Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

epidermolis bullosa simplex). Пузыри появляются в неонаталь-

ном периоде, особенно на коже пальцев рук и ног, позднее —

на волосистой части головы, лице и туловище. При этом ва-

рианте буллезного эпидермолиза кожные трещины располо-

жены очень близко к плазматической мембране базальных

кератиноцитов, что затрудняет установление природы дефек-

та (внутриклеточный? внеклеточный?) путем электронно-ми-

кроскопического исследования биопсийного материала. С

возрастом развивается дистрофия ногтей. Прогрессирующая

мышечная слабость дебютирует в возрасте 1—2 лет. Боль-

ные могут доживать до 30—40 лет.

Характер локализации и широкий спектр дефектов, на-

блюдаемых у больных с буллезным эпидермолизом, сочета-

ющимся с мышечной дистрофией, дали основание предполо-

жить, что первичное биохимическое нарушение при этом

заболевании связано с каким-то промежуточным структур-

ным белком, ассоциированным с филаментами. В качестве

такого кандидата был исследован плектин — ассоциирован-

ный с промежуточными филаментами большой якорный бе-

лок, соединяющий цитоскелет клетки с мембраной. Плектин

является критическим белком для связывания кератиновой

филаментной сети с гемидесмосомальными комплексами.

Оказалось, что у исследуемых пациентов в образцах

кожи и мышечной ткани полностью отсутствуют иммуноре-

активные формы плектина (Gache et al., 1996; Smith et al.,

1996). Кроме того, у больных отсутствует близкородственный

плектину гемидесмосомальный белок HD1, экспрессирующий-

ся в норме также и в Z-дисках скелетных мышц. Изоляция и

секвенироваие кДНКовой последовательности гена плекти-

на крысы позволила провести скрининг банка данных экс-

прессирующихся последовательностей ДНК человека. Одна

из таких последовательностей EST 25263 имела 84% гомо-

логии с кДНК плектина крысы. Олигонуклеотидные прайме-

ры, соответствующие этой EST-последовательности, были

использованы для скрининга панели монохромосомных, а

затем делеционно-транслокационных соматических гибрид-

101

ных клонов. Таким образом, ген плектина человека — PLEC1

(plectin 1) был картирован в длинном плече хромосомы 8 в

области 8q24.13-qter. Методами генетического анализа было

показано, что во всех исследованных семьях заболевание

косегрегирует с полиморфными маркерами этой области.

Сходная ПЦР-стратегия была использована для изоляции из

библиотеки кератиноцитов человека полноразмерной кДНК,

а затем и геномной последовательности гена PLEC1.

У одного из пациентов с описываемой формой мышеч-

ной дистрофии удалось идентифицировать гомозиготную дуп-

ликацию 8 нуклеотидов в кодирующей части гена плектина.

Эта дупликация приводила к сдвигу рамки считывания и об-

разованию преждевременного терминирующего кодона. У

аналогичных больных из двух других семей были идентифи-

цированы две различные гомозиготные делеции в гене плек-

тина, одна из которых 2719del9 приводит к отсутствию трех

аминокислот в консервативной части гена, и другая — 5866С

сопровождается сдвигом рамки считывания. Обнаружение у

пациентов с буллезным эпидермолизом, сочетающимся с

мышечной дистрофией, дупликаций и делеций в кодирующей

части гена PLEC1 явилось подтверждением гипотезы о том,

что именно этот ген мутантен при данном заболевании

(Pulkkinen et al., 1996). Таким образом, потеря экспрессии

одного мультифункционального белка, каким является плек-

тин, может одновременно приводить к развитию дефектов в

мышечной и кожной тканях.

1.4. Лице-лопаточно-плечевая мышечная

дистрофия Ландузи-Дежерина (MIM: 158900)

Первые признаки болезни появляются в 12—20 лет,

хотя не исключается возможность более раннего проявле-

ния. Данную клиническую форму отличает своеобразная фор-

мула поражения мышечной системы. Преимущественно по-

ражается мускулатура лица, плечевого пояса и проксималь-

ных отделов верхних конечностей. Слабость мускулатуры

лица проявляется неполным смыканием век, которое можно

102

заметить в начале болезни во время сна. Мимика лица ста-

новится бедной лицо приобретает «маскообразный» вид.

