Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

одним из геномных ДНК-зондов, изолированных из области

локализации гена DM (Harley et al., 1992). При проведении с

использованием этого зонда блот гибридизации по Саузерну

в норме обнаруживаются два рестрикционных фрагментам

то время как у большинства пациентов один из этих фраг-

ментов замещен на более крупный. Размеры этого необыч-

ного фрагмента могут варьировать у разных пациентов и даже

в тех случаях, когда больные принадлежат одной семье. На-

блюдается достоверная положительная корреляция между

тяжестью течения, а также более ранним началом заболева-

ния и длиной этого фрагмента. Одновременно методами по-

зиционного клонирования был идентифицирован микросател-

литный CTG-повтор, локализованный в З'-нетранслируемой

области гена DM. Длина этого повтора оказалась значитель-

но больше у больных с миотонической дистрофией (Brook et

al., 1992). Этот повтор при рестрикции геномной ДНК эндо-

нуклеазой EcoRI попадал именно в тот из фрагментов, гиб-

ридизующихся с использованным ДНК-зондом, длина кото-

рого оказывалась большей у больных. Таким образом, была

расшифрована природа необычного рестрикционного EcoRI-

фрагмента.

Изолированный CTG-повтор в популяции также отли-

чается крайней нестабильностью — количество копий в кла-

стере варьирует от 5 до 30—37 При этом для многих популя-

ций характерен двухвершинный характер распределения ал-

лелей. Так, в отечественных популяциях доминируют аллели

с 5 (42.5%) и с 11—13 (37%) повторами (Малышева и др.,

1998). Однако у больных с миотонической дистрофией мини-

мальное количество триплетов значительно больше и состав-

ляет не менее 50 при наиболее мягких формах болезни, от

100 до 1000 у пациентов с классическим течением и с дебю-

том во взрослом возрасте, в то время как при врожденных

формах заболевания количество CTG-триплетов может до-

стигать трех тысяч.

Определение размера CTG-повтора методами ПЦР или

блот-гибридизации по Саузерну позволяет проводить прямую

171

молекулярную диагностику миотонической дистрофии. Око-

ло 90% хромосом с экспансированными CTG-повторами в

отечественных популяциях имеют одинаковый гаплотип по

двум внутригенным полиморфным сайтам рестрикции. Этот

же гаплотип характерен для 91% хромосом с CTG(5) и для

подавляющего большинста хромосом с CTG(15) (Малышева

и др., 1998). Интересно отметить, что транскрибируемый не-

стабильный CTG-(5-30) мотив в З'-нетранслируемой области

гена DM обнаружен только в геноме человека, несмотря на

то что фланкирующие нуклеотиды присутствуют в гомологич-

ном гене мыши.

