Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

6) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IA (MIM: 118220;

145900); нейропатия наследственная со

склонностью к развитию парезов вследствие

сдавления ствола нерва (MIM: 162500)

1. Картирование гена СМТ1А

Более чем в половине семей с типичным течением бо-

лезни Шарко-Мари-Тус I типа не обнаруживается сцепления с

генетическими маркерами хромосомы 1, и в частности с геном

Fy, определяющем группу крови Даффи. Это позволило выдви-

нуть предположение о существовании двух генетических форм

заболевания 1А и 1В со сходной клинической картиной, а сле-

довательно, и о наличии другого, отличного от MPZ гена, ответ-

ственного за развитие невральной амиотрофий Шарко-Мари-

Тустипа 1А — СМТ1А. Действительно, оказалось, что в тех се-

мьях, где не обнаруживается сцепления с геном Fy, наблюдает-

ся косегрегация заболевания с определенными аллелями двух

маркерных локусов перицентрического района короткого пле-

ча хромосомы 17 — D17S58 и D17S71 (Middleton-Price et al.,

1990; Nicholson et al., 1989). При более детальном генетическом

анализе сцепления, выполненном в одной большой бельгийской

семье, в которой на протяжении многих поколений наблюдали

больных с моторно-сенсорной нейропатией, было показано, что

ген СМТ1А локализован в области 17р12-р11.2 между марке-

ром D17S71 и геном MYH2, кодирующим полипептид-2 тяжелой

цепи миозина скелетных мышц (Timmerman et al., 1990). В даль-

нейшем были идентифицированы многочисленные фланкиру-

ющие ДНК-маркеры и составлена карта области локализации

СМТ1А-гена настолько подробная, что расстояние между дву-

мя соседними маркерами не превышает 0.5 сМ (Patel et al 1990;

Lebo et al., 1992).

2. Молекулярно-генетическая характеристика

СМТ1Аобласти

Значительный прогресс в понимании молекулярно-ге-

нетических основ невральной амиотрофий Шарко-Мари-Тус

231

1А типа связан с обнаружением у многих неродственных па-

циентов гетерозиготных дупликаций различной протяженно-

сти, расположенных в коротком плече хромосомы 17 в обла-

сти локализации дефектного гена — в так называемой

СМТ1А-области (Lupski et al., 1991). При моногенном забо-

левании подобное нарушение, сопровождающееся сегмент-

ной трисомией, описано впервые. Наличие таких дуплика-

ций в геноме человека, по-видимому, является одним из

возможных механизмов доминантного типа наследования.

Частота дупликаций в области 17р11.2 у пациентов с бо-

лезнью Шарко-Мари-Тус I типа достигает 68%, причем в

некоторых случаях удается проследить возникновение по-

добной перестройки de novo (Wise et al., 1993). Ни у одного

из исследованных пациентов с типом II невральной амиот-

рофии Шарко-Мари-Тус дупликаций в 17 хромосоме не было

найдено. Молекулярный анализ дупликаций этой области

позволяет проводить дифференциальную диагностику па-

циентов с периферическими нейропатиями. Наиболее ин-

формативным методом молекулярной диагностики дупли-

каций является идентификация с помощью гель-электро-

фореза в пульсирующем поле необычных рестрикционных

фрагментов (junction), образующихся на границах вовле-

ченных в перестройку участков ДНК. У разных пациентов

дупликации могут включать различные ДНК-маркеры,

фланкирующие ген СМТ1 А, и наиболее частым из них ока-

зывается D17S122. Дупликации представляют собой пря-

мые тандемные повторы, что было показано с использо-

ванием различных молекулярных методов анализа

(Valentijn et al., 1992а; Pentao et al., 1992). Минимальная

оценка размера дупликаций составляет 1100 кб. В то же

время описаны пациенты, у которых размер дуплицирован-

ного фрагмента настолько велик, что перестройка видна

при цитогенетическом анализе. В видимые дупликации ока-

зываются вовлеченными все ДНК-маркеры, дуплицирован-

ные у пациентов с более короткими перестройками, плюс

дополнительные маркеры, фланкирующие с двух сторон

232

СМТ1А-область. В гораздо более редких случаях СМТ1А-

область оказывается не дуплицированной, а делегирован-

ной (Chance et al., 1993).

Сопоставления между расстояниями на генетической

и физической картах показывают, что район 17р11.2 являет-

ся горячей точкой рекомбинации, и это может быть причи-

ной его генетической нестабильности. Эта гипотеза в даль-

нейшем нашла экспериментальное подтверждение. Так, в об-

ласти 17р12-р11.2 было идентифицировано несколько низко-

копийных повторов, один из которых — СМТ1A-REP — явля-

ется достаточно протяженным и составляет 17 килобаз

(Pentao et al., 1992; Chance et al., 1994). У одного из пациен-

тов данный повтор фланкировал дуплицированную область

размером 1.5 Мб на нормальной хромосоме и был представ-

лен дополнительной копией на хромосоме с дупликацией. По-

добное расположение CMTIA-REP-повторов согласуется с

предположением о том, что возникновение дупликаций de

novo может происходить в мейозе за счет неравного крос-

синговера, обусловленного ошибочным выстраиванием этих

последовательностей при спаривании гомологичных хромо-

сом. Делеций СМТ1 А-области, по-видимому, являются реци-

прокными продуктами неравного кроссинговера. В прямых

экспериментах по изучению родительского происхождения

дупликаций было показано, что во всех 9 проанализирован-

ных спорадических случаях дупликации возникли в сперма-

тогенезе и явились следствием неравного обмена между не-

сестринскими хроматидами (Palau etal., 1993). Показано, что

в редких случаях материнского происхождения делеций

17р11.2 области являются следствием внутрихромосомных

перестроек (LeGuern et al., 1996).

