Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

ной делецией 46% дистрофина. Эта огромная по протяжен-

ности делеция, целиком локализованная внутри стержнево-

го домена, практически не затрагивала функциональной ак-

тивности белка (England et al., 1990). После внутривенного

введения фрагментов гена Dmd в составе рекомбинантного

аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной

ДНК в скелетных и сердечной мышцах животных (Srataford-

Perricaudet etal., 1992). Повышение экспрессии дистрофина,

происходящее у mdx-мышей в результате трансгеноза пол-

норазмерного гена Dmd, предотвращает развитие аномаль-

ных механических свойств мышц диафрагмы, связанных с

их дистрофией (Сох et al., 1993а). При этом 50-кратное уве-

личение уровня экспрессии дистрофина не вызывало ника-

ких побочных токсических эффектов.

Несмотря на эти очевидные успехи, проблема генно-

инженерной коррекции миодистрофии Дюшенна еще далека

от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты

исследователей о перспективности генной терапии миодист-

рофии Дюшенна по сравнению с клеточной терапией — пе-

ресадкой здоровых эмбриональных миобластов. Пока не ут-

верждена ни одна программа клинических испытаний гено-

терапевтического лечения миодистрофии Дюшенна. Основ-

ные проблемы генокоррекции данного наследственного за-

болевания связаны с (1) огромным количеством дистрофин-

положительных мышечных клеток, (2) сложным характером

регуляции экспрессии DMD гена, (3) необходимостью обес-

печения системы эффективной доставки гена дистрофина в

миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особенно

важно, в мышцы сердца и диафрагмы, а возможно, и в раз-

личные отделы мозга, а также (4) с иммунологическими ос-

ложнениями, возникающими при использовании вирусных

векторов. В связи с этим наряду с совершенствованием пря-

мых, вирус-опосредованных и липосомных способов введе-

ния чужеродных ДНК разрабатываются иные подходы к ге-

нокоррекции миодистрофии Дюшенна, такие как: использо-

вание макрофагов, нагруженных плазмидами; модификация

6 Заказ № 170

культивированных сателлитных клеток, полученных с единич-

ных мышечных волокон; совместное выращивание фибро-

бластов и миобластов, их модификация и генетическая транс-

формация фибробластов в миобласты; конструирование

мини-хромосом, при котором ген дистрофина в составе YAC-

вектора вводится в сферобласты и проводится инфузия этой

конструкции в культивируемые миобласты.

Один из подходов в генотерапии миодистрофии Дюшен-

на основан на трансфекции в мышечные клетки антисмыс-

ловых РНК с целью посттрансляционной коррекции сдвига

рамки считывания (Matsuo, 1996). Эта технология основана

на том наблюдении, что делеции в гене DMD у пациентов с

мягкими формами миодистрофии Беккера, как правило, не

сопровождаются сдвигом рамки считывания. В опытах in vitro

показано, что в сарколемме культивируемых миотубул mdx-

мышей появляется экспрессия дистрофина после трансфек-

ции в них олигонуклеотидов, комплементарных З'-сайту сплай-

синга 22 интрона гена Dmd (Dunckley et al., 1998). Путем пря-

мого секвенирования соответствующих последовательностей

кДНК, полученных из этих клеток методом обратной ПЦР (RT-

PCR), показано, что при сплайсинге происходит точное вы-

резание области, включающей мутантный сайт и заключен-

ной между 22 и 30 экзонами. При этом образуется новый

РНК-транскрипт дистрофина, который может кодировать про-

дукт, достаточно функциональный для предотвращения раз-

вития наиболее тяжелых проявлений миодистрофии.

