Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

диссоциации между парезами верхних и нижних конечнос-

тей. Парезы всегда симметричны. Пассивно поднятые конеч-

ности падают. При пассивном удержании ребенка в верти-

кальном положении отсутствует опора на нижние конечнос-

ти. Лежа на спине больной ребенок никогда не принимает

типичную для раннего возраста позу с поднятыми вверх ниж-

ними конечностями. Глубокие рефлексы — коленные и ахил-

ловы, как правило, отсутствуют. Если сохраняются рефлек-

сы на верхних конечностях, то они бывают очень низкими.

Мышечные атрофии при достаточно хорошо развитом под-

кожном жировом слое могут быть не видны. Мышечная сла-

бость распространяется и на дыхательную мускулатуру. Ос-

лабление функции межреберных мышц и диафрагмы в ка-

кой-то мере компенсируется активным участием в дыхании

мускулатуры живота. Включение в патологический процесс

диафрагмы ведет к ослаблению экскурсии грудной клетки.

Полный паралич диафрагмы обуславливает парадоксальное

дыхание и угрожает жизни ребенка. Характерен тихий голос

пациентов. Вовлечение в процесс двигательных ядер череп-

но-мозговых нервов затрудняет акт сосания. Отчетливее

других можно наблюдать поражение XII пары, в виде атро-

фии языка и фибриллярных подергиваний. Недостаточная

функция мимической мускулатуры находит свое выражение

в своеобразном «кукольном» лице ребенка. Психическое раз-

витие не страдает. Течение болезни носит неуклонно прогрес-

сирующий характер. Иногда кратковременная остановка на-

растания параличей ошибочно принимается за улучшение.

Темпы моторного развития резко отстают от нормаль-

ных критериев. Дети плохо удерживают голову. Не способны

самостоятельно поворачиваться в постели, вставать на ноги

и стоять. В тех случаях, когда ребенок сидит, будучи поса-

женным, он опирается на руки, а позвоночник кифозирует-

ся. Деформация позвоночника в начале болезни ликвидиру-

ется при изменении позы. В дальнейшем же сколиоз, кифоз,

кифосколиоз грудного и поясничного отделов становятся

фиксированными. Продолжительность жизни больных неве-

201

лика. Обычно они погибают на первом гс>ДУ жизни. Причиной

смерти является дыхательная недостаточность на фоне по-

вторных пневмоний и ателектазов. ИВЛ продлевает жизнь

на короткое время. Следует отметить, что хорошие условия

жизни, тщательный уход за больным ребенком способны про-

длить его жизнь на месяцы, но не на годы.

II тип детской спинальной амиотрофии именуется хро-

ническим или промежуточным. Его отличают чуть более

позднее начало, относительно медленное прогрессирова-

ние, лучшая жизнеспособность и ряд клинических призна-

ков. Внутриутробное развитие плода не вызывает беспо-

койства. Шевеление, как правило, наступает своевремен-

но и продолжается достаточно активно на протяжении всей

беременности. Дети рождаются доношенными. В периоде

новорожденное™ и в первое полугодие жизни темпы пси-

хомоторного развития соответствуют возрастным критери-

ям. Доречевое развитие оказывается нормальным. Пер-

вые признаки болезни в виде мышечной слабости возни-

кают постепенно и не всегда сразу улавливаются родите-

лями. Начало болезни следует отнести к 6—14 месяцам

жизни и крайне редко позднее. Можно отметить опреде-

ленную последовательность в развитии парезов. Сперва

страдают проксимальные отделы нижних конечностей, а

затем в процесс вовлекаются верхние конечности, муску-

латура шеи и туловища. Преимущественное поражение ног

остается на протяжении всей жизни пациента. В типичном

случае начало заболевания относится ко второму полуго-

дию первого года жизни. Ребенок утрачивает те движения,

которые он ранее выполнял без труда. Так, если он само-

стоятельно садился, вставал на ноги, переступал, то эти

функции, требующие хорошей мышечной силы, постепен-

но утрачиваются, и новые не приобретартся. В начальном

периоде болезни атрофии не определяРтся, костные де-

формации не выражены. Глубокие рефлексы снижаются.