Больной испытывает затруднения при наморщивании лба, за-

жмуривании глаз. Из-за слабости круговой мышцы рта и дру-

гих мимических мышц невозможен свист, надувание щек и

другие мимические движения. Особый порядок вовлечения

в процесс мускулатуры плечевого пояса приводит к появле-

нию симптома «крыловидных» лопаток. Раньше других пора-

жаются трапециевидные, ромбовидные, грудные и широчай-

шие мышцы спины. Длительное время сохраняется функция

дельтовидных, над- и подкостных мышц, мышц, поднимающих

лопатки. Плечевой пояс поражается раньше и более значи-

тельно, мускулатура тазового пояса и проксимальных отде-

лов нижних конечностей включается позже. От начала появ-

ления слабости плечевого пояса до развития слабости ног

может пройти 15—20 лет. На нижних конечностях страдают

подвздошные, большие ягодичные, приводящие мышцы бе-

дер. Икроножные мышцы остаются сохранными. Следует под-

черкнуть, что нижние конечности вообще могут остаться ин-

тактными. Псевдогипертрофии не характерны для этой фор-

мы миодистрофии. Течение заболевания относительно бла-

гоприятное. Больные долгое время сохраняют способность к

самообслуживанию и трудовой деятельности.

Распространенность миодистрофии Ландузи-Дежерина

составляет примерно 2:100000, тип наследования — аутосом-

но-доминантный. По некоторым данным, женщины болеют

примерно в три раза чаще мужчин. В ряде бразильских се-

мей с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией прослеже-

на антиципация (Zatz et al., 1995).

При генетическом анализе семей с мышечной дистро-

фией Ландузи-Дежерина было обнаружено сцепление мутант-

ного гена FSHD1 (facioscapulohumeral dystrophy 1) с микро-

сателлитным маркером Mfd22 — локус D4S171 (Wijmenga et

al., 1990), а также с гипервариабельным ДНК-зондом рНЗО —

локус D4S139 (Upadhyayava et al., 1991), картированными в

дистальном конце длинного плеча хромосомы 4 в области

103

4q35-qter. Локализация гена FSHD1 в районе 4q35 была под-

тверждена при анализе точек разрыва транслокации (Х;4),

обнаруженной у пациента 4 лет со слабостью лицевых мышц

(Mathews et al., 1991). Совместные исследования, выполнен-

ные несколькими лабораториями на 65 семьях, в которых

наблюдали более 500 больных, также подтвердили сцепле-

ние гена FSHD1 с ДНК-маркерами области 4q35 (Sarfarazi et

al., 1992). При этом все сцепленные ДНК-маркеры оказались

локализованы проксимальнее гена FSHD1, за исключением,

возможно, D4S139, для которого найдено наиболее тесное

сцепление с исследуемым геном. Обнаружение в области

локализации мутантного гена большого числа полиморфных

ДНК-маркеров позволяет проводить досимптоматическую и

пренатальную диагностику лице-лопаточно-плечевой миоди-

строфии типа IA в семьях высокого риска. Особенно эффек-

тивным при этом оказывается анализ микросателлитных по-

лиморфных маркеров D4S139, D4S163, D4S171 и D4S809.

У пациентов часто присутствуют структурные перест-

ройки в дистальной части 4q, легкодиагностируемые мето-

дом блот-гибридизации по Саузерну (Wijmenga et al., 1992).

Используемая при этом в качестве зонда ДНК, клонирован-

ная в космидном векторе р13Е-11, локализована дистальнее

D4S139. Примечательно, что эта ДНК была изолирована в

процессе поиска гомеобоксных генов. У нормальных инди-

видуумов клон гибридизуется с полиморфным EcoR1 фраг-

ментом, размер которого обычно превышает 28 кб. У паци-

ентов чаще обнаруживают более короткие EcoR1 фрагмен-

ты, величиной от 14 до 28 кб. Не исключено, что, в отличие от

синдрома Мартина-Белл или миотонической дистрофии, обус-

ловленных экспансией тринуклеотидных тандемных повторов,

наследственный дефект у этих больных связан с сокращени-

ем числа подобных последовательностей, тесно сцепленных

или расположенных внутри гена FSHD1. Обсуждается воз-

можность участия гомеобоксного гена или генов в контроле

заболевания. До сих пор было известно, что мутации в го-

меобоксных генах вызывают врожденные уродства. Если ока-

104

жется, что лице-лопаточно-плечевая миодистрофия есть ре-

зультат перестроек в гомеобоксном гене, это будет первый

пример фенотипического проявления в позднем онтогенезе

гена, участвующего в контроле развития.