Недавно в геноме человека был идентифицирован еще

один нестабильный патогенетический транскрибируемый, но

не транслируемый CTG-повтор (Koob et al., 1999). Этот по-

втор расположен в области 13q21, и его экспансия является

причиной развития одной из генетических форм спиноцере-

беллярной атаксии (SCA8). Это неожиданная находка, так как

до сих пор все доминантные спиноцеребеллярные атаксии

были связаны с экспансиями CAG-повторов, кодирующих по-

лиглютаминовые треки, входящие в состав различных бел-

ков. Удлиненные полиглютаминовые треки способны изби-

рательно индуцировать образование устойчивых к протеоли-

зу ядерных агрегатов в определенных типах нейронанальных

клеток, чаще всего в клетках Пуркинье мозжечка. Накопле-

ние подобных ядерных включений оказывает цитотоксичес-

кий эффект и является причиной развития специфических

нейродегенеративных процессов, приводящих к различным

формам спиноцеребеллярных атаксий. Очевидно, что пато-

генетический механизм действия экспансированного нетран-

слируемого CTG-повтора при форме 8 спиноцеребеллярной

атаксии совершенно иной и он, по-видимому, сходен с меха-

низмом действия таких же динамических мутаций при мио-

тонической дистрофии. Для этих двух заболеваний характе-

рен сопоставимый уровень экспансий CTG-повтора и очень

высокая митотическая и мейотическая нестабильность экс-

пансированных повторов, особенно заметная при прохожде-

172

нии мутантного аллеля через женский гаметогенез. Эти осо-

бенности отличают форму 8 от других типов спиноцеребел-

лярных атаксий. Различия в фенотипических проявлениях

экспансий CTG-повторов, приводящих к таким клинически

разным заболеваниям, как миотоническая дистрофия и спи-

ноцеребеллярная атаксия, обусловлены особенностями функ-

ционирования тех генов, работа которых нарушается вслед-

ствие возникновения этих мутаций.

4. Механизмы экспансии CTG-повтора в гене DM

Итак, мутационным механизмом миотонической дистро-

фии является амплификация CTG-повтора в З'-нетранслиру-

емой области гена DM. По-видимому, начальным предраспо-

лагающим к мутационному событию фактором служит пере-

ход от аллеля с пятью CTG-повторами к аллелям, состоящим

из 19—30 триплетов. Популяционная частота этого гетеро-

генного класса аллелей — (CTG)-19—30 — достигает 10% и,

по-видимому, эти аллели составляют резерв для повторных

мутаций. У больных отмечается также черезвычайно высо-

кая соматическая нестабильность CTG-повтора (Ashizawa et

al., 1993), что согласуется сданными о различном характере

экспансии у некоторых однояйцовых близнецов (Fu et al.,

1992). В эмбриональном периоде подобная нестабильность

особенно заметна между 13 и 16 неделями беременности.

Наибольшая экспансия характерна для сердечной мышцы,

при этом степень гетерогенности не коррелирует с началь-

ной величиной экспансированного CTG-повтора (Martorell et

al., 1995). В отличие от мышц, в клетках перифирической кро-

ви больных наблюдается большая нестабильность (CTG)-no-

втора в сторону его экспансии (Martorell et al., 1995). Даль-

нейший анализ нестабильности CTG-повтора, проведенный

на протяжении 1—7 лет на клетках крови 111 пациентов с

варьирующим течением миотонической дистрофии, показал

прямую зависимость уровня гетерогенности от времени и на-

чальной длины повтора (Martorell et al., 1995). Не исключено,

что определенный вклад в формирование соматического мо-

173

заицизма вносят индивидуальные генетические факторы, а

также факторы окружающей среды.

Хорошо прослеживаемой клинической особенностью

болезней экспансии, и в частности миотонической дистро-

фии, является антиципация. Расшифрована молекулярная

природа этого явления. Оказалось, что аллели, связанные с

относительно небольшими экспансиями CTG-повтора, при

которых отсутствуют или наблюдаются лишь слабые клини-

ческие проявления заболевания, обладают высокой мейоти-

ческой нестабильностью. Их прохождение через гаметогенез

сопровождается дальнейшим значительным нарастанием

числа триплетов в нестабильных повторах и в следствие это-

го более резким снижением функции соответствующего гена

(Buxton et al., 1992). Еще одной особенностью наследования

бопезней экспансии является геномный импринтинг — раз-

ное течение заболевания в зависимости от того, получил боль-

ной мутантный аллель от матери или от отца. Так, при миото-

нической дистрофии амплификация CTG-области встречается

в материнском гаметогенезе значительно чаще, чем в отцов-

ском. Это особенно справедливо для тяжелых врожденных

форм заболевания.

В опытах in vitro с использованием геномных клонов,

содержащих локус DM с экспансированными CTG-повтора-

ми, исследовали роль одного из ключевых ферментов репа-

рации — мутазы S2 (продукта гена MSH2), в нестабильности

тринуклеотидных повторов, ответственных за целый ряд тя-

желых нейродегенеративных болезней (Pearson et al., 1997).

Оказалось, что мутаза S2 способна специфическим образом

связываться со структурами, образованными смещением

комплементарных нитей ДНК в области локализации таких

повторов и, таким образом, может принимать участие в их

экспансии.