Вначале угасает коленный рефлекс. На первый план вы-

ступает мышечная слабость и гипотония. В тех случаях,

202

когда ходьба возможна (самостоятельная или с посторон-

ней помощью), походка раскачивающаяся, с опорой на вну-

тренние поверхности стоп. Бег невозможен. В разверну-

том периоде болезни клиническая симптоматика становит-

ся выраженной и достаточно стандартной. Заболевание

носит системный характер — страдает симметрично вся

поперечно-полосатая мускулатура. Однако преимущест-

венное поражение определенных мышечных групп созда-

ет типичные деформации конечностей, грудной клетки, по-

звоночника. Так, в нижних конечностях отмечаются сгиба-

тельные контрактуры в тазобедренных и коленных, разги-

бательные и отводящие в голеностопных суставах. Нижние

конечности принимают вид Х-образных. На верхних конеч-

ностях из-за контрактур ограничивается разгибание пред-

плечья и супинация кисти. Слабость мышц спины ведет к

деформации позвоночника в виде кифосколиоза, иногда с

ротаторным компонентом. Грудная клетка принимает фор-

му воронкообразной, реже — килеобразной («куриной»).

Весьма характерным клиническим признаком является

тремор верхних конечностей, усиливающийся при актив-

ных движениях. Тремор может быть выражен очень слабо,

и его не всегда замечают родители. В этом периоде болез-

ни дети не способны ходить, садятся с посторонней помо-

щью, опора на ноги отсутствует. Мышечные атрофии ста-

новятся отчетливыми. Они охватывают мускулатуру ниж-

них и верхних конечностей, грудной клетки и живота. Утра-

чиваются все глубокие рефлексы. Черепно-головная ин-

нервация поражается незначительно. Преимущественно

вовлекаются в процесс ядра XII, XI и в меньшей степени

VII пары. Мускулатура лица грубо не страдает, можно от-

метить лишь недостаточную мимическую активность. Поч-

ти всегда можно обнаружить признаки атрофии языка и

фибриллярные подергивания. Голос и плач больных не

громкий, что можно объяснить не столько слабостью голо-

совых связок, сколько недостаточной функцией дыхатель-

ной мускулатуры. Последняя является причиной частых

203

пневмоний, которые переносит ребенок на протяжении

жизни и приводят к летальному исходу. Интеллект больно-

го никогда не страдает, что отличает детскую спинальную

амиотрофию от некоторых других ранних форм нервно-

мышечных заболеваний. На всем протяжении заболева-

ния характерен общий гипергидроз. В процессе заболева-

ния усиливаются парезы, нарастают атрофии, становятся

более грубыми костные деформации как результат нару-

шения трофики. Наряду с мышечными атрофиями умень-

шается подкожный жировой слой, становятся заметнее

фасцикулярные подергивания мышц. Значительно реже в

процессе усиливающихся атрофии увеличивается подкож-

ножировой слой, тогда атрофии преимущественно можно

наблюдать только в языке. Течение заболевания неуклон-

но прогрессирующее. Продолжительность жизни может до-

стигать 15—18 лет. Любая интеркуррентная инфекция утя-

желяет течение болезни.

Ill тип детской спинальной амиотрофии известен как

болезнь Кугельберга-Веландер. Заболевание рассматри-

вается как мягкая форма. Это относится к клиническим

проявлениям, более медленному прогрессированию и боль-

шей продолжительности жизни. Начальные проявления мы-

шечной слабости отмечаются на втором году жизни, хотя

эти сроки могут быть более поздними. Периферические

парезы нижних конечностей обнаруживаются тогда, когда

к движениям ребенка предъявляются достаточно высокие

требования. Это — ходьба, бег, прыжки, вставание с пола,

подъем по лестнице. Нагрузка оказывается подчас непо-

сильной. Изменяется походка, ребенок раскачивается при

ходьбе, опирается на внутренние поверхности стоп. Опо-

ра при ходьбе осуществляется на выпрямленные в колен-

ных суставах конечности. Сгибание ног в коленных суста-

вах, очень легкое приседание ведут к падению. Использу-

ются вспомогательные движения при вставании, переме-

не положения из горизонтального в вертикальное. Утрачи-

вается способность прыгать и бегать, если она ранее име-

204

лась. В развернутой стадии болезни дети отличаются осо-

бенностями телосложения. Широкое межлопаточное про-

странство дополняется крыловидными лопатками. Как пра-

вило, усилен поясничный лордоз, выпячен вперед живот,

уплощена в передне-заднем направлении грудная клетка.