В 1995 г. исследования по генотерапии миодистрофии

Дюшенна начаты в рамках программы «Геном человека» и в

нашей стране. С использованием метода бомбардировки кле-

ток и тканей конъюгированными с плазмидами частицами зо-

лота или вольфрама, разогнанными до высоких скоростей,

полноразмерная кДНК дистрофинового гена была успешно

трансфецирована в скелетные мышцы мышей линии mdx

(Zelenin et al., 1997). Иммуногистохимический анализ пока-

зал, что в некоторых клетках мышц мутантных животных по-

является дистрофин (рис. 10). Доля дистрофин-положитель-

ных волокон в области бомбардировки поднимается при этом

до 2.5-5% (по сравнению с 0.5% в контроле) и сохраняется

на этом уровне, по крайней мере, в течение двух месяцев. В

некоторых экспериментах доля цельнокрашенных дистрофин-

положительных волокон в скелетных мышцах увеличивалась

от 27% через 2—3 недели до 82% через 2 месяца после бал-

листической трансфекции (Михайлов и др., 1998). По-види-

мому, в некоторых случаях происходит нерегулируемая экс-

прессия трансфецированного гена. Однако экспрессия дис-

трофина не нормализует полностью дифференцировку воло-

кон. Большой процент цельнокрашенных миофибрилл деге-

нерирует, в других сохраняется центральное положение ядер.

Рис. 10. Иммуногистохимический анализ дистрофина в

мышечных клетках мышей линии mdx до (а) и после (б)

введения кДНК-овых конструкций гена DMD

В отличие от липосомного способа введения, еще бо-

лее успешной оказалась трансфекция полноразмерной кДНК

дистрофина (pHSADy) с помощью синтетических микросфер

MF-2 (Баранов и др., 1998; Baranov et al., 1998). После одно-

кратной инъекции MF-2/pHSADy в четырехглавую мышцу бе-

дра введенная конструкция обнаруживается методом ПЦР

во многих тканях, включая скелетные мышцы, сердце, мозг,

легкие, причем присутствие нагруженных плазмидой микро-

сфер определяется методом флюоресцентной гибридизации

in situ (FISH) в 60—70% ядер. Неожиданно высоким оказы-

вается уровень дистрофин-положительных волокон в контра-

латеральной по отношению к инъецированной четырехглавой

мышце mdx-мышей спустя 60 дней после введения (рис. 11).

Рис. 11. Число дистрофин-положительных волокон

Многие проблемы в генотерапии миодистрофии Дюшен-

на могли бы быть преодолены при использовании принципи-

ально иного метода коррекции генного дефекта, основанно-

го на специфической активации у больных аутосомного го-

молога DMD — гена UTRN (Tinsley, Davies 1993; Blake et al.,

1996). Сходная ртратегия изменения регуляции экспрессии

фетального гемоглобина была использована для компенса-

ции дефекта глобиновых цепей у больных с серповидно-кле-

точной анемией (Perrine et al., 1993). Характер экспрессии

утрофина в раннем эмбриогенезе позволяет предполагать,

что этот белок может функционировать как фетальная изо-

форма дистрофина. Возможно при этом, что утрофин ока-

жется способен заменить дистрофин, если удастся изменить

характер экспрессии UTRN-гена у пациентов в тех клетках, в

которых в норме ген DMD экспрессируется. Для направлен-

ного изменения регуляции работы гена утрофина с помощью

определенных химических стимуляторов необходимо преж-

де всего детальное знание его промоторной области. Реали-

стичность такого подхода для лечения миодистрофии Дюшен-

на проверяется в настоящее время в опытах по трансгенозу

на модельных объектах, в первую очередь, на mdx-мышах.

Мы уже упоминали о том, что при трансгенном введении кон-

струкции, обеспечивающей экспрессию в скелетных мышцах

укороченной формы утрофина, в линию дистрофин/утрофин-

дефицитных мышей, наиболее полно фенокопирующую мио-

дистрофию Дюшенна, наблюдается коррекция основных

клинических симптомов миодистрофии (Rafael et al., 1998).

Очевидно, что присутствие укороченной формы утрофина в

сарколемме мышц мутантных животных, не имеющих эндо-

генного дистрофина и утрофина, способно восстановить дис-

трофин-ассоциированный комплекс белков, нормальное раз-

витие и функционирование дефектных мышц. Значение этих

результатов для разработки программ генотерапии миодист-

рофии Дюшенна трудно переоценить.