3. Нейропатия наследственная со склонностью к развитию

парезов вследствие сдавления ствола нерва

У пациентов, несущих делеций в СМТ1 А-области, на-

блюдается склонность к периодическим парезам с утратой

чувствительности вследствие сдавления ствола нерва, уси-

233

ливающихся при травматических повреждениях. В большин-

стве случаев пациенты с данной формой нейропатии восста-

навливаются за несколько дней или недель, но часто могут

наблюдаться рецидивы с тенденцией к сохранению парезов

в течение более длительного периода. При исследовании би-

оптатов периферических нервов наблюдаются фокальные

утоньшения миелиновой оболочки в участках нервного во-

локна между соседними перехватами Ранвье. Оказалось, что

подобная доминантная форма нейропатии со склонностью к

развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва

(HNPP — MIM 162500) чаще всего связана с делециями об-

ласти 17р11.2 (Cance et al., 1993; LeGuern et al., 1994). Раз-

мер делеций, как правило, составляет 1.5 Мб и они включа-

ют те же самые ДНК-маркеры, которые оказываются вовле-

ченными в дупликации при болезни Шарко-Мари-Тус 1А типа.

4. Идентификация гена РМР22

Параллельно с анализом молекулярной природы мута-

ций, лежащих в основе развития невральной амиотрофии

Шарко-Мари-Тус IA типа, проводились интенсивные поиски

модели этого заболевания среди существующих генетичес-

ких линий мышей. Было высказано предположение, что ауто-

сомно-доминантно наследуемая гипомиелиновая нейропатия

у мышей в мутантной линии Trembler (Тг) может служить по-

добной моделью (Vance, 1991). Основаниями для этого пред-

положения явились два факта — сходство между фенотипом

мутантных мышей и клиническими симптомами заболевания,

а также локализация мышиного гена Тг на 11 хромосоме, син-

тенной 17-й хромосоме человека, где предположительно кар-

тировался ген СМТ1 А. В двух независимо полученных гене-

тических линиях Trembler удалось идентифицировать 2 раз-

личные точковые мутации в одном и том же гене Gas-З, ко-

дирующем потенциально рост-регулирующий миелиновый

белок с молекулярным весом 22 кД (Suter et al., 1992). Се-

мейство мышиных генов Gas, кодирующих белки негативно-

го контроля роста клеток (арест-специфические белки рос-

234

та), было клонировано методом субтрактивной гибридизации

на основе различной экспрессии в покоящихся и делящихся

клетках (Schneider et al., 1988). 6 из этих генов картировано

и один из них — Gas-З оказался локализован в 11-ой хромо-

соме на 44 сМ проксимальнее мышиного гена р53. Gas-З ко-

дирует мембранный белок, получивший название Ртр-22 —

периферический миелиновый белок-22.

С помощью мышиного гена Gas-З удалось изолировать

кДНК и геномные клоны гена РМР22 (peripheral myelin protein-

22) человека (Patel et al., 1992). Было показано, что ген РМР22

локализован в области 17р12-р11.2, дуплицированной у па-

циентов с болезнью Шарко-Мари-Тус 1А типа (Timmerman et

al., 1992; Matsunami et al., 1992). Этот ген активно экспресси-

руется в клетках Шванна и в тканях периферических нервов.

Белковый продукт гена РМР22 локализован главным обра-

зом в компактном миелине периферической нервной систе-

мы, состоит из 160 аминокислот и является интегральным

мембранным белком с 4 трансмембранными доменами.

Окончательным доказательством идентичности генов СМТ1А

и РМР22 явилось обнаружение специфических мутаций в

РМР22-гене у тех относительно немногих пациентов с болез-

нью Шарко-Мари-Тус IA типа, у которых СМТ1 А-область не

дуплицирована (Valentijn et al., 1992b; Roa et al., 1993a). Одна

из этих миссенс-мутаций в гене РМР22 — L16P оказалась

гомологичной той, которая была идентифицирована в гене

Gas-З мышиной линии Trembler (Valentijn etal., 1992b). В пред-

варительных исследованиях, проведенных в данной семье,

было показано тесное сцепление мутантного гена с ДНК-мар-

керами, локализованными в районе 17р11.2, что позволило

отнести этих больных к типу 1А невральной амиотрофий Шар-

ко-Мари-Тус. Однако у большинства пациентов в этой семье

болезнь протекала в крайне тяжелой форме, и на основании

клинических, нейрофизиологических и морфологических кри-

териев многим из них мог быть поставлен диагноз синдрