Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

ретракции отсутствуют. Течение заболевания доброкачест-

венное, отмечены даже улучшения в виде нарастания мы-

шечной силы в юношеском возрасте. Витальный прогноз бла-

гоприятный. В ряде семей болезнь центрального стержня

сочетается со злокачественной гипертермией — аутосомно-

доминантно наследуемой повышенной чувствительностью к

анестезии, обусловленной, по-видимому, дефектами в сис-

теме окислительного фосфорилирования (Frank et al., 1978).

Злокачественная гипертермия, в свою очередь, часто соче-

тается с доминантно наследуемой миопатией, отличной от

болезни центрального стержня.

Семейный анализ сцепления заболевания с различны-

ми ДНК-маркерами позволил отнести мутантный ген CCD

(central core disease) в область 19q12-q13.2 (Haan etal., 1990;

Kaush et al., 1991). Было высказано предположение, что бо-

лезнь центрального стержня обусловлена мутациями в гене

рецептора-1 рианодина (RYR1 — ryanodine receptor 1), рас-

положенном в той же области генома (Mulley et al., 1993).

Это предположение было подтверждено при обнаружении

ряда мутаций в гене RYR1 у пациентов с болезнью централь-

ного стержня (Zhang et al., 1993; Quane et al., 1993). Таким

образом была доказана идентичность генов CCD и RYR1.

Рецептор рианодина — кальций-высвобождающий ка-

нал саркоплазматического ретикулума скелетных мышц (рис.

16). Рецептор рианодина необходим для развития и созрева-

ния мышц, а также его функции связаны с сокращением-рас-

слаблением миофибрилл. Трансгенные мыши с направленно

разрушенным геном Ryr1 погибают в перинатальном перио-

де и имеют значительные аномалии в развитии скелетных

мышц (Takeshima et al., 1994). ДНК-маркеры RYRI-гена ко-

сегерегируют с некоторыми формами злокачественной ги-

пертермии. Оказалось, что около 50% случаев злокачествен-

ной гипертермии являются аллельными вариантами болезни

центрального стержня и обусловлены различными миссенс-

мутациями в гене RYR1. Причем одна из этих мутаций —

R163C — встречалась у различных неродственных пациен-

131

тов, как с гипертермией, так и с болезнью центрального стерж-

ня, что указывает на возможность участия иных генетичес-

ких или средовых факторов в формировании подобной кли-

нической гетерогенности (Quane et al., 1993).

Рис. 16. Схема работы рецептора рианоцина

Некоторые пациенты с наследственной гипертрофиче-

ской кардиомиопатией, обусловленной мутациями в гене тя-

желой цепи р-миозина (MYH7), имеют выраженную мышеч-

ную слабость и гистологические аномалии, сходные с теми,

которые наблюдаются при болезни центрального стержня. У

одного из таких пациентов найдена миссенс-мутация — L908V

в гене MYH7, что доказывает возможность участия данного

гена в контроле некоторых форм болезни центрального стерж-

ня (Fananapazir et al., 1993).

д) Миотубулярная миопатия (MIM: 310400)

Данная форма врожденной миопатии отличается осо-

быми образованиями, выявляемыми гистологически и гис-

тохимически. Мышечные волокна в своей центральной час-

ти изменены, отличаются повышенной ферментативной ак-

тивностью и похожи на эмбриональные мышечные клетки. В

этом же отделе мышечного волокна обнаруживаются скоп-

ления мышечных ядер. Мышечные волокна уменьшены в раз-

132

мерах и отличаются повышенной активностью окислитель-

ных ферментов. Клинические проявления отмечаются с пер-

вых месяцев жизни в виде диффузной мышечной гипотонии,

атрофии и генерализованной слабости мышц. Глубокие ре-

флексы медленно снижаются. Течение, как правило, медленно

прогрессирующее, не исключена и стабилизация процесса.

Все это сближает клинические данные с таковыми при дру-

гих врожденных миопатиях. Однако следует отметить, что

заболевание имеет некоторые отличительные черты, способ-

ствующие клинической диагностике. К ним можно отнести

поражение глазодвигательных мышц, приводящее к косогла-

зию, и двусторонний, различной выраженности птоз. Миоту-

булярная миопатия — генетически гетерогенная группа кли-

нически сходных заболеваний.

В разных семьях прослеживается различный характер

наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессив-

ный и Х-сцепленный рецессивный. В последнем случае за-

болевание характеризуется ранним началом и более тяже-

лым течением. При рождении больного ребенка наблюдает-

ся снижение или отсутствие спонтанных движений и наруше-

ние дыхания вследствие задержки или остановки нормаль-

ного развития мышечных волокон. Болезнь проявляется уже

в пренатальном периоде и часто сопровождается многово-

дием и слабым шевелением плода. У облигатных гетерозигот

часто наблюдаются выкидыши и мертворождения. большин-

ство пациентов погибают от дыхательной недостаточности в

возрасте 4—5 месяцев. Некоторые мальчики доживают до

взрослого периода за счет лучшей респирации после рожде-

ния. Причины подобной клинической гетерогенности неизве-

стны.

