Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

Наиболее частый тип мутаций в гене STA у пациентов с

миодистрофией Эмери-Дрейфуса — небольшие внутриген-

ные структурные перестройки. Идентифицированы также и

протяженные делеций, включающие целиком ген эмерина

(Small et al., 1998). Все описанные к настоящему времени

мутации приводят либо к полному отсутствию, либо к обра-

зованию укороченного продукта STA-гена вследствие преж-

девременной терминации трансляции. Содержание эмерина

у женщин носительниц мутаций в гене STA часто значимо

отклоняется от 50%, что свидетельствует о разном уровне экс-

прессии нормальных и мутантных аллелей (Manilal et al., 1998).

Полное секвенирование насыщенного кодирующими

последовательностями 219-кб района Xq28 между локусами

цветовой слепоты (RCP/GCP) и глюкозо-6-фосфат-

дегидрогеназы (G6PD) (Chen et al., 1996) позволило расшиф-

ровать молекулярный механизм возникновения делеций все-

го гена STA, идентифицированной у одного из пациентов с

мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса (Small et al., 1997).

В непосредственной близости от STA со стороны центроме-

ры расположен 26-кб филаминовый ген (FLN1), разделенный

на 48 экзонов и кодирующий актин-связывающий белок 280.

Фланкируют этот 48-кб FLNI/STA-район два больших инвер-

тированных повтора размером 11.3 кб. Уровень гомологии

между этими повторами превосходит 99%. Оказалось, что

причиной возникновения делеций является ошибочное спа-

ривание между большими инвертированными повторами с

последующей двойной рекомбинацией между рядом ошибоч-

но спаренных повторов и внутренними последовательностя-

ми ДНК. Более частым следствием этих событий является

инверсия FLN1/STA области, присутствующая в гетерозигот-

ном состоянии у 33% женщин. Внутрихроматидная рекомби-

нация вследствие неправильного спаривания двух инверти-

рованных повторов служит причиной возникновения частых

инверсий, зарегистрированных также при тяжелых формах

гемофилии А и синдрома Хантера (Lakich et al., 1993;

Lagerstedt et al., 1997).

111

4. Структура и функции эмерина

Ген STA кодирует серин-богатый белок, состоящий из

254 аминокислот, для которого не найдено гомологов сре-

ди других белков с известными функциями. Так как это

новый белок, авторы предложили называть его эмерином.

Два района эмерина — 39 аминокислот на N-конце и 34 —

на С-конце, обнаруживают сходство (41% гомологии) с

белками неизвестной функции — тимопоиетинами, что, в

свою очередь, обусловливает и некоторые его структур-

ные особенности. Кроме того, обнаружено сходство по

аминокислотной последовательности эмерина с ядерным

ламина-ассоциированным белком — LAP2 (Furukawa et al.,

1995). В целом белок гидрофильный, но имеет на С-конце

гидрофобный домен достаточной протяженности, чтобы

служить в качестве мембранного якоря. В эмерине при-

сутствует большое количество сайтов фосфорилирования

и только один возможный сайт N-гликозилирования. Сиг-

нального пептида не обнаружено. Идентифицирована так-

же и RGD-последовательность (аргинил-глицил-аспартил —

мотив клеточной адгезии), важная для взаимодействий

между белками внеклеточного матрикса. По-видимому,

эмерин может быть мембранным белком с коротким отри-

цательно заряженным С-хвостом и большим N-терминаль-

ным цитозольным доменом. Подобные белки, способные

заякореваться хвостовой частью на мембранах, обнару-

жены в различных клеточных компартментах. В том числе

большое количество таких белков (синаптобревин, синтак-

сины) присутствует в органеллах секреторного пути, вовле-

ченного в транспорт везикул. При биохимическом фрак-

ционировании показано полное отсутствие эмерина в рас-

творимых фракциях. Это согласуется с предположением о

том, что эмерин является одним из членов семейства ядер-

ных мембранных ламина-ассоциированных белков (LAPs).