б) Мышечная дистрофия врожденная

прогрессирующая с умственной отсталостью, тип

Фукуяма (MIM: 253800)

В 1960 г. впервые Фукуяма описал 6 семей с врожден-

ной прогрессирующей миодистрофией дюшенновского типа,

сочетающейся с выраженной умственной отсталостью

(Fukujama et al., 1960). Характер наследования этой формы

миодистрофии соответствовал аутосомно-рецессивному.

Представлены результаты клинико-генеалогического анали-

за более 200 семей с этим заболеванием в Японии (Fukujama

et al., 1981). Прогрессирующей мышечной слабости часто

сопутствуют мышечная гипотония, эпилептиформные припад-

ки, гидроцефалия. Патоморфологически обнаруживаются

микрополигирия, фиброглиальная пролиферация мягкой и

паутинной оболочек. Кроме миодистрофии типа Фукуяма

известны три клинически различающихся синдрома, при ко-

торых врожденная миопатия сочетается с пороками разви-

тия, такими как лиссэнцефалия, гидроцефалия, аномалии

глаз. Это синдром Валькера-Варбурга (гидроцефалия, агирия,

дисплазия сетчатки: HARD-синдром, MIM 236670), описанная

в Финляндии болезнь МЕВ (muscle-eye-brain disease, MIM

253280) и врожденная мышечная дистрофия с центральной

гипомиелинизацией, обусловленная дефектом мерозина (см.

ниже, MIM 156225).

При иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц

больных с миодистрофией Фукуяма примерно в 13% случа-

ев обнаруживаются аномалии дистрофина (Beggs et al., 1992).

Для объяснения этого было высказано предположение, что

дистрофин и продукт гена FCMD (Fukujama type congenital

muscular dystrophy) взаимодействуют. Раннее начало и бо-

лее тяжелое течение заболевания наблюдается у пациентов,

которые одновременно гетерозиготны по FCMD и гемизигот-

ны по мутациям DMD-гена. Предполагается, что такой ком-

бинированный фенотип встречается среди мужчин в Японии

с частотой 1:175000.

У пациентов с миодистрофией Фукуяма обнаруживает-

ся аномально низкий уровень экспрессии многих белков дис-

трофин-ассоциированного комплекса, включая дистроглика-

ны — трансмембранный 43DAG и экстраклеточный 156DAG,

и саркогликаны (Matsumura et al., 1993). Кроме того, содер-

жание ламинина в скелетных мышцах и в периферических

нервах пациентов также оказывается сниженным. Однако

генетический анализ семей дает основания предполагать, что

эти нарушения являются вторичными по отношению к основ-

ному биохимическому дефекту, так как найдено сцепление

гена FCMD с микросателлитными маркерами, локализован-

ными в области 9q31 -q33 (Toda et al., 1993). Ближайшие флан-

кирующие маркеры D9S58, D9S59 и D9S2107. Не исключе-

но, что в этой области локализован ген, кодирующий еще один

белок дистрофин-ассоциированного комплекса (DAP), дис-

функция которого обусловливает клинику миодистрофии Фу-

куяма. Перекрывание клинических симптомов при миодист-

рофии Фукуяма и при мягких формах синдрома Валькера-

Варбурга и результаты анализа гаплотипов больных по мар-

керам, сцепленным с геном FCMD, не противоречат предпо-

ложению об аллельной природе этих двух заболеваний (Toda

et al., 1995).