Описана косегрегация сцепленной с полом миотубуляр-

ной миопатии с маркерами области Xq28, в том числе с ге-

ном фактора VIII свертывания крови — F8C (Thomas et al.,

1987; 1990). Ген МТМ1 (myotubular myopathy 1) локализован

проксимальнее F8C (Lehesjoki etal., 1990), ближайшими флан-

кирующими микросателлитными маркерами являются

133

DXS304 и DXS305 (Dhal et al., 1994). Маркеры DXS455 и

DXS1684 наиболее информативны для диагностики аллель-

ного состояния гена МТМ1. Открытию гена сцепленной с по-

лом миотубулярной миопатии способствовало описание па-

циентов, несущих микроделеции в области локализации этих

маркеров (Dhal et al., 1995). Так, обнаружение делеции у де-

вочки с относительно благоприятным течением миотубуляр-

ной миопатии позволило ограничить вероятный район лока-

лизации гена МТМ1 600 тысячами пар оснований. Затем при

идентификации точек разрыва перекрывающихся микроде-

леции у двух мальчиков, характеризующихся миотубулярной

миопатией и аномалиями полового развития, этот район в

проксимальной области Xq28 дистальнее маркера DXS304

был сужен до 430 кб (Ни et al., 1996). Полученные результаты

ПОЗВОЛИЛИ использовать стратегию позиционного клонирова-

ния для изоляции гена МТМ1. Фрагменты ДНК из области

перекрывания двух таких микроделеции были клонированы

в дрожжевых и космидных векторах (Laporte et al., 1996). Для

нахождения транскрибируемых последовательностей в кло-

нированных ДНК использовали три различных подхода: (1)

отбор из тканеспецифических библиотек генов кДНКовых

последовательностей, гибридизующихся с геномными марке-

рами, сцепленными с геном МТМ1, (2) улавливание экзонов

и (3) частичное секвенирование клонированных геномных

последовательностей с последующим компьютерным поиском

кодирующих областей. В результате было отобрано пять эк-

зонов и шесть кДНК-клонов, содержащих частично перекры-

вающиеся фрагменты ДНК. Кроме того, три района секвени-

рованных космидных последовательностей соответствовали

кодирующим областям ДНК. При сопоставлении мест лока-

лизации этих элементов был идентифицирован неизвестный

ранее ген — CG1, занимающий протяженную центральную

часть области перекрывания двух микроделеции. Этот ген

состоит из 7 экзонов и преимущественно экспрессируется в

скелетных мышцах; размер мРНК составляет 4.6 кб. CG1

рассматривался как наиболее вероятный кандидат для МТМ1.

134

Однако предположение не нашло подтверждения, так как ни

у одного из 28 пациентов с Х-сцепленной миотубулярной

миопатией мутаций в кодирующей части гена CG1 обнару-

жено не было. Возможно, этот ген является кандидатным для

каких-то других наследственных заболеваний, обусловлен-

ных повреждением области Xq28, таких как синдром Вайс-

мана, Х-сцепленная умственная отсталость (MRX3) или ото-

палато-дигитальный синдром (OPD).

Второй идентифицированный ген — CG2, состоящий

из 15 экзонов, отсутствовал у одного из пациентов с мик-

роделециями и был частично делетирован у другого. До-

полнительный скрининг 12 тканеспецифических библиотек

и компьютерный анализ базы данных EST-последователь-

ностей позволили идентифицировать фрагмент кДНК раз-

мером в 3.4 кб с сигналом полиаденилирования и откры-

той рамкой считывания. Этот фрагмент кДНК способен

кодировать полипептидную цепь, состоящую из 621 ами-

нокислоты. Причем в клонах кДНК, изолированных соот-

ветственно из библиотеки печени и скелетных мышц, при-

сутствовали альтернативные сайты полиаденилирования.

Оказалось, что ген CG2 идентичен МТМ1, так как были

обнаружены различные мутантные аллели этого локуса у

пациентов с Х-сцепленной миотубулярной миопатией. На-

ряду с миссенс-мутациями описаны небольшие делеций и

инсерции, приводящие к сдвигу рамки считывания. Иссле-

дование 40% кодирующей области гена МТМ1 позволило

идентифицировать мутации у 12% пациентов.