В области 4q35 идентифицирован 3.3-кб тандемный

повтор D4Z4, тесно сцепленный с геном FSHD1 (Hewitt et al.,

1994). Каждая копия этого повтора содержит две гомеобокс-

ные последовательности с внутренними стоп-кодонами и

сдвигами рамки считывания и два известных повторяющих-

ся элемента (LSau и hhspm3), связанных с гетерохроматино-

выми районами ДНК, часто вовлеченными в контроль «эф-

фекта положения». Показано, что число копий на геном D4Z4-

подобных повторов заметно увеличилось в эволюционном

ряду на протяжении последних 25 миллионов лет. Хотя D4Z4

не является кодирующей последовательностью и не содер-

жит фрагментов гена FSHD1, выявленная корреляция меж-

ду делециями в этом локусе и болезнью позволяет предпола-

гать участие «эффекта положения» в патогенезе лице-лопа-

точно-плечевой миодистрофии. Однако этот эффект не про-

слеживается для единственного пока гена (FRG1), иденти-

фицированного в теломерном районе длинного плеча хро-

мосомы 4 (van Deutekom et al., 1996a).

В области 10q26 также расположен повтор, имеющий

высокую степень гомологии cD4Z4. Наличие подобных гомо-

логичных повторов является причиной высокой нестабиль-

ности субтеломерных районов длинного плеча хромосом 4 и

10. Так, в датской популяции в 20% случаев обнаруживаются

микроперестройки между повторяющимися элементами этих

двух областей (van Deutekom et al., 1996b). Перестройки со-

здают новые рестрикционные сайты, что необходимо учиты-

вать при проведении диагностики заболевания методом ана-

лиза длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Микропе-

рестройки между повторяющимися последовательностями

областей 4q35 и 10q26 часто обнаруживаются и у пациентов

с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией. Молекулярный

анализ области локализации FSHD1 гена, проведенный у трех

105

пациентов,показал наличие гибридных кластеров 4q35- и

10д26-производных повторяющихся элементов (Lemmers et

al., 1998). При популяционном анализе у двух неродствен-

ных индивидуумов в теломерной области длинного плеча хро-

мосомы 4 были обнаружены делеции хромосомного сегмен-

та, расположенного проксимальнее повторов и идентифици-

руемые зондом р13Е-11.Эти делеции не затрагивали локус

FSHD. Однако у одного из этих индивидуумов был ребенок с

лице-лопаточно-плечевой миодистрофией. Оказалось, что у

ребенка произошла экспансия унаследованной от отца деле-

ции в область повторов. Эти данные согласуются с гипотезой

о критической роли эффекта положения в этиологии заболе-

вания и о влиянии длины и структуры повторов на экспрес-

сию соседних генов.

Описаны случаи гонадного мозаицизма у пациентов с

лице-лопаточно-плечевой миодистрофией (Weiffenbach etal.,

1993). В одной из семей диагноз лице-лопаточно-плечевой

миодистрофии был поставлен лишь одному из монозиготных

близнецов (Tawil et al., 1993). При этом никто из его родст-

венников не был болен, у самого же пациента диагноз был

подтвержден на молекулярном уровне после обнаружения

уникальной перестройки в области 4q35. Наиболее вероят-

ное обьяснение этому — возникновение постзиготической

мутации в гене FSHD1 после образования близнецовой пары.

У одной из пациенток с четко прослеживаемой наслед-

ственной формой заболевания обнаружены аномалии про-

цесса окисления, связанные с дефектом комплекса III элек-

трон-транспортной цепи, кроме того, в печени не выявлялся

цитохром b — компонент комплекса III, при наличии типич-

ных пиков для всех других цитохромов (Slipetz et al., 1991).