Дальнейший генетический анализ, выполненный с ис-

пользованием техники микросателлитного картирования,

позволил сузить область локализации гена FCMD до менее

чем 100 кб. Кандидатным для FCMD рассматривается в на-

стоящее время расположенный в той же области ген мышеч-

ной рецепторной тирозинкиназы — MUSC (muscle specific

kinase) (Toda et al., 1996). Впервые гомолог этого гена —

MuSC — был идентифицирован у мышей (Valenzuela et al.,

1995). Показано, что MuSC специфическим образом экспрес-

сируется в скелетных мышцах и в нейромышечных соедине-

ниях. При разрушении этого гена путем трансгеноза у мы-

шей не формируются нейромышечные синапсы (DeChiara et

al., 1996). Предполагается, что кодируемая геном MUSC ре-

цепторная тирозинкиназа является критическим сигналом для

агрина, участвующего в активации всех ступеней каскада,

ведущего к образованию синапса, включая организацию пост-

синаптической мембраны, синапс-специфическую транскрип-

цию и пресинаптическую дифференцировку.

1.3. Конечностно-поясные

мышечные дистрофии

Это гетерогенная группа заболеваний с преиму-

щественной локализацией дистрофического процесса в

мышцах плечевого и тазового пояса. Выделяют следующие

клинические типы: тазобедренный Лейдена-Мёбиуса;

лопаточно-бедренный Эрба; поздний аутосомно-

доминантный и квадрицепс-миопатию (Вельтищев и др.

1998). Описана также необычная форма аутосомно-

рецессивной мышечной дистрофии плечевого и тазового

пояса в сочетании с буллезным эпидермолизом.

а) Миодистрофия конечностно-поясная аутосомно-

доминантная, типы: 1A(MIM:159100); 1В; 1С;

аутосомно-рецессивная, типы: 2А (MIM-.253600);

2В (MIM:253601); 2С (MIM:253700); 2D (ОМ1М:600119);

2Е (OMIM:600900); 2F (OMIM: 601400)

Заболевание начинается в юношеском возрасте с

11—20 лет, возможно и более раннее начало. Мышечная

слабость, утомляемость равиваются постепенно, поэтому

точно определить дебют заболевания не всегда удается.

Слабость сочетается с симметричными атрофиями мышц

тазового пояса. Больные начинают испытывать затрудне-

ния при беге, быстрой ходьбе, прыжках. Ограничение дви-

гательных возможностей начинает выделять их из группы

сверстников. Это особенно отчетливо выявляется на за-

нятиях физкультурой в школе. В дальнейшем появляются

затруднения при подъеме на лестницу, вставании со стула

и особенно с пола. Появляются так называемые вспомо-

гательные движения, меняющие формулу нормального дви-

гательного акта. Начинаясь с тазового пояса и ног, мышеч-

ная слабость распространяется на плечевой пояс и туло-

вище. Меняется осанка, опускаются надплечья, появляют-

ся «крыловидные» лопатки. Туловище отклоняется назад,

усиливается поясничный лордоз, выпячивается живот, по-

является «осиная» талия. Больной ходит раскачиваясь из

стороны в сторону, с трудом отрывая стопы от пола. Рань-

ше других атрофируются поясничные и ягодичные мышцы,

четырехглавая мышца бедра. Псевдогипертрофии, если и

бывают, то не столь выраженными, как при форме Дюшенна.

Лицевая мускулатура обычно не страдает. Сухожильные и

периостальные рефлексы снижаются, а затем полностью ис-

чезают. Снижение рефлексов начинается с коленных, а за-

тем с двуглавых мышц. Дистальные отделы конечностей еще

долго сохраняют свои функции. Течение заболевания про-

грессирующее, менее злокачественное по сравнению с

миодистрофией Дюшенна. Способность к самостоятельно-

му передвижению может сохраняться до 20—30 лет.

