання жи-

вильних середовищ. Крім цього, в живильні середовища додають різні неорганічні

солі залежно від потреб мікробної клітини. Як прaвило, концентрація хлориду

натрію складає 5,0 г/л, KH

– 0,2-0,5 г/л, MgSO

·7H

O, інші солі додаються із

розрахунку 0,001 г/л. У необхідних випадках до складу вводять вуглеводи (цукри,

багатоатомні спирти), амінокислоти в концентрації 0,5-1,0 %, а також вітаміни (до

0,001 мг/мл).

Для забезпечення необхідної густини середовища використовують агар-агар,

який одержують з морських водоростей. Він є зручним і необхідним компонентом

середовищ, оскільки не споживається бактеріями як ростовий субстрат. Утворю-

ючи у воді гель, він плавиться при температурі біля 100 °С, а густіє при 40 °С.

Джерелом желатину є багаті на колаген субстрати. Серед них хрящі, сухожилки,

кістки тощо. Гель, який отримують внаслідок використання желатину, плавиться

при температурі біля 32-34 °С і гусне при 28 °С. Проте численні мікроорганізми

здатні розщеплювати желатин, тому використання останнього як наповнювача

середовища вважається недоцільним. Найчастіше такі середовища з желатином

застосовуються для визначення протеолітичних властивостей бактерій.

Виготовлення живильних середовищ є складним динамічним процесом, який

потребує уваги бактеріолога. Цей процес складається з декількох основних етапів.

Спочатку до дистильованої води згідно з прописом додають необхідні сухі компо-

ненти середовища, ретельно перемішують, розчиняючи при нагріванні. Обов’яз-

ково встановлюють рН середовища, яке визначають або за допомогою іонометра,

Частина І. Загальна мікробіологія

або індикаторними папірцями. При цьому слід звернути увагу, що після стерилі-

зації реакція середовища падає на 0,2. Середовища, які містять агар, фільтрують

через ватно-марлевий фільтр у гарячому стані, рідкі середовища – через паперові

фільтри. Якщо є необхідність, їх освітляють осадженням або за допомогою білка

курячого яйця чи сироватки. Середовища розливають у спеціальні матраци, кол-

би, флакони і закривають ватно-марлевими пробками з паперовими ковпачками.

Залежно від складу середовища використовують різні режими стерилізації. Так,

середовища, які містять вуглеводи, желатин стерилізують в автоклаві 15 хв при

температурі 112 °С або текучою парою при температурі 100 °С дробно. Середови-

ща без вуглеводів можна стерилізувати в автоклаві при 115-120 °С протягом 20 хв.

Якщо до складу середовищ входять нестійкі до температури компоненти, такі, як

нативний білок, сироватка, сечовина, то вони стерилізуються або фільтруванням

через бактеріальні фільтри, або їх додають готовим у стерильне середовище. Кон-

троль стерильності середовищ здійснюють шляхом витримування їх у термостаті

протягом декількох діб при температурі 37 °С.

Наводимо приклади виготовлення деяких простих живильних середовищ, які

найчастіше використовуються в мікробіологічній практиці і можуть бути осно-

вою для виготовлення більш складних.

М’ясна вода. Для її виготовлення використовують свіжу яловичину, яку по-

передньо очищають від жиру, фасцій, сухожилків тощо, розрізають на дрібні шмат-

ки і пропускають через м’ясорубку. Отриманий фарш заливають водопровідною

водою в співвідношенні 1:2, розмішують і на добу залишають у прохолодному

місці. Отриманий настій кип’ятять протягом 30-60 хв, періодично знімаючи на-

кип, а потім відстоюють. Відділяють рідину від фаршу, фільтрують через фільтру-

вальний папір або полотно і доливають водопровідною водою до первинного

об’єму, потім розливають у флакони і стерилізують при 1 атмосфері (температура

120 °С) протягом 30 хв. Стерильна м’ясна вода прозора, має жовтуватий колір, а

на стінках флакона і на дні утворюється осад із білків, які згорнулись. Тому при

подальшому використанні середовища його знову фільтрують. Активна реакція

середовища – 6,2.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Щоб виготовити МПБ, до м’ясної води

додають 1 % пептону і 0,5 % хлориду натрію, встановлюють необхідне рН за до-

помогою 20 % розчину NaOH і кип’ятять 30-40 хв, постійно перемішуючи. Бульйон

фільтрують через паперовий або полотняний фільтри, розливають у флакони, про-

бірки, перевіряють активну реакцію середовища і стерилізують при 120 °С про-

тягом 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА). До м’ясо-пептонного бульйону додають

дрібно нарізаний агар-агар (2-2,5 %). Одержану суміш кип’ятять до розчинення

агар-агару, фільтрують, встановлюють рН і розливають у флакони. Стерилізацію

проводять протягом 20 хв при температурі 120 °С.

Середовища з кров’ю, сироваткою або асцитичною рідиною. Оскільки ці

середовища не можуть довго зберігатись, їх готують безпосередньо перед засто-

суванням. Для цього до розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА додають

Розділ 4. Фізіологія бактерій

стерильно 5-10 % свіжої або дефібринованої крові барана, кролика або іншої тва-

рини. Флакони з агаром ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі, слідку-

ючи за відсутністю піни.

Ідентично готують сироватковий (5-10 % сироватки крові) або асцитичний

агар (25 % асцитичної рідини).

Триптичний перевар за Хоттінгером. Бульйон із нього економічніший за

інші м’ясо-пептонні середовища, оскільки дозволяє з однієї порції м’яса одержа-

ти в декілька разів більше бульйону. У цьому середовищі міститься велика кількість

амінокислот, отже, підвищується його буферність, і за рахунок цього більш стаб-

ільним є значення активної реакції середовища.