5. Биохимическая характеристика продукта гена DM

Ген миотонической дистрофии кодирует белок, получив-

ший название миотонин-протеинкиназы — Mt-PK, и поэтому

174

ген DM обозначается иногда как DMPK (dystrophia myotonica

grotein kinase). Этот белок (Mt-PK), состоящий из 624 амино-

кислот, относится к семейству серин/треонин протеинкиназ,

родственных цАМФ-зависимым протеинкиназам (Fu et al.,

1992). Молекулярный вес полноразмерной изоформы Mt-PK,

транслируемой с первого AUG-кодона гена DMPK, составля-

ет 72 кД (Timchenko et al., 1995). Наиболее консервативен

каталитический домен этого белка, содержащий специфиче-

скую киназную и нуклеотид-связывающую конценсусные по-

следовательности. Значительно менее консервативен боль-

шой N-терминальный домен. Промежуточный домен с высо-

ким содержанием альфа-спиралей имеет небольшое сходст-

во с филаментными белками. По-видимому, миотонин-про-

теинкиназа, подобно другим протеинкиназам данного типа,

играет критическую роль в регуляции клеточной дифферен-

цировки и в репликации ДНК, а сам ген DMPK имеет функ-

ции рецессивного супрессора опухолей. Это согласуется с

данными о повышенной частоте у пациентов с миотоничес-

кой дистрофией пиломатриксом (опухолей тканей, производ-

ных нервного гребня), паратиреоидных аденом и небольших

карцином кишечника (Harris et al., 1996).

С использованием набора моноклональных антител на

каталитический и альфа-спиральный домены Mt-PK в скелет-

ных мышцах человека обнаружены три изоформы миотонин-

протеинкиназы — основная с м.в. 55 кД и минорные с м. в.72

и 80 кД (Pham et al., 1998). 5 типов антител на каталитичес-

кий и 5 на альфа-спиральный домены идентифицировали толь-

ко минорные изоформы, причем 72-кД белок присутствовал

во всех исследованных тканях, тогда как 80-кД изоформа

белка с варьирующей экспрессивностью обнаруживалась

главным образом в скелетных мышцах и в интеркалярных

дисках сердечной мышцы. Два типа моноклональных анти-

тел на каталитический домен обнаруживали только мажор-

ную 55-кД изоформу белка, присутствующую исключительно

в скелетных мышцах. Ни один из типов моноклональных ан-

тител не подтвердил ко-локализации Mt-PK с ацетилхолино-

175

выми рецепторами в нейромышечных соединениях. Метода-

ми субклеточного фракционирования и седиментационного

анализа показано, что основная часть Mt-PK в скелетных

мышцах и в мозге имеет цитозольную локализацию.

6. Молекулярные основы патогенеза миотонической

дистрофии

У больных, по крайней мере со взрослой формой забо-

левания, наблюдается уменьшение экспрессии гена DMPK

как на уровне мРНК, так и на белковом уровне (Fu et al.,

1993). В опытах, проведенных на культурах клеток, показа-

но, что в соматических гибридах, содержащих 19-ю хромосо-

му с экспансированным CTG-повтором, снижен синтез пер-

вичного РНК-транскрипта гена DMPK и нарушен его процес-

синг (Carango et al., 1993). Наиболее вероятным представля-

ется, что экспансия CTG-повтора влияет не на транскрип-

цию как таковую, а на посттранскрипционную модификацию

мРНК гена DMPK. Обнаружение повышенных уровней удли-

ненных транскриптов гена DMPK в ядрах клеток пациентов с

миотонической дистрофией позволяет предполагать возмож-

ность нарушения каких-то этапов процессинга мутантного

первичного РНК-транскрипта, таких как полиаденилирование

или транспорт мРНК из ядра в цитоплазму (Wang et al., 1995b;

Taneja et al., 1995). Доминантный характер наследования

миотонической дистрофии, по-видимому, связан с дефици-

том дозы зрелого продукта гена DMPK. Не исключено, что

повышение количества или активности миотонин-протеинки-

назы может оказывать терапевтический эффект на взрос-

лых пациентов. Однако в целом данные по влиянию экспан-

сированного CTG-повтора на экспрессию гена DMPK носят

противоречивый характер.