На рис. 14 схематически представлена организация эме-

рина и тимопоэтинов на ядерной мембране. Показано, что

эмерин ассоциирован с внутренней мембраной ядер и эта

112

связь осуществляется посредством С-терминального гид-

рофобного домена (Cartegni et al., 1997).

Рис. 14. Организация эмерина и тимопоэтинов

на ядерной мембране

Большой фрагмент кДНК гена STA был введен в экс-

прессионную систему Е. coli, и продукт этой конструкции был

использован в качестве иммуногена для получения панели

из 12 моноклональных антител, реагирующих по крайней мере

с 4 различными антигенными детерминантами гидрофильно-

го района эмерина (Manilal et al., 1996). Во всех исследован-

ных тканях все варианты антител идентифицировали один и

тот же 34-кД белок, локализованный по краям ядер. В био-

8 Заказ № 170

113

птатах мышц пациентов с мышечной дистрофией Эмери-Дрей-

фуса этот белок не мог быть обнаружен ни методами имму-

ногистохимии, включая иммунофлюоресцентную микроско-

пию, ни с использованием метода Вестерн блот-гибриди-

зации. Таким образом, при наличии соответствующих ан-

тител иммунологические методы могут быть использова-

ны в качестве наиболее простых диагностических тестов

для данного заболевания. В сердце и в культивируемых кар-

диомиоцитах эмерин обнаруживается также в интеркаляр-

ных дисках.

5. Лопаточно-перонеальные синдромы (SP- синдромы)

Нередко пациентам с доброкачественным течением

миодистрофии ошибочно ставится диагноз лопаточно-перо-

неального синдрома или плече-перонеальной миопатии. Это

гетерогенная группа аутосомно-доминантных нейро-мышеч-

ных заболеваний, характеризующихся слабостью мышц пле-

чевого пояса и перонеальной мускулатуры. Клинически вы-

деляют две формы — нейрогенную (лопаточно-перонеальная

спинальная мышечная атрофия MIM: 181405, ген SPSMA) и

первично мышечную (лопаточно-перонеальная мышечная

дистрофия MIM: 181430, ген SPMD). Локус SPMD картиро-

ван в длинном плече хромосомы 12 (Wilhelmsen et al., 1996).

При генетическом анализе большой семьи с аутосомно-до-

минантной нейрогенной формой лопаточно-перонеального

синдрома ген SPSMA был картирован в области 12q24.1-

q24.31, примерно на 20 сМ ближе к теломере по сравнению с

локусом SPMD (Isozumi etal., 1996). Определен 19-сМ интер-

вал наиболее вероятной локализации гена между маркера-

ми D12S338 и D12S366, что является предпосылкой для иден-

тификации гена SPSMA методами позиционного клонирова-

ния. Антиципация по дебюту и тяжести течения заболевания,

наблюдаемая в исследуемой родословной, дает основания

предполагать возможное участие динамических мутаций в

генетическом контроле данного состояния. В непосредствен-

ной близости от области локализации гена SPSMA картиро-

114

ван ген SCA2, ответственный за одну из форм спиноцере-

беллярной атаксии, обусловленной экспансией внутриген-

ного CAG-повтора. В области поиска SPSMA локализова-

ны следующие гены: NOS1, продуктом которого является

нейротрансмиттер, участвующий в образовании окиси азо-

та и играющий важную роль в морфо- и синаптогенезе нерв-

ной системы; АТР5В, кодирующий АТФ-синтазу; АТР2А2/

АТР2В, кодирующий Са

-зависимую АТФазу; MYL2, коди-

рующий легкую цепь 2 миозина. Эти гены рассматривают-

ся в качестве кандидатных для SPSMA.

Верификация диагноза миодистрофии Эмери-Дрейфу-

са в сомнительных случаях может быть достигнута только при

использовании иммунологических или молекулярно-генети-

ческих методов исследования. Однако необходимо иметь в

виду, что в ряде семей заболевание наследуется по аутосом-

но-рецессивному типу и не связано с дефектами эмерина.