Электронно-микроскопическое исследование печени паци-

ентки показало присутствие большого числа увеличенных

митохондрий с паракристаллическими включениями. При

этом делеций или других крупных структурных перестроек в

митохондриальной ДНК не обнаружено. Остается, однако,

неясным, являются ли выявленные аномалии окислительно-

106

го процесса типичными для лице-лопаточно-плечевой мио-

дистрофии.

Описана доминантно наследуемая лопаточно-плечевая

миодистрофия, дебютирующая в возрасте от 12 до 40 лет,

при которой не наблюдается поражения мускулатуры лица

(MIM 600416). Данные генетического анализа семей с подоб-

ной формой миодистрофии с использованием микросател-

литных маркеров, тесно сцепленных с геном FSHD1 (вклю-

чая маркер D4S139), не исключают возможности того, что

это заболевание является аллельным вариантом миодистро-

фии Ландузи-Дежерина (Jardine et al., 1994). И наоборот, в

некоторых семьях, клинически отнесенных к лице-лопаточ-

но-плечевой миодистрофии, при молекулярном анализе не

удается обнаружить сцепления мутантного гена с маркера-

ми дистального района длинного плеча хромосомы 4 (Gilbert

etal., 1993), что может рассматриваться как доказательство

генетической гетерогенности заболевания и существования

еще одного локуса, мутации в котором могут приводить к сход-

ной клинической картине.

1.5. Миодистрофии, обусловленные

дефектами белков ядерной ламины

(эмеринопатии)

В отдельную группу заболеваний мы выделили миопа-

тии, обусловленные дефектами белков, ассоциированных с

ядерной ламиной. Эти заболевания получили общее назва-

ние эмеринопатии. Эмерин — белок, ассоциированный с ла-

минином ядерной мембраны, оказывается дефектным при

Х-сцепленной форме мышечной дистрофии с контрактурами

Эмери-Дрейфуса. Более редкая аутосомно-доминантная

форма этого заболевания обусловлена дефектами в гене

LMNA, кодирующем два белка ядерной ламины — ламин А и

С. Эти белки являются продуктами альтернативного сплай-

синга гена LMNA, и они активно взаимодействуют с эмери-

ном. Не исключено, что аутосомно-доминантная форма мы-

107

шечной дистрофии Эмери-Дрейфуса является аллельным

вариантом одной из доминантных форм конечностно-пояс-

ной миодистрофии -LGMD1B, ген которой картирован в той

же области 1q11-q23, где расположен ген LMNA. Активно об-

суждается возможность участия гена LMNB1, кодирующего

еще один белок семейства ядерных ламинов — В1, в контро-

ле другой аутосомно-доминантной формы конечностно-пояс-

ной миодистрофии -LGMD1A, так как оба мутантных гена

расположены в одной и той же цитогенетической области

5q23.3-q31.3. Если эти предположения будут подтвержде-

ны, то формы 1А и1В аутосомно-доминантной конечност-

но-поясной миодистрофии также могут быть отнесены к

группе эмеринопатий.

а) Мышечная дистрофия с контрактурами, тип

Эмери-Дрейфуса, Х-сцепленная (MIM: 310300)

1. Клиническая характеристика заболевания

Начальные признаки заболевания отмечаются в воз-

расте 4—5 лет. Поражаются мышцы тазового пояса при ин-

тактности дистальных сегментов. Рано развиваются ретрак-

ции ахилловых сухожилий (и постцервикальных мышц), а в

последующем контрактуры в локтевых суставах. Псевдоги-

пертрофии отсутствуют. Нередко наблюдается кардиомипа-

тия с нарушением сердечной проводимости. Наиболее час-

тая причина летального исхода — остановка сердечной мыш-

цы. Заболевание отличается медленно прогрессирующим те-

чением. Тип наследования: Х-сцепленный рецессивный, хотя

описаны редкие случаи аутосомно-доминантного наследова-

ния. Клинически эти две генетически различные формы ми-

одистрофии очень сходны.