1. Общая генетическая характеристика

LGMD — (limb-girdle muscular dystrophy) — гетероген-

ная группа заболеваний с варьирующей экспрессивностью

мутантного гена. В настоящее время идентифицированы три

аутосомно-доминантных формы заболевания: LGMD1A —

LGMD1C и шесть аутосомно-рецессивных форм: LGMD2A —

LGMD2F (Bushby et al., 1995; Van der Kooi et al.,1997; Bashir

et al., 1998). Форма 1A связана с геном, расположенным в

длинном плече хромосомы 5 в области 5q22.3-31.3 (Speer et

al., 1992). Активно обсуждается возможность участия в кон-

троле этого заболевания гена LMNB1, расположенного в той

же цитогенетической области и кодирующего один из белков

семейства ядерных ламинов — В1. Ген, ответственный за мио-

дистрофию LGMD1B, ассоциированную с кардиологическими

дефектами, расположен в длинном плече хромосомы 1 — в

области 1q11-q22 (van der Kooi et al., 1997). В этой же области

локализован ген LMNA, кодирующий две другие альтернативно

сплайсирующиеся изоформы ядерных ламинов А и С. Показа-

но, что ген LMNA дефектен при аутосомно-доминантной фор-

ме мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса (Bonne et. AL,

1999).Несмотря на выраженные клинические различия между

этими двумя заболеваниями (отсутствие контрактур и преиму-

щественная слабость проксимальных отделов конечностей при

обсуждаемой форме конечностно-поясной миодистрофии), не

исключена их аллельная природа.Третья аутосомно-доминант-

ная форма миодистрофии плечевого и тазового пояса LGMD1С

обусловлена мутациями в гене кавеолина-3 (CAV3), располо-

женном в области Зр25 (Minetti et al., 1998).

Пациенты с аутосомно-рецессивными формами

LGMD2A и LGMD2B имеют мягкий фенотип и часто клиниче-

ски могут быть отнесены к типу Эрба. Форма 2А связана с

мутациями в гене CAPN3, расположенном в длинном плече

хромосомы 15. CAPN3 кодирует одну из субъединиц специ-

фической мышечной протеазы — кальпаина-3. Форма 2В ока-

залась аллельным вариантом миопатии Миоши и обусловле-

на мутациями в гене DYSF, локализованном в коротком плече

хромосомы 2. Продукт этого гена — дисферлин, являющийся

цитоплазматическим белком, способным связываться с эндо-

или саркоплазматическим ретикулумом, а также с ядерной мем-

браной. Гены, ответственные за более тяжелые формы ауто-

сомно-рецессивной конечностно-поясной миодистрофии

LGMD2C — LGMD2F, кодируют белки саркогликанового дистро-

фин-ассоциированного субкомплекса: у-, ос-, р- и 6-саркоглика-

ны, соответственно (Roberds et al., 1994; Lim et al., 1995;

Bonnemann et al., 1995; Noguchi et al., 1995; Nigro et al., 1996b).

При исследовании бразильских семей с аутосомно-ре-

цессивными формами тазово-поясной мышечной дистрофии,

в каждой из которых наблюдали не менее 3 пациентов, в 33%

семей болезнь была обусловлена мутациями в гене кальпаи-

на 3 (форма 2А), в 33% — в гене дисферлина (форма 2В), в

17% — в гене ос-саркогликана (форма 2D), в 10% семей — в

гене усаркогликана (форма 2С) (Passos-Bueno et al., 1996а).

Следует подчеркнуть, что дифференциальная диагностика раз-

личных генетических форм конечностно-поясных и аутосомно-

рецессивных дюшенно-подобных форм миодистрофии возможна

в настоящее время только на базе молекулярного анализа.

Генетическое разнообразие конечностно-поясных миоди-

строфии, по-видимому, не ограничивается описанными выше

формами. Так, на основании анализа большой финской семьи,

в которой одновременно наблюдали больных с двумя различ-

ными формами заболевания — тяжелой конечностно-поясной

и мягкой дистальной миопатией с поздним началом, высказано

предположение, что в первом случае это результат проявления

доминантного гена в гомозиготном, а во втором случае — в

гетерозиготном состоянии (Udd et al., 1992). Остановимся бо-

лее подробно на тех формах миодистрофии плечевого и тазо-

вого пояса, для которых гены уже идентифицированы.

2. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомно-

доминантная. форма LGMD1C

Мы уже упоминали о том, что форма LGMD1С обуслов-

лена мутациями в гене кавеолина-3 (CAV3), расположенном

в коротком плече хромосомы 3 (Minetti et al., 1998). Кавео-