Эти деформации выражены не столь грубо, как подобное

имеет место при предыдущих формах. Парезы конечнос-

тей и мускулатуры шеи и туловища носят симметричный

генерализованный характер. Порядок вовлечения мышеч-

ных групп стереотипен. Первыми страдают проксимальные

отделы нижних конечностей и мышцы таза. Далее слабость

охватывает мышцы проксимальных отделов верхних конеч-

ностей и плечевого пояса. Постепенно становится замет-

ной слабость остальных мышц конечностей, спины, живо-

та. Ранее других угасают коленные рефлексы, затем двухи

трехглавых мышц верхних конечностей. Брюшные и подош-

венные рефлексы могут длительное время быть сохран-

ными или незначительно сниженными. Стопы имеют склон-

ность к плосковальгусной деформации. Атрофии мышц но-

сят диффузный характер. Фасцикулярные подергивания

наблюдаются в различных мышечных группах, наиболее ча-

сто в области надплечий, спины, груди. Гипотония опреде-

ляется во всех мышечных группах, что способствует избы-

точным движениям в суставах. Контрактуры в конечнос-

тях появляются только в поздних стадиях заболевания, в

период, когда самостоятельное передвижение больных ста-

новится невозможным. Респираторные инфекции у боль-

ных могут наблюдаться на протяжении всей жизни. Череп-

ные нервы грубо не страдают, могут иметь место легкая

атрофия языка и фасцикуляции. Продолжительность жиз-

ни больных более высокая, чем в предыдущих группах и

достигает 2—3 десятилетий. Подтверждение диагноза лю-

бого из трех типов детской спинальной амиотрофий дают

показатели электрофизиологического и морфологическо-

го исследований мышц. Электромиограмма свидетельству-

ет о патологическом процессе в моторных клетках перед-

205

них рогов спинного мозга. В мышечных биоптатах обнару-

живается так называемая пучковая атрофия.

2. Картирование гена SMA и генетическая характеристика

SMA-обпасти

Локус, ответственный за развитее всех трех форм дет-

ской спинальной мышечной атрофии, картируется в районе

5q12.2-q13, и сами эти заболевания представляют собой ал-

лельные варианты мутаций одного или, точнее, группы тесно

сцепленных генов (Daniels et al., 1992)- Картированию гена

SMA (spinal muscular atrophy) способствовало обнаружение

его тесного сцепления с высокоинформативным динуклео-

тидным микросателлитным повтором, локализованным в

длинном плече хромосомы 5 (Lein et Э1. 1991). Фланкирую-

щими маркерами SMA, расположенными на расстоянии око-

ло 2 сМ друг от друга, являются с дистальной стороны ДНК-

маркер D5S6 и с проксимальной — геИ МАР1 В, кодирующий

белок, ассоциированный с микротруб<?чками. Область лока-

лизации этих генов площадью около 850 кб — SMA область —

содержит большую инвертированную дупликацию и характе-

ризуется присутствием многих повторяющихся низкокопий-

ных элементов, множественных копий отдельных генов, нео-

бычных экспрессирующихся интрон-сЭДержащих псевдоге-

нов, функциональные копии которых разбросаны по всему

геному. Среди низкокопийных элементов в SMA-области осо-

бенно обильно представлены повторы, специфичные только

для хромосомы 5 и локализованные в областях 5q13-14,5q11 -

13, 5q31 и 5q35 (Melki et al., 1994; Francis et al., 1995). Bo

многих локусах SMA-области идентифицированы гипервари-

абельные микросателлитные повторы, й по крайней мере два

из них AG1-CA и САТТ1 представляют гобой примеры муль-

тилокусного мультиаллельного полиморфизма. В каждой хро-

мосоме 5 эти локусы или сублокусы мсгут быть представле-

ны одной—пятью копиями. Эта изменчивость возникает по-

средством делеций/дупликаций и определенно указывает на

геномную нестабильность SMA-области- Генетическая струк-

206

тура этой области напоминает структуру 600-кб-сегмента HLA

класса III хромосомы 6, содержащего гены С4А и С4В ком-

племента, CYP21 ген стероидной гидроксилазы 21 и псевдо-

ген этого гена CYP21P, псевдоген рибосомального белка —

RPL32PH 2 других локуса ХА и ХВ, гомологичных гену тенан-

сцина, функциональная копия которого локализована в 9q33.