2. Картирование и идентификация гена EMD

При семейном генетическом анализе мутантный ген был

картирован в дистальной части длинного плеча Х-хромосо-

мы в области Xq28 (Thomas et al., 1986; Yates et al., 1986). В

дальнейшем было показано наиболее тесное сцепление EMD

108

(Emery-Dreifuss muscular dystrophy) с генами цветовой сле-

поты RCP/GCP, что позволило отнести кандидатный ген в те-

ломерный район Xq28. В результате одновременного гено-

типирования по нескольким маркерам этого района, прове-

денного в больших семьях с миодистрофией Эмери-Дрейфу-

са, и с учетом уже опубликованных данных была составлена

наиболее вероятная генетическая карта области локализа-

ции EMD: DXS52/DXS15 — 2сМ — (RCP/GCP, EMD) — ЗсМ —

F8C — 2сМ — DXS115 (Yates et al., 1993). Фрагменты геном-

ной ДНК, полностью перекрывающие район между DXS15 и

F8C, были клонированы в дрожжевых, а затем в космидных

векторах, что позволило составить физическую карту этой

геномной области, составляющей около 2 миллионов пар ос-

нований (Willard et al., 1994). Оказалось, что этот район ха-

рактеризуется чрезвычайно высокой плотностью генов, рас-

положенных в каждом из участков ДНК размером от 10 до

20 кб. Более 30 различных генов было картировано между

DXS15 и F8C (Bione et al., 1993). Обилие кодирующих после-

довательностей очень затрудняло идентификацию кандидат-

ного гена. Была определена группа генов, которые не только

картируются в этой области, но в норме экспрессируются в

тканях, дефектных при миодистрофии Эмери-Дрейфуса. Так,

для 27 генов, расположенных между DXS15 и F8C, был опре-

делен уровень мРНК транскриптов в различных дифферен-

цированных тканях. По результатам этих исследований было

отобрано 8 генов, для каждого из которых наблюдалась вы-

сокая экспрессия в скелетных мышцах, в сердце и/или в моз-

ге (Bione et al., 1993). Примечательно, что 7 из них были рас-

положены кластером на растоянии около 45 кб от генов цве-

товой слепоты, то есть в наиболее вероятном районе лока-

лизации EMD. Для каждого гена этой группы были секвени-

рованы полноразмерные кДНК и определены открытые рам-

ки считывания. Поиск кандидатного гена осуществляли ме-

тодом обратной ПЦР (RT-PCR), то есть проводили амплифи-

кацию и секвенирование кДНКовых последовательностей,

полученных путем обратной транскрипции мРНК больных.

109

мРНК изолировали из лимфобластозных культур клеток, по-

лученных от пяти неродственных мальчиков с Х-сцепленной

семейной формой миодистрофии Эмери-Дрейфуса. Во всех

этих случаях были обнаружены различные мутации в одном

и том же гене — STA (Bione et al., 1994). В двух культурах

были идентифицированы внутригенные делеции 2 и 29 пар

оснований, в одной — инсерция двух нуклеотидов. Эти три

мутации приводили к сдвигу рамки считывания, образованию

стоп-кодонов и преждевременной терминации трансляции. Одна

из мутаций нарушала сплайсинг первичного РНК-транскрипта

и приводила к инсерции в мРНК интронной области размером в

214 пар оснований. Пятая мутация — замена А на G, разруша-

ла инициирующий AUG-кодон. В этом случае трансляция начи-

налась со следующего AUG в положении 275. В результате про-

дуцировался белок с N-концевой делецией 72 аминокислот. Та-

ким образом, все идентифицированные мутации сопровожда-

лись либо полным отсутствием продукта STA-гена, либо от-

сутствием части этого белка. Полученные результаты дока-

зывают полную идентичность генов EMD и STA.

3. Структура гена STA и типы мутаций

Кодирующая часть гена STA разделена на 6 экзонов,

распределенных на площади около 2 кб. По-видимому, STA

относится к числу генов домашнего хозяйства (hause-keeping

genes), так как он экспрессируется в большом спектре про-

анализированных тканей на разных стадиях онтогенетичес-

кого развития. Наивысший уровень экспрессии наблюдается

в скелетных мышцах, в сердце и в ряде других тканей, вклю-

чая толстый кишечник, тестикулы, яичники, поджелудочную

железу. Отсутствие при миодистрофии Эмери-Дрейфуса кли-

нических нарушений во многих немышечных тканях с

высоким нормальным уровнем экспрессии STA, по-видимо-

му, свидетельствует о возможности тканеспецифической ком-

пенсации дефектов белкового продукта этого гена со сторо-

ны других функционально сходных белков.

110