Так, при полном секвенировании гена STA, выполненном у

пациентов из 17 семей с миодистрофией Эмери-Дрейфуса,

мутации не были обнаружены в трех семьях (Manilal et al.,

1998). При этом уровень эмерина у больных, принадлежа-

щих этим семьям, соответствовал норме.

б) Скапуло-илио-перонеальная атрофия с

кардиопатией (MIM: 181350)

Аутосомно-доминантная миодистрофия Эмери-Дрейфу-

са или скапуло-илио-перонеальная атрофия с кардиопатией

клинически не отличается от Х-сцепленной формы заболе-

вания. При генетическом анализе, выполненном с исполь-

зованием 280 высокоинформативных микросателлитных

маркеров в большой французской семье, насчитывающей

54 индивидуума, 17 из которых были больными, удалось кар-

тировать мутантный ген EDMD-AD (Emery-Dreifuss muscular

dystrophy — autosomal dominant) в области 1q11-q23 в 8-cM

интервале между маркерами D1S2346 и D1S2125 (Bonne et

al., 1999). Анализ гаплотипов по микросателлитным марке-

рам этого интервала, проведенный в четырех других семьях

115

с подобной формой миодистрофии Эмери-Дрейфуса, под-

твердил генетическую однородность исследуемой выбор-

ки больных.

Локализованный ранее в области 1q21.2-q21.3 ген

LMNA, кодирующий белки ядерной ламины — ламин А и С,

был исследован в качестве кандидатного гена для EDMD-AD.

С использованием методов прямого секвенирования двух

амплифицированных экзонов (1 и 7) и SSCP-анализа

остальных 10 экзонов были идентифицированы точечные

мутации в гене LMNA у пациентов всех пяти отобранных

семей, причем эти мутации отсутствовали у их здоровых

родственников. Одна из этих мутаций создавала

преждевременный стоп-кодон, три другие сопровождались

заменой консервативных аминокислот. При этом одна из

миссенс-мутаций — R527P — независимо встретилась в двух

неродственных семьях. Таким образом была доказана

идентичность генов LMNA и EDMD-AD.

Ламины А и С, образующиеся в результате альтерна-

тивного сплайсинга первичного РНК-транскрипта гена

LMNA, относятся к семейству промежуточных филамент,

присутствующих в клетках на стадии конечной дифферен-

цировки. Они формируют часть ядерной ламины — фиб-

розный слой на нуклеоплазменной стороне внутренней

ядерной мембраны, служащей каркасом для ядерной обо-

лочки. Ламины имеют стержневой домен, участвующий в

образованиии димеров,и карбокси-терминальный глобу-

лярный домен.Они взаимодействуют с хроматином и ин-

тегральными белками внутренней ядерной мембраны, в том

числе с эмерином. При иммуногистохимическом анализе

биоптатов сердечной мышцы было показано, что локализа-

ция ламина. А/С и эмерина у больных в исследуемых семьях

не изменена. По-видимому, идентифицированные мутации в

гене LMNA не приводят к серьезным нарушениям структуры

ядерной оболочки, но изменяют ее функции.