Более привлекательной кажется другая гипотеза, каса-

ющаяся молекулярных механизмов патогенного действия

динамических мутаций при миотонической дистрофии. По-

казано, что экспансированные CTG-повторы формируют на-

иболее сильные из известных естественных элементов ук-

176

ладки нуклеосом (Wang, Griffith, 1995). При этом эффектив-

ность образования нуклеосом возрастает с увеличением дли-

ны повтора. Можно предположить, что экспансированные

блоки повторов способны менять локальную структуру хро-

мосом, что, в свою очередь, может сопровождаться наруше-

нием экспрессии DMPK и/или других близко расположенных

генов. Это предположение нашло экспериментальное под-

тверждение. Так, недалеко от CTG-повтора была идентифи-

цирована последовательность, гиперчувствительная к дей-

ствию ДНКазы I. При обработке ДНКазой I нормальной ДНК

в этом сайте происходит разрыв. Однако мутантные после-

довательности ДНК с большими экспансированными CTG-

повторами оказываются устойчивы к действию фермента

(Often, Tapscott, 1995). Наиболее простым объяснением дан-

ного феномена является то, что увеличение длины CTG-по-

втора в гене DMPK нарушает локальную структуру хромати-

на, вследствие чего этот гиперчувствительный сайт стано-

вится недоступен для действия ДНКазы I. Предложены и не-

которые другие гипотезы для объяснения механизма повреж-

дающего действия экспансированного CTG-повтора.

В опытах in vitro идентифицирована группа белков, спо-

собных специфически связываться с CTG-повторами, нахо-

дящимися как в однонитевой, так и в двунитевой форме (Yano

Yanagisawa et al., 1995; Richards et al., 1993; Timchenko et al.,

1996). При этом белки, связывающиеся с двунитевыми зон-

дами, имеют, как правило, ядерную локализацию. Кроме того,

обнаружен цитоплазматический белок, специфически взаи-

модействующий с РНКовыми CUG-триплетами — CUG-BP

(Timchenko et al., 1996). Возможно, именно этот белок вовле-

чен в патогенез миотонической дистрофии.

Несмотря на значительные успехи в расшифровке при-

роды мутаций при миотонической дистрофии, остается неяс-

ным, происходит ли дисфункция или приобретение новой

функции гена DMPK на уровне взаимодействия ДНК со струк-

турой хроматина и/или на уровне регуляции процессинга пер-

вичного РНК-транскрипта. По-видимому, в разных тканях

12 Заказ № 170

177

определяющими могут быть различные нарушения, которые в

комплексе и формируют плейотропный фенотип заболевания.

7. Характеристика других генов, участвующих в патогенезе

миотонической дистрофии

Сложность клинического фенотипа миотонической

дистрофии в сочетании с противоречивыми данными, ка-

сающимися действия GTG-экспансии на экспрессию DMPK

локуса, привели к необходимости исследования соседних

генов, которые могут быть вовлечены в этиологию заболе-

вания. Область локализации гена DMPK насыщена актив-

но транскрибирующимися последовательностями. У чело-

века, так же как и у мыши, в непосредственной близости

от гена DMPK в проксимальной области расположен ак-

тивный ген — DMR-N9, обозначаемый иногда геном 59 —

рис. 20 (Jansen et al., 1992; Jansen et al., 1995). Этот ген

экспрессируется главным образом в мозге и в testis. Функ-

ция белкового продукта DMR-N9 неизвестна. Высказано

предположение, что экспансия CTG-повтора влияет на аль-

тернативную экспрессию генов DMPK и DMR-N9.