Продукт гена CG2, получивший название миотубулярин,

имеет высокую гомологию по последовательности с одним

из белков Saccharamyces cerevisiae и Caenorhabditis elegans

(53% и 56% соответственно). Кроме того, анализ базы дан-

ных EST-последовательностей показал, что в геноме чело-

века существует по крайней мере восемь других не описан-

ных ранее генов, высокогомологичных МТМ1. Определена

хромосомная локализация и характер экспрессии большин-

ства из них (Laporte et al., 1997). Один из этих генов локали-

135

зован дистальнее МТМ1 в Xq28. Миотубулярин содержит рай-

он (РТР), сходный с активным центром тирозинфосфатаз. Эти

белки вовлечены в регуляцию путей сигнальной трансдукции,

участвующих в контроле процессов роста, пролиферации и

дифференцировки клеток. Оказалось, что миотубулярин спо-

собен гидролизовать синтетический аналог тирозинфосфата

в реакции in vitro, ингибируемой ортованадатом. По-видимо-

му, миотубулярин является членом нового семейства тиро-

зинфосфатаз (DSP), обладающих двойной специфичностью

как по отношению к тирозину, так и по отношению к серину.

Дефекты этого белка сопровождаются нарушениями нормаль-

ного процесса созревания мышц, что и приводит к развитию

миотубулярной миопатии. Другие гомологи миотубулярина не

имеют функционального РТР-активного сайта. МТМ1 принад-

лежит к семейству высококонсервативных генов, обнаружен-

ных не только в геноме млекопитающих, но и у различных

видов дрожжей, а также у дрозофилы (Laporte et al., 1997).

Сравнение этого ряда генов позволяет реконструировать

филогенетическое дерево и определять консервативные ос-

татки, наиболее существенные для выполнения общих функ-

ций соответствующих белков.

Прямое секвенирование 92% кодирующей части МТМ1

гена у мальчиков с миотубулярной миопатией, диагностиро-

ванной на основе гистологического анализа биоптатов мышц,

позволило идентифицировать 26 мутаций, 50% которых были

локализованы в экзонах 4 и 12 (de Gouyon et al., 1997). У

большинства пациентов обнаруживаются точковые мутации,

4 из которых нарушают процесс сплайсинга. Одна из мис-

сенс-мутаций затрагивает высококонсервативную аминокис-

лоту, присутствующую во всех гомологичных белках других

исследованных видов начиная с дрозофилы. У остальных па-

циентов найдены делеции размером от нескольких нукле-

отидов до 2—6 экзонов. Три мутации встретились более чем

у одного пациента. В параллельном исследовании было про-

ведено скринирование всей кодирующей области МТМ1 гена

методом SSCP-анализа у 85 неродственных пациентов

136

(Laporte et al., 1997). В 55 случаях удалось идентифициро-

вать мутантные аллели. Большие делеций обнаружены толь-

ко у трех пациентов. 5 точковых мутаций найдены у многих

пациентов и, по-видимому, они обьясняют 27% всех случаев

заболевания. Более половины мутаций нарушают фермен-

тативную активность миотубулярина, вследствие преждевре-

менной терминации трансляции либо в результате аминокис-

лотных замен в фосфатазном домене белка. Остальные мис-

сенс-мутации кластерированы в двух консервативных райо-

нах миотубулярина, что является указанием на присутствие

в этом белке других функциональных доменов, не связан-

ных непосредственно с реакцией фосфорилирования.

е) Миопатия Бетлема (MIM: 158810)

Генетически гетерогенная группа врожденных миопа-

тии с аутосомно-доминантным типом наследования. Заболе-

вание характеризуется врожденной мышечной гипотонией,

укладывающейся в картину синдрома «вялого ребенка». В

последующем наблюдается медленно прогрессирующая ат-

рофия мышц с возможным развитием кардиомиопатий и

множественных контрактур суставов (Bethlem, van Wijn-

gaarden, 1976; Arts et al., 1978). В биоптатах мышц наблюда-

ется атрофия волокон I типа.

При генетическом анализе датских семей с данной фор-

мой миопатии обнаружено сцепление локуса, ответственно-

го за развитие заболевания, с областью 21q22.3, в которой

расположен кластер генов, кодирующих а1 и ос2 цепи колла-

гена типа VI (Jobsis et al., 1995; Jobsis et al., 1996a). В боль-

шой франко-канадской семье, в которой одновременно на-

блюдали 19 пациентов, показано сцепление исследуемого

локуса с маркерами D2S336 и D2S395, локализованными в

17-сМ области 2q37, в которой расположен ген аЗ цепи кол-

лагена того же типа VI (Speer et al., 1996). В настоящее вре-

мя идентифицировано19 типов коллагенов, состоящих из

более чем 30 полипептидных цепей, кодируемых разными

генами. Генетические дефекты некоторых типов коллагенов

137

связаны с рядом моногенных заболеваний, таких как несо-

вершенный остеогенез, синдром Элерса-Данлоса (тип IV и

VII), синдром Альпорта, некоторые формы хондродисплазий.

