Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

Атрофия зрительного нерва при синдроме Лебера часто со-

четается с неврологической симпоматикой в виде ранней

дистонии, периферической полиневропатии, тремора, атак-

сии. Заболеванию могут сопутствовать головные боли, сер-

дечная аритмия. Наиболее частыми при синдроме Лебера

являются нуклеотидные замены в положениях 11778, 3460,

15257 и 14484 мтДНК. Эти мутации рассматриваются в каче-

стве первичных, и они обнаруживаются более чем у 90% па-

циентов с митохондриальной формой этого заболевания.

Кроме того, описано около 20 других точковых мутаций в ге-

нах MTND1-7, которые также приводят к атрофии зрительно-

го нерва. Эти мутации рассматриваются в качестве вторич-

ных, так как при их сочетании с первичными мутациями фор-

мируется плейотропный фенотип синдрома Лебера.

Другие мутации в мтДНК (делеций, дупликации, точко-

вые мутации), приводящие к дефициту одного или несколь-

ких ферментов в митохондриальной респираторной цепи,

являются первичными молекулярными дефектами при раз-

личных наследственных болезнях, получивших название ми-

тохондриальных энцефаломиопатий (Shoffner, Wallace, 1995).

Как правило, это мультисистемные заболевания с преиму-

щественным вовлечением в патологический процесс высо-

ко-аэробных, постмитотических тканей, таких как сердечная

и скелетные мышцы, а также центральная нервная система.

Точковые мутации в мтДНК, кодирующей тРНК, также явля-

ются частой причиной таких болезней. Более 25 мутаций за-

регистрировано в 10 из 22 митохондриальных генов тРНК

(Wallace et al., 1995). Некоторые из этих мутаций связаны с

неврологическими синдромами, такими как митохондриаль-

ные энцефаломиопатий включая лактоацидоз в сочетании с

инсульт-подобными эпизодами — MELAS синдром; миокло-

нус-эпилепсия с «рваными» красными волокнами мышц, об-

разование которых обусловлено скоплением аномальных ми-

тохондрий по краю мышечного волокна — MERRF-синдром;

прогрессирующая офтальмоплегия — СРЕО-синдром. Дру-

гие мутации в митохондриальных генах тРНК приводят к изо-

151

лированным миопатиям, кардиомиопатиям или мультисистем-

ным заболеваниям. Некоторые специфические мутации свя-

заны с определенным клиническим фенотипом, тогда как

другие мутации в разных семьях могут выражаться по-раз-

ному. Ген MTTL1, кодирующий лейциновую

PHK

(Leu)(UUR)

, яв-

ляется «горячей точкой» для подобных мутаций. По крайней

мере 11 различных мутаций идентифицировано в этом гене у

пациентов с MELAS-синдромом, прогрессирующей офталь-

моплегией, диабетом в сочетании с глухотой, с миопатией

или кардиомиопатией. Примером может служить A3243G за-

мена в гене MTTL1. У 80% пациентов с MELAS-синдромом

обнаруживается подобная мутация. При этом доля мутант-

ных митохондриальных геномов варьирует у пациентов от

56% до 95% и значительно выше,чем у здоровых родствен-

ников пробандов. В контрольных группах подобной мутации

не обнаруживается. У ряда пациентов найдена мутация в

положении 3271 того же гена. Мутации в этом митохондри-

альном гене обнаружены при ряде других заболеваний, та-

ких как MERRF синдром (С3256Т), кардиомиопатия с/или без

слабости скелетной мускулатуры (A3260G, СЗЗОЗТ), митохон-

дриальная энцефаломиопатия (С3252С) и диабет II типа в

сочетании с нейросенсорной тугоухостью. В то же время в

гене MTTL2, кодирующем другую лейциновую TPHK

(Leu)(CUN)

описано всего несколько мутаций, в том числе G12315A, у

пациента с прогрессирующей офтальмоплегией, слабостью

конечностей, нейросенсорной тугоухостью и пигментной ре-

тинопатией, а также A12320G — у пациента с миопатией

(Fuetal.,1996). Точные молекулярные основы подобных раз-

личий во взаимоотношениях генотип-фенотип остаются не-

понятными.