Для виготовлення перевару беруть один кілограм м’яса без сухожилків і жиру,

порізаний на дрібні шматки розміром до 1-2 см, занурюють у каструлю з подвійним

об’ємом води, яка кипить, і кип’ятять 15-20 хв, поки м’ясо не стане сірим, що свідчить

про коагуляцію білків. Його виймають з рідини і пропускають через м’ясорубку. У

рідині, яка залишилась, встановлюють рН 8,0, опускають туди фарш і охолоджують

до 40 °С. Потім додають 10 % (до об’єму рідини) свіжої підшлункової залози, попе-

редньо очищеної від сполучної тканини, жиру і двічі пропускають через м’ясорубку.

Замість залози використовують сухий препарат панкреатину (0,5 %). Одержану суміш

ретельно збовтують і доводять рН до 7,8-8,0. Через 30 хв перевіряють рН. Якщо

активна реакція середовища не змінюється в кислу сторону, це свідчить про недо-

броякісність ферменту. Коли рН середовища стабілізується, суміш переливають у

великі бутлі, заповнюючи їх на 1/3. Додають до 3 % хлороформу, закривають посуд

резиновими корками та інтенсивно збовтують для перемішування рідин. Надлишок

парів хлороформу випускають. Через 1-2 год знову перевіряють рН середовища,

встановлюючи його на 7,4-7,6. Отриману суміш залишають при кімнатній температу-

рі на строк до 16 днів. Протягом перших 3-4 днів щоденно перевіряють і коригують

рН середовища, а також збовтують флакони не менше, ніж 3 рази на добу. Пізніше

цю процедуру можна не проводити і збовтувати середовище слід не так часто. За

1-2 дні до закінчення циклу перетравлювання збовтування середовища припиняють.

Про завершене якісне переварювання свідчать просвітління рідини, яка на-

буває солом’яно-жовтого кольору, а також утворення на дні пилоподібного осаду.

Рідина легко фільтрується, її перевіряють на наявність триптофану за допомогою

проби з бромною водою (до 3-4 мл фільтрату додають 3-4 краплі бромної води). За

наявності триптофану (до 2,0-3,0 г/л) колір середовища змінюється на рожево-

фіолетовий. Визначають загальний азот, який в нормі досягає 11,0-12,0 г/л, і амін-

ний азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гідролізат фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, розливають

у бутлі та автоклавують при 120 °С протягом 30 хв. У такому вигляді він може

зберігатись тривалий час.

Його використовують для отримання бульйону Хоттінгера. З цією метою до

100-200 мл гідролізату додають 800-900 мл дистильованої води, 0,5 % хлориду

натрію та 0,2 % однозаміщеного фосфорнокислого натрію. Доводять рН до 7,4-7,6,

розливають у флакони і стерилізують 20 хв при 120 °С.

Частина І. Загальна мікробіологія

М’ясо-пептонний агар на основі гідролізату Хоттінгера готують за рецепту-

рою звичайного МПА.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватися стандартни-

ми сухими живильними середовищами, які випускає бактеріологічна промис-

ловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіолог-

ічних досліджень і стандартизувати їх.

Основні методи стерилізації

Головний напрям у боротьбі з інфекційними хворобами – профілактичний. У

зв’язку з цим у діяльності лікувальних закладів велике значення має попереджен-

ня попадання збудників захворювань в організм людини або інші об’єкти. Це про-

водиться добре розробленими й апробованими методами мікробної деконтамінації.

Основні з них – стерилізація, дезінфекція, антисептика та асептика.

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний, вільний від бактерій) – повне

знищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на предметах, ма-

теріалах, у живильних середовищах.

У медичній практиці стерилізують інструменти, перев’язочний і шовний ма-

теріал, операційну білизну, лікарські препарати. У мікробіологічних лабораторі-

ях – живильні середовища, пробірки, піпетки, колби, чашки Петрі тощо. Тому

перед стерилізацією необхідно вміти підготувати інструменти, посуд, пробірки,

піпетки, перев’язочний матеріал та інше.

Інструменти обробляють у такій послідовності. Спочатку їх прополіскують

у проточній воді, потім замочують у миючому розчині 15 хв, миють у тому ж роз-

чині 0,5-1 хв, прополіскують проточною і дистильованою водою, висушують у

сухожаровій шафі при 80-85 °С до повного зникнення вологи.

Пробірки, флакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загорта-

ють у папір по 25-30 штук, а чашки Петрі – по 4-5 штук або вміщують у стерилі-

заційні коробки (бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця за-

тикають ватою, обгортають папером або вміщують у картонні чи металеві пенали

по 10-15 штук. Живильні середовища в колбах, флаконах, пробірках також закри-

вають пробками.

У лабораторній практиці використовують такі види стерилізації: а) високою

температурою; б) механічна (холодна); в) хімічними речовинами і газами.

Існує багато способів стерилізації з допомогою високої температури. Ефек-

тивність такої стерилізації при нагріванні характеризується показником D – часом,

який необхідний при даній температурі, щоб отримати десятикратне зменшення

популяції бактерій (на 90 %). Його величина вимірюється, як правило, у хвилинах.

Прожарювання в полум’ї пальника – швидкий й абсолютно надійний спосіб.

Ним стерилізують бактерійні петлі, пінцети, предметні й покривні скельця.

Кип’ятіння протягом 40 хв у спеціальних стерилізаторах використовують

для обробки хірургічних інструментів, шприців, голок, гумових трубок. Для підви-

щення температури кипіння й усунення жорсткості води додають 1 % бікарбонату