Рис. 20. Структурная организация DM-района

Более вероятным представляется участие в контро-

ле миотонической дистрофии гена DMAHP (dystrophia

myotonica associated homeodomain protein) (или STX5), pac-

178

положенного в непосредственной близости с З'-конца от

DMPK и кодирующего так называемый DM-ассоциирован-

ный гомеодоменный белок. DMAHP экспрессируется во

многих типах тканей, включая скелетные мышцы, фибро-

бласты, лимфоциты, сердце и мозг. Известно, что родст-

венные гомеодоменные белки дрозофилы являются транс-

крипционными факторами, регулирующими экспрессию

генов как на транскрипционном уровне, так и на уровне

трансляции посредством их связывания с ДНК и/или с РНК

соответственно. CTG-повтор локализован внутри CpG-oc-

тровка в З'-нетранслируемой области гена DMPK, и не ис-

ключено, что разрушение этого элемента за счет экспан-

сии повтора может нарушать экспрессию ассоциирован-

ного с этим островком гена(ов). Ранее идентифицирован-

ный гиперчувствительный сайт для ДНКазы I почти цели-

ком расположен в промоторной области этого гена и изме-

нения в этом сайте, вызванные экспансией CTG-повтора,

могут изменять экспрессию DMAHP. Это предположение

было подтверждено при обнаружении в этом сайте энхан-

сера, регулирующего транскрипцию DMAHP (Klesert et al.,

1997). При анализе экспрессии DMAHP в клетках пациентов

с миотонической дистрофией, в которых отсутствует гипер-

чувствительный сайт ДНКазы I, обнаружено 2—4-кратное

снижение устойчивых DMAHP-транскриптов по сравнению

с контролем, причем уровень снижения коррелирует с дли-

ной экспансированного повтора. Не исключено, что нару-

шение работы двух соседних генов DMPK и DMAHP фор-

мирует сложный фенотип миотонической дистрофии.

8. Модельные линии животных

Предположение об участии нескольких соседних ге-

нов в контроле миотонической дистрофии согласуется с

данными по трансгенному разрушению гомологичного гена

Dmpk у мышей. У нулевых мутантов ( Dmpk(-/-)) 72-кД изо-

форма миотонин-протеинкиназы полностью отсутствует. У

таких животных в позднем возрасте развивается прогрес-

179

сирующая миодистрофия с патологическими чертами, сход-

ными с теми, которые характерны для пациентов с мягким

течением миотонической дистрофии (Jansen et al., 1996;

Reddy et al., 1996). У взрослых особей наблюдаются ульт-

раструктурные изменения в мышцах, варьирующая вели-

чина мышечных волокон, с повышенной частотой дегене-

рации и фиброзов. Частота дегенерирующих волокон у

взрослых мутантов повышена на 50% по сравнению с мо-

лодыми животными. У мышей с гиперэкспрессией DM-npo-

теинкиназы, полученных путем трансгеноза нормального

гена DMPK человека в ранние зародыши Dmpk(-/-) мутан-

тов, развивается изолированная гипертрофическая кардио-

миопатия, несмотря на то что 72-кД изоформа миотонин-

протеинкиназы присутствует в большом количестве. Одна-

ко во всех подобных моделях отсутствуют ведущие симп-

томы миотонической дистрофии, включая атрофию мышеч-

ных волокон, миотонию, катаракту и мужское бесплодие.

Эти результаты показывают, что продукт гена DMPK необ-

ходим для поддержания нормальной структуры и функцио-

нирования скелетных мышц. Однако инактивация или из-

менение характера экспрессии DMPK-гена не являются

единственными критическими условиями, необходимыми

для развития заболевания.

В опытах на трансгенных животных показано, что вве-

дение геномных областей, содержащих районы DM локуса

человека с экспансированным CTG-повтором, не приво-

дит к фенотипу, сходному с миотонической дистрофией.

Однако в соматических и зародышевых клетках трансген-

ных мышей наблюдается гипермутабильность введенного

повтора как в сторону экспансий, так и в сторону делеций

(Gourdon et al., 1997; Monckton et al., 1997). При этом не-

стабильность была умеренной при введении 45-кб конст-

рукции, включающей наряду с мутантным геном DMPK с

55 CTG-повторами два фланкирующих гена — DMR-N9 и

DMAHP. Значительно более выраженная мутабильность

наблюдалась в трансгенных линиях мышей, полученных в

180