При этих заболеваниях нарушаются процессы посттрансля-

ционного созревания либо протеолитического расщепления

коллагеновых цепей, что приводит к неправильному спари-

ванию мономеров либо к образованию мультимерных ансам-

блей большего размера.

Зрелые молекулы коллагеновых белков состоят из трех

равномерно скрученных полипептидных а-цепей, образую-

щих структуру трехгранного стержня. Разные типы коллаге-

нов могут быть образованы либо тремя одинаковыми а-це-

пями, либо двумя или тремя различными полипептидами в

соотношении 2:1 или 1:1:1 соответственно. Любая а-цепь со-

держит коллагеновый домен, на всем протяжении которого

за исключением короткого С-терминального участка каждая

третья аминокислота является глицином (Gly). Таким обра-

зом, молекулярная формула коллагенового домена может

быть записана как (Gly-X-Y)n, где X и Y — аминокислоты не-

Gly типа. Различные коллагеновые а-цепи различаются по

количеству (Gly-X-Y) мотивов в коллагеновом домене и по

конкретному содержанию аминокислот в X и Y положениях.

Некоторые коллагены содержат также неколлагеновые доме-

ны. Присутствие глицина, самой небольшой из аминокислот,

в каждом третьем положении коллагеновых полипептидных

цепей существенно для их правильного скручивания в трой-

ную спираль, так как глицин при этом занимает ограничен-

ное пространство в центре триплекса. Поэтому любые мута-

ции, приводящие к замене глицина на другую аминокислоту,

будут сопровождаться локальным нарушением структуры

тройной спирали. Все коллагеновые молекулы способны об-

разовывать супрамолекулярные агрегаты, частично стаби-

лизированные за счет взаимодейсвий между триплексными

доменами. Коллагены типов l,ll, III, V, VI и XI формируют фи-

бриллыдо есть являются фибриллярными коллагенами. Кол-

лагены типа IV агрегируются, образуя слои базальных мемб-

138

ран, коллагены VIII формируют десцеметовую мембрану и

коллагены типа VII участвуют в образовании латерально аг-

регированных антипараллельных димеров, являющихся глав-

ным компонентом опорных фибрилл. На рис. 17 изображена

структура коллагена. Предполагается, что среди большого се-

мейства коллагенов широко экспрессирующийся микрофиб-

риллярный коллаген VI типа выполняет роль моста между

клетками и внеклеточным матриксом. Этот тип коллагена при-

сутствует не только в эндомизии и перимизии скелетных

мышц, но и во многих других тканях.

Рис. 17. Структура коллагена

При секвенировании амплифицированных фрагментов

кодирующих областей генов COL6A1 (collagen 6 alpha 1) и

COL6A2, полученных от пациентов с миопатией Бетлема,

139

ассоциированной с областью 21q22.3, в трех семьях были

обнаружены две гетерозиготные миссенс-мутации. Одна со-

ответственно в гене COL6A1, а другая однотипная мутация в

двух семьях — в гене COL6A2 (Jobsis et al., 1996b). Обе му-

тации разрушали Gly-X-Y мотив в стержневом домене колла-

гена путем замещения глицина либо на валин, либо на се-

рии. Гетерозиготное состояние по делеции одного нуклеоти-

да в гене COL6A1 также приводит к развитию миопатии Бет-

лема (Lamandiet al., 1998). Эта мутация сопровождается преж-

девременной терминацией трансляции, при этом мутантная

мРНК оказывается нестабильной и почти полностью отсутст-

вует в фибробластах и в скелетных мышцах больных. При

гаплонедостаточности по а1-цепи образуется уменьшенное

количество структурно нормального коллагена VI. Предпо-

лагается, что структурные дефекты коллагена типа VI или

уменьшение его содержания могут оказывать влияние на про-

цессы дифференцировки миобластов либо, что более вероят-

но, на структурную организацию внеклеточного матрикса. По-

видимому, в скелетных мышцах коллаген VI является критичес-

ким белком, участвующим в клеточно-матриксной адгезии.

1.7. Миопатии с цитоплазматическими

и ядерными включениями

в мышечных клетках

Миопатии, дебютирующие во взрослом возрасте, при

которых наблюдается накопление в цитоплазме и/или в яд-

рах мышечных клеток патологических белковых агрегатов,

также, по нашему мнению, могут быть выделены в самостоя-

тельную группу, несмотря на то что молекулярные механиз-

мы формирования этих включений при разных заболевани-

ях могут значительно различаться. В последнее время широ-

ко обсуждается роль подобных образований в развитии ней-

родегенеративных процессов при таких разных заболевани-

ях, как болезнь Альцгеймера, некоторые семейные формы

болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склеро-

140