Ранее при генетическом анализе, выполненном в трех

семьях с аутосомно-доминантной конечностно-поясной ми-

116

одистрофией, ассоциированной с кардиопатией (LGMD1B),

мутантный ген был картирован в той же области 1q11-q22,

где расположен ген LMNA (van der Kooi et al., 1997). Несмот-

ря на значительные клинические отличия конечностно-пояс-

ной миодистрофии 1В от аутосомно-доминантной миодист-

рофии Эмери-Дрейфуса, выражающиеся в отсутствии кон-

трактур и гипертрофии икроножных мышц, а также в преиму-

щественной слабости проксимальных отделов конечностей,

не исключена аллельная природа этих заболеваний и воз-

можность участия в патогенезе LGMD1B каких-то иных спе-

цифических мутаций в гене LMNA. Возможно также, что еще

одна форма аутосомно-доминантной конечностно-поясной

миодистрофии- 1А-связана с мутациями в гене LMNB1, ко-

дирующим другой компонент ядерной ламины — ламин В1,

так как мутантный ген LGMD1А картируется в той же области

5q22.3-31.3 длинного плеча хромосомы 5, где расположен ген

LMNB1. Конечно, эти предположения требуют эксперимен-

тального подтверждения. Однако очевидно, что компоненты

ядерной мембраны вносят определенный вклад в патогенез

некоторых нейромышечных заболеваний.

1.6. Врожденные непрогрессирующие

миопатии

В самостоятельную клиническую группу традиционно

выделяют врожденные непрогрессирующие миопатии. Две из

них обусловлены дефектами белков базальной ламины. При

врожденных миопатиях дефектными, как правило, оказыва-

ются гены, экспрессирующиеся в раннем эмбриогенезе и

кодирующие белки, участвующие в процессах роста, диффе-

ренцировки и пролиферации миобластов. Примерно в поло-

вине случаев врожденных аутосомно-рецессивных мышеч-

ных дистрофий с ранним дебютом у больных обнаруживает-

ся недостаточность по а2-цепи ламинина 2 (мерозина), лока-

лизованного в базальной мембране поперечно-полосатых

мышц и связанного с цитоскелетом клетки через комплекс

дистрофин-ассоциированных белков. В некоторых случаях это

117

снижение является вторичным, как например при миодист-

рофии Фукуяма. Мутации в гене ламинина 2 приводят к раз-

витию врожденной мерозин-дефицитной миодистрофии, со-

четающейся с гипомиелинизацией белого вещества мозга.

Еще одна редкая форма непрогрессирующей врожденной

миопатии вызвана наследственной недостаточностью рецеп-

тора ламинина в мышцах — а7 интегрина (31D.

Мы уже упоминали о том, что патологические процес-

сы при некоторых врожденных миопатиях сопровождаются

образованием в клетках гистологически идентифицируемых

аномалий. Так, при немалиновой миопатии в мышечных клет-

ках пациентов присутствуют нитеобразные патологические

фибриллярные структуры, причиной развития которых явля-

ется латеральная экспансия Z-дисков. Эта экспансия при

различных формах немалиновой миопатии может возникать

вследствие нарушений в структуре интегральных белков тон-

ких филамент, таких как небулин и актин, а также других вза-

имодействующих с ними белков, в первую очередь тропоми-

озина В. Определенные гистологические аномалии в мышеч-

ных клетках характерны также для пациентов с болезнью

центрального стержня и с миотубулярной миопатией. В обо-

их случаях дефектными оказываются белки, участвующие в

контроле дифференцировки мышечных волокон. Различные

варианты еще одной врожденной миопатии Бетлема обуслов-

лены дефектной структурой микрофибриллярного коллагена

VI типа, оказывающего влияние как на процессы дифферен-

цировки миобластов, так и на структурную организацию вне-

клеточного матрикса.

а) Мышечная дистрофия врожденная мерозин-

дефицитная (MIM: 156225)

В «классическом» варианте мерозин-дефицитной мио-

патии клинические проявления ограничиваются только ске-

летными мышцами без каких-либо симптомов поражения цен-

тральной нервной системы, хотя при магнитно-резонансной

томографии выявляются изменения в белом веществе моз-

118

га, обусловленные гипомиелинизацией (Banker, 1994; Mercuri

et al., 1995). Болезнь проявляется в виде мышечной слабос-

ти, гипотонии, задержки моторного развития. Дети поздно на-

чинают садиться и ходить, при этом оказываются не способ-

ны передвигаться по неровной местности и на большие рас-

стояния без посторонней помощи. В сыворотке крови наблю-

дается повышенное содержание креатинкиназы. В биопта-

тах мышц больных отмечаются гистологические аномалии,

свидетельствующие об умеренном течении дистрофическо-

го процесса.