При этом гены С4 могут быть представлены в 1—3 копиях по

типу мультилокусных полиморфных локусов САТТ1 и AG1-

СА SMA-области. Псевдогены HLA III области экспрессиру-

ются, но при трансляции не образуется функциональных про-

дуктов. Мутационные повреждения СУР21-гена, главным

образом делеций и конверсии между CYP21 и CYP21Р, явля-

ются причиной адрено-генитального синдрома, частота кото-

рого (1:12 ООО) сопоставима с частотой спинальной мышеч-

ной атрофии. Таким образом, этот район 6р, подобно SMA-

области 5q, содержит множественные копии отдельных ге-

нов, экспрессирующиеся интрон-содержащие псевдогены и

локус, гомозиготные делеций или конверсии которого явля-

ются причиной развития аутосомно-рецессивного заболева-

ния — адрено-генитального синдрома.

Наличие большого числа повторяющихся элементов в

SMA-области затрудняет клонирование ДНК и большинство

космидных, фаговых и YAC-клонов, изолированных из этих

районов, содержат множественные внутренние делеций и/

или дупликации. Поиск кандидатного гена для SMA был ос-

ложнен также в связи с присутствием в этой области боль-

шого числа необычных разбросанных по всему геному псев-

догенов, имеющих высокий процент гомологии с экзонами

функциональных генов. Примерами таких необычных псев-

догенов являются независимо идентифицированные в раз-

ных лабораториях в SMA-области и в 5р13-р14 — областях

последовательности, имеющие 90% идентичности с экзона-

ми гена бета-глюкуронидазы, функциональная копия которо-

го локализована в хромосоме 7. Обнаружены две «вариант-

ные» формы гена РМСН, кодирующего промеланин-концент-

рирующий гормон. Функциональный ген РМСН расположен

207

в 12-й хромосоме. В SMA-области также локализован экс-

прессирующийся псевдоген нейронального кадхерина — но-

вого члена семейства кадхериновых генов, функциональная

копия которого картирована в 5р13-р14 (Thompson et al.,

1995). Большинство псевдогенов имеют как экзонные, так и

интронные области, а также содержат множественные стоп

кодоны, препятствующие образованию функциональных бел-

ковых продуктов. Однако сами последовательности псевдо-

генов включаются в процессированные мРНК, транскриби-

руемые с SMA-области. Поэтому при идентификации коди-

рующих последовательностей в SMA-области с использова-

нием современных методов позиционного клонирования не-

обходимо исследовать, действительно ли отобранный экзон

является частью функционального гена, который может бать

кандидатным для SMA, или это фрагмент нефункционально-

го псевдогена. Доказательство функциональности экспрес-

сирующихся последовательностей требует использования

достаточно трудоемких методов.

3. Идентификация и молекулярная характеристика гена

SMN

Несмотря на эти сложности, из SMA-области методом

улавливания экзонов было изолировано достаточно много

кодирующих последовательностей (Thompson et al., 1995; van

der Steege et al., 1995a). Эти экзоны были использованы для

скрининга различных тканеспецифических библиотек генов.

Результатом данной работы явилась изоляция 20 кДНК-кло-

нов, 17 из которых были дуплицированы в SMA или в других

областях генома либо содержали высокоповторяющиеся по-

следовательности. Одна из трех оставшихся уникальных

кДНК — XS2G3 — не имела гомологии ни с одним из извест-

ных генов. Более того, область геномной ДНК, гибридизую-

щейся с этим кДНК-зондом, оказалась полностью делетиро-

вана более чем у 50% пациентов со спинальной мышечной

атрофией типа I. При проведении подобного анализа у

245 здоровых людей, включая 143 облигатных гетерозигот,

208

гомозиготная делеция была обнаружена только у двух роди-

телей пациентов со спинальной мышечной атрофией. На ос-

новании этих результатов было высказано предположение,

что XS2G3 является частью гена, кандидатного для SMA. Ме-

тодом нозерн блот-гибридизации было показано, что этот ген

экспрессируется во множестве тканей. Большое количество

6.5-кб транскрипта обнаруживается в скелетных мышцах, два

типа мРНК размером примерно 1.9 и 1.2 кб найдены в под-

желудочной железе.