Мутации в митохондриальном гене треониновой тРНК

(ТГ1Г)

в положении 15924 и 15923 обнаружены у пациентов, умер-

ших в первые дни после рождения от тяжелой дыхательной

недостаточности, обусловленной лактоацидозом (Yoon et al.,

1991). В другой семье наблюдали гомоплазмию по 15924 му-

тации у здоровой женщины и у ее сына, умершего в возрасте

152

4 месяцев от тяжелого лактоацидоза с выраженными дефек-

тами митохондрий в сердечной и в скелетных мышцах. Био-

химический, гистологический и клинический анализы не вы-

явили каких-либо аномалий у его матери (Zheng et al., 1989).

Более того, подобная мутация обнаружена у 11% нормаль-

ных доноров, тогда как 15923 мутация не найдена среди ев-

ропейцев, азиатов и африканцев (Brown et al., 1992). При

молекулярном анализеЮ ядерных и 25 митохондриальных

кандидатных генов у пациентов с недостаточностью цитохро-

моксидазы С были найдены мутации в гене сериновой

TPHK

(Ser)(UCN)

в подгруппе больных с синдромальной энцефа-

лопатией (Jaksch et al., 1998). Потеря субъединиц цитохро-

моксидазы С, кодируемых митохондриальными генами, на-

блюдается при летальной кардиоэнцефаломиопатии новорож-

денных, а также при синдроме Лейгха — младенческой не-

кротической энцефалопатии (MIM 308930). Однако в послед-

них двух случаях первичный дефект связан с мутациями в

ядерных генах, продукты которых участвуют в биогенезе ком-

плекса цитохромоксидазы С, — SC02 и SURF1 соответст-

венно (Papadopoulou et al., 1999; Zhu et al., 1998).

Недавно был разработан высокоэффективный метод, ос-

нованный на градиентном денатурирующем гель-электрофоре-

зе, позволяющий одновременно сканировать мутации во всех

22 митохондриальных генах тРНК и во фланкирующих облас-

тях, а также обнаруживать гетероплазмию (Sternberg et al., 1998).

При анализе этим методом 35 пациентов с клиническим диа-

гнозом митохондриальной энцефаломиопатий у 25 были обна-

ружены мутации по крайней мере в одном из генов тРНК. Всего

было выявлено 46 мутаций (41 замена нуклеоида, 4 коротких

инсерции и одна небольшая делеция). 20 из этих мутаций были

описаны впервые. По 40 мутациям наблюдалась гомоплазмия,

по 6 — гетероплазмия. 22 мутации оказались локализованы в

генах тРНК и 24 во фланкирующих районах, из них 12 мутаций

в митохондриальных генах, кодирующих белки, 2 мутации в ге-

нах рибосомальной РНК и 10 — в некодирующих районах. Та-

ким образом, мутации в генах тРНК являются основной причи-

153

ной митохондриальных энцефаломиопатий и, как правило, по

ним наблюдается гомоплазмия.

Описано много случаев энцефаломиопатий, связанных

с различными протяженными делециями и дупликациями

митохондриальной ДНК. Среди них ведущее место занимает

синдром Кернса-Сейра. Для подобных митохондриальных

болезней характерна гетероплазмия, причем тяжесть тече-

ния заболевания, как правило, коррелирует с количеством

мутантных митохондрий.

а) Миопатии митохондриальные с делециями и

дупликациями митохондриальной ДНК (MIM:

550000,160550); синдром Кернса-Сейра (MIM:

530000)

При исследовании 123 пациентов с различными мито-

хондриальными миопатиями и энцефалопатиями у 32 были

обнаружены делеции митохондриальной ДНК (рис. 18) в мы-

шечной ткани (Moraes et al., 1989). Величина этих делеций

варьировала от 1.3 до 7.6 кб, 11 пациентов имели одинако-

вую делецию размером 4.9 кб. Впервые мутации в мтДНК

были идентифицированы у пациентов с митохондриальной

миопатией (Holt et al., 1988). При анализе 25 таких больных у

9 в мышечных клетках была обнаружена гетероплазмия, то

есть существование двух популяций мтДНК — нормального

размера и с делецией около 7 кб. В одной большой итальян-

ской семье с пятью больными с диагнозом митохондриаль-

ной миопатии, сочетающейся с катарактой (MIM: 160550) были

обнаружены множественные делеции мтДНК, начало кото-

рых было локализовано в небольшой 12-нуклеотидной обла-

сти на 5' конце D-loop района — сайта активного взаимодей-

ствия ядерной и мтДНК (Zeviani et al., 1989). Анализ был про-

веден путем амплификации и секвенирования этой области

мтДНК. Не исключено, что мутации в ядерных генах, контро-

лиующих взаимодействие ядерной и мтДНК, могут приводить

к специфическому наследуемому разрушению целостности

митохондриального генома.