Ламинин-2 преимущественно локализован в базальной

мембране поперечно-полосатых мышц. Он состоит из тяже-

лой ос2 цепи и двух легких цепей (J1 и у1, кодируемых разны-

ми генами. Ламинин-2 экспрессируется достаточно поздно в

эмбриогенезе и на более ранних стадиях его функции, по-

видимому, выполняет ламинин-1. Ламинин-2 является есте-

ственным лигандом для а-дистрогликана. Зрелая а-цепь ла-

минина-2 состоит из 3088 аминокислотных остатков, сигналь-

ный пептид содержит 22 аминокислоты (Vuolteenaho et al.,

1994). При некоторых формах врожденных мышечных дис-

трофий содержание ламинина-2 в скелетных мышцах и в пе-

риферических нервах резко снижено. В некоторых случаях

это снижение является вторичным.

При исследовании 20 семей с врожденной аутосомно-

рецессивной миодистрофией, не относящейся к типу Фукуя-

ма, в 13 было обнаружено полное отсутствие ламинина-2

(Hillaire et al., 1994). Последующий генетический анализ, про-

веденный в этих мерозин-дефицитных семьях, с использо-

ванием метода картирования у пациентов областей генома,

гомозиготных по высокополиморфным микросателлитным

маркерам, показал, что мутантный ген, ответственный за

данную форму врожденной миодистрофии, локализован в той

же области 6q22, где расположен ген LAMA2 (laminin alpha

2). В дальнейшем локализация гена LAMA2 в области 6q22-

q23 была подтверждена многими методами, включая метод

флюоресцентной гибридизации in situ (Vuolteenaho etal., 1994).

119

LAMA2 — это очень крупный ген, занимающий 260 кб

геномной ДНК. Его кодирующая часть разделена на 64 экзо-

на, два из которых очень маленькие — 6 и 12 п.о. (Zhang et

al., 1996). Идентификация специфических мутаций в гене

LAMA2 у пациентов явилась окончательным доказательством

его причастности к развитию болезни (Helbling-Leclerc et al.,

1995; Nissenen et al., 1996; Allamand et al., 1997). Различные

мутации в гене LAMA2 могут приводить к разным клиничес-

ким формам заболевания от тяжелых, при которых ламинин-

2 полностью отсутствует, до промежуточных и мягких, при

которых наблюдается количественное снижение белка или

присутствуют его дефектные варианты. Так, у двух родствен-

ных пациентов с мягким течением врожденной мышечной

дистрофии обнаружена сплайсинговая мутация, сопровож-

дающаяся делецией 63 аминокислот в IV домене белка. Этот

домен ответственен за формирование глобулярной структу-

ры на коротком плече сс2-цепи ламинина-2, отсутствие кото-

рой, по-видимому, сопровождается разрушением ламининовой

сети в мышечных мембранах и нарушением связи белка с дис-

трофин-гликопротеиновым комплексом (Allamand et al., 1997).

При молекулярном обследовании родственников боль-

ных с мерозин-дефицитной миодистрофией выявляется до-

стоверное превышение гетерозиготных носителей мутаций в

гене LAMA2. Для объяснения наблюдаемого преимущества

гетерозигот привлекается гипотеза отбора, происходящего

либо на уровне гамет, либо среди ранних зародышей на до-

имплантационной стадии развития.

Мутация в гомологичном гене Lama2, кодирующем а2-

цепь ламинина мышей, описана у животных генетической

линии dy2j с мягкими проявлениями мышечной дистрофии

(Xu et al., 1994). Эта

ЛИНИЯ

является

одним из

аллельных

ва-

риантов классической линии мышей с врожденной мышеч-

ной дистрофией — dy, впервые описанной почти 40 лет на-

зад. Показано, что молекулярной основой наблюдаемого

фенотипа в линии dy2j является нарушение процесса сплай-

синга первичного РНК транскрипта Lama2 и трансляция по-

120