Одновременно с этими исследованиями в двух разных

лабораториях методами позиционного клонирования из SMA-

области были изолированы два различных экспрессирующих-

ся функциональных гена, полностью делетированные у боль-

шинства больных со спинальной мышечной атрофией. Наи-

более значимым из них оказался ген, расположенный в ло-

кусе D5S125 и названный авторами геном выживания дви-

гательных нейронов — SMN (survival motor neurons) (Lefebvre

et al. 1995). Размер гена составляет 20 ООО пар оснований,

его кодирующая часть разделена на 8 экзонов, причем вось-

мой экзон не транслируется. SMN — высококонсервативный

ген. Его ортологи найдены у нематоды Caenorhabditis elegans

и у дрожжей Schizosaccharomyces pombe.

Ген SMN оказался дуплицирован в области 5q12.2-q13.

Его копия, располагающаяся несколько ближе к центроме-

ре, — SMN

или SMN2 — также транскрибируется, хотя и от-

личается от теломерной копии гена — SMN* или SMN1— на-

личием пяти точечных мутаций. При этом в кодирующей об-

ласти гена обнаружены только две замены — одна из них в

экзоне 7, а другая в экзоне 8. Эти две мутации позволяют

отличить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их

исследования методом SSCP анализа. Ген первоначально был

назван CBCD541 по аналогии с первым вариантом названия

теломерной копии — tBCD541. Ген SMN2 экспрессируется,

но, в отличие от гена SMN1, его кДНК подвергается альтер-

нативному сплайсингу с утратой экзона 7. Оказалось, что ген

SMN2 может отсутствовать либо, наоборот, быть представ-

лен несколькими копиями (Lefebvre et al. 1995). У разных ин-

дивидуумов число копий SMN2 на диплоидный геном варьи-

рует в пределах от 0 до 5. В общей популяции ген SMN2 от-

сутствует у 6.7% индивидуумов, представлен одной копией у

13.3%, двумя копиями — у 73.3% и у 6.7%индивидуумов чис-

ло копий на диплоидный геном больше двух (Velasco et al.,

1996). С использованием метода твердофазного мини-сек-

венирования показано присутствие трех различных доми-

нантных гаплотипов по соотношению количества теломерных

и центромерных копий SMN-гена в группе нормальных инди-

видуумов и в семьях больных (Schwartz et al., 1997).

4. Идентификация мутаций у пациентов со спинальной

мышечной атрофией

Около 93% больных со спинальной мышечной атрофи-

ей любого типа несут гомозиготные делеции области локали-

зации теломерной копии гена — SMN1. Остальные пациенты

содержат подобные делеции в гетерозиготном состоянии, при

этом в гомологичной хромосоме у них обнаруживаются либо

сплайсинговые мутации, реализующиеся в виде инсерций/

делеций в мРНК гена SMN1, либо миссенс-мутации, локали-

зованные чаще всего в З'-районе гена SMN1. У одного из

пациентов с первым типом спинальной мышечной атрофии

идентифицирована дукпликация 11 нуклеотидов в 6 экзоне

гена SMN1 (Parsons et al., 1996). Полученные данные были

убедительно подтверждены в последующих исследованиях

(Brahe et al., 1996; Williams et al., 1996) и дали основание для

того, чтобы именно данную теломерную копию гена SMN счи-

тать ответственной за заболевание.

Показано, что при делеции теломерной копии гена SMN

центромерная копия экспрессируется более интенсивно.

Примерно у 5% больных центромерная копия SMN2 оказы-

вается вовлеченной в гомозиготную делецию. Эта цифра со-

поставима с процентом лиц контрольной группы, не имею-

щих центромерной копии SMN2. Среди всех обследованных

больных со спинальной мышечной атрофией не обнаружены

210