154

Различные делеций митохондриального генома были

обнаружены в другой семье, где пробанд имел атаксию, эпи-

зодическую кетоацидозную кому и миопатию. При этом де-

леций обнаружены не только у пробанда, но и у его здоровой

матери и у ее сестры (Cormier et al., 1991). Выявлен дефект окис-

лительного фосфорилирования в скелетных мышцах и в лим-

фоцитах больного. Все делеций локализованы между генами

СОХ II и цитохрома р. Делеций наследуются по аутосомно-до-

минантному типу. Предполагается, что за митохондриальные

делеций ответственен фактор, кодируемый ядерным геном, воз-

можно, приводящий к нарушениям в системе репарации.

В одной финской семье с офтальмоплегией и миопати-

ей у 9 ее членов также были обнаружены делеций мтДНК

различной протяженности (Suomalainen etal., 1992). Наиболь-

ший процент делетированной мтДНК найден в мозге, скелет-

ных мышцах и в сердце. Тяжесть течения заболевания кор-

релирует с количеством мутантной мтДНК. У некоторых па-

циентов с митохондриальными миопатиями присутствуют не

делеций, а дупликации мтДНК (Poulton et al., 1988).

Основной причиной развития синдрома Кернса-Сейра,

характеризующегося прогрессирующей хронической офталь-

моплегией, пигментной дегенерацией сетчатки, кардиомипа-

тией, а также дебютирующими в более позднем возрасте атак-

сией и мышечной слабостью, являются протяженные деле-

ций митохондриальной ДНК размером примерно от 2 до бо-

лее чем 7 кб (Zeviani et al., 1988; Johns et al., 1989; Fischel-

Ghodgian et al., 1992). При этом наблюдается выраженная

гетероплазмия и доля мутантных мтДНК в мышечной ткани

обычно варьирует в пределах от 45% до 75%. В фиброблас-

тах больных процент мутантных митохондрий значительно

ниже. Делеций часто включают 8993 позицию мтДНК, явля-

ющуюся мутантным сайтом в гене АТФ-синтетазы комплек-

са V (МТАТР6) при NARP-синдроме (нейропатия, атаксия, пиг-

ментный ретинит — MIM: 551500 и 516060).

Неожиданным оказалось то, что одна и та же делеция

размером в 4977 нуклеотидов была идентифицирована при

155

двух очень разных митохондриальных болезнях: при синдро-

ме Кернса-Сейра и при синдроме Пирсона (MIM: 557000),

ведущим симптомом которого является нарушение экзокрин-

ной функции поджелудочной железы (Fischel-Ghodgian et al.,

1992). Однако процентное содержание делетированной

мтДНК в разных тканях пациентов значительно различается

при этих двух заболеваниях. В первом случае мутантная

мтДНК преимущественно обнаруживается в мышцах и в ЦНС,

тогда как ее распределение при синдроме Пирсона не имеет

выраженной тканеспецифичности. Описаны случаи, когда у

больных с клиническим диагнозом синдрома Пирсона появ-

ляются симптомы синдрома Кернса-Сейра. Показано, что в

этих случаях у пациентов меняется характер гетероплазмии

и мутантная мтДНК преимущественно локализуется в мышеч-

ных тканях. Таким образом, не столько размер делеций и их

локализация в геноме митохондрий, сколько распределение

мутантной мтДНК в разных тканях имеет критическое зна-

чение для клинического проявления последствий этих мута-

ций. У некоторых пациентов с синдромом Кернса-Сейра иден-

тифицированы точковые мутации в генах тРНК, и в частнос-

ти в гене лейциновой тРНК (

Leu

CUN

Интересным представляется вопрос о причинах возник-

новения делеций в мтДНК. В ряде случаев делеции возника-

ют вследствие мутаций в ядерных генах и наследственная

передача соответствующих заболеваний подчиняется зако-

нам Менделя. Однако возникновение других делеций может

быть связано со структурными особенностями митохондри-

ального генома. Так, показано, что у некоторых пациентов с

синдромом Кернса-Сейра точки разрывов делеций локали-

зованы внутри прямого канонического повтора длиной от 13

до 18 нуклеотидов, расположенного в различных районах

митохондриального генома (Johns et al., 1989). Иногда ока-

зывается, что последовательности, граничащие с делециями,

способны образовывать шпилечные структуры, что также

рассматривается как фактор дестабилизации мтДНК. Выска-

зано предположение, что делеции в мтДНК являются резуль-

156

татом более сложных генетических перестроек (Poulton et al.,

1994). Оказалось, что у многих пациентов с синдромом Керн-

са-Сейра в мтДНК наряду с делециями присутствуют опре-

деленные дупликации, причем эти дуплицированные облас-

ти часто отсутствуют у пациентов с прогрессирующей офталь-

моплегией (СЕРО). По-видимому, баланс между перестрой-

ками в мтДНК является центральным звеном в патогенезе

этой уникальной группы заболеваний.

Несмотря на то что в мышечной ткани пациентов с син-

дромом Кернса-Сейра процент мутантной мтДНК достаточ-

но высок, в культуре сателлитных клеток, полученных из би-

оптатов тех же самых мышц пациентов, мутантные митохон-

дрии обнаруживаются редко (Shoubridge et al. 1998). Выска-

зано предположение, что восстановление нормального гено-

типа мтДНК в мышцах больных может быть достигнуто путем

стимуляции регенерации мышечных волокон, так как имен-

но сателлитные клетки ответственны за этот процесс. Для

испытания этой гипотезы была проведена повторная биопсия

одного и того же участка мышц больного с синдромом Керн-

са-Сейра. Оказалось, что в регенерирующих волокнах, обра-

зовавшихся после первой биопсии, наблюдается гомоплаз-

мия по мтДНК дикого типа, тогда как в большинстве нереге-

нерирующих волокон процент мутантной мтДНК сохранется

на прежнем уровне. Эти результаты позволяют надеяться на

возможность улучшения функции мышц у подобных пациен-

тов путем инкорпорации сателлитных клеток в мышечные

волокна.

1.9. Метаболические миопатии

Наследственные дефекты различных мышечных фер-

ментов являются причиной развития относительно доброка-

чественных метаболических миопатии. В качестве примера

мы рассмотрим миопатии, обусловленные недостаточностью

мышечной фосфорилазы (болезнь Мак-Ардла), карнитин паль-

митоилтрансферазы I, миоаденилат дезаминазы (миопатия

Спряжения) и фосфоглицератмутазы.

157

а) Гликогеноз 5 типа, гликогеноз мышечный, Мак-

Ардла болезнь (MIM: 232600)

Гликогеноз 5 типа, или болезнь Мак-Ардла, проявля-

ется уже в детском возрасте прогрессирующей мышечной

слабостью, патологической утомляемостью мышц, а также

болезненными тоническими судорогами, возникающими

при утомлении. Тонические спазмы возникают чаще при

физической нагрузке в условиях ишемии. Тоническое со-

кращение может быть генерализованным и сопровождать-

ся побледнением, сердцебиением, повышенным потоотде-

лением. Течение заболевания медленно прогрессирующее,

приводящее к формированию мышечных контрактур. Био-

химической основой заболевания является дефицит мы-

шечной фосфорилазы, составляющей 5% всего раствори-

мого белка мышц. При этом мышечная фосфорилаза у ча-

сти больных может присутствовать, хотя активность ее, как

правило, резко снижена. Найдена очень низкая концент-

рация пиридоксина в мышцах больных. Пиридоксинфос-

фат — ковалентно связанный кофактор гликогенфосфори-

лазы, одна молекула витамина связывается с лизиновым

остатком каждой субьединицы фермента.

Хромосомная принадлежность гена PYGM

(ghosphorylase glycogen muscle) была установлена путем

гибридизации геномной ДНК, изолированной из отдельных

хромосом, с олигонуклеотидными ДНК-зондами, соответ-

ствующими карбокси-терминальному району мышечной фо-

сфорилазы. Хромосомы отбирали методом лазерного сор-

тинга из клеточных линий, содержащих различные транс-

локации. Таким образом удалось показать, что ген PYGM

расположен в 11-й хромосоме (Lebo et al., 1984). В даль-

нейшем локализация гена была уточнена методом сомати-

ческой гибридизации. При этом был использован набор кле-

точных клонов, содержащих различные терминальные де-

леции 11-й хромосомы. Метод флюоресцентной гибриди-

зации in situ позволил уточнить локализацию гена PYGM в

проксимальном районе 11 q 13 (Lebo et al., 1990). Одновре-

158

менно из тканеспецифической экспрессионной библиоте-

ки генов мышц человека были выделены кДНКовые клоны

мышечной фосфорилазы и с их помощью изолирована спе-

цифическая мРНК размером 3.4 кб (Gautron et al., 1987).

Определена интрон/экзонная структура гена PYGM (Burko

et al., 1987). ВЗ'-области гена PYGM найден полиморфизм

по сайту рестрикции для Msp1, информативность которого

оказалась достаточна для проведения пренатальной диа-

гностики в 75% семей высокого риска. Затем были описа-

ны более информативные внутригенные мини- и микроса-

теллитные повторы, легкогенотипируемые методом ПЦР

(Iwasaki et al., 1992).

При гликогенозе 5 типа мРНК гена PYGM либо отсут-

ствует, либо ее содержание значительно снижено. В по-

следнем случае равмер транскрипта чаще всего нормаль-

ный. По-видимому, крупные делеций и другие структурные

перестройки в области PYGM гена встречаются нечасто.

При молекулярном обследовании 40 неродственных паци-

ентов с синдромом Мак-Ардла в гене PYGM были иденти-

фицированы 3 различные точковые мутации, одна нонсенс

типа — R49X и 2 миссенс — G204S и K542W (Tsujino et al.,

1993а). Все три мутации встречались неоднократно у раз-

ных пациентов и в разных сочетаниях. Нонсенс-мутация

R49X, возникающая в результате замены тимина на гуа-

нин в 49-м кодоне первого экзона и приводящая к образо-

ванию стоп-кодона на месте аргинина в белке, оказалась

наиболее мажорной. 18 пациентов из 40 исследуемых были

гомозиготны по этой мутации. Две другие миссенс-мута-

ции в экзонах 5 и 14 соответственно также могут быть от-

несены к классу мажорных. Так, 6 из 40 пациентов были

компаунд-гетерозиготами по трем известным мутациям и

у 11 пациентов был идентифицирован один из этих трех

мутантных аллелей. Только у пяти больных мутации в PYGM

гене не были обнаружены. В дальнейшем было идентифи-

цировано еще несколько точковых мутаций в гене PYGM у

больных с синдромом Мак-Ардла (Tsujino et al., 1995).

159

б) Миопатия с дефицитом карнитин

пальмитоилтрансферазы I

(MIM:

255110)

Заболевание относится к группе метаболических ауто-

сомно-рецессивных миопатии с недостаточностью карнитин

пальмитоилтрансферазы I — фермента энергетического ме-

таболизма, участвующего в митохондриальном бета-окисле-

нии длинноцепочечных жирных кислот путем их конъюгации

с L-карнитином. Этот шаг необходим для прохождения жир-

ных кислот через мембрану митохондрий. При недостаточ-

ности фермента у больных наблюдаются мышечные боли в

сочетании с миоглобинурией, часто индуцируемые физичес-

кими упражнениями, голодом или жирной пищей. В зависи-

мости от дебюта клинические проявления заболевания мо-

гут быть различными. Для взрослых пациентов характерны

мышечная слабость с периодическими нарушениями поход-

ки, судорожные сокращения мышц (типа крампи), миоглоби-

нурия. При дебюте заболевания в детском возрасте у боль-

ных развивается гипераммониемия, наблюдается повышен-

ный уровень сывороточных трансаминаз и свободных жир-

ных кислот плазмы, гепатомегалия, некетонная гипоглице-

мия и кома. Недостаточность по карнитин пальмитоилтранс-

феразе I — одно из немногих наследственных заболеваний,

которые коррегируются диетой, содержащей среднецепочеч-

ные триглицериды.

Клонирована и секвенирована полноразмерная кДНК

гена СРТ1 (carnitine palmitoyltranferase I), кодирующая белок,

состоящий из 658 аминокислот, включая 25 остатков лидер-

ного МН2-пептида (Finocchiaro et al., 1991). С использовани-

ем кДНКовых зондов ген СРТ1 был картирован методами

соматической гибридизации и флюоресцентной гибридиза-

ции in situ в области 1р13-р11 (Minoletti et al., 1992).

Идентифицированы две мажорные миссенс мутации в

СРТ1 гене у больных, страдающих недостаточностью карни-

тин пальмитоилтрансферазы I. Одна из них — замена С на Т

в 439 положении, приводящая к замене серина на лейцин в

113 положении белка. Эта мутация обнаруживается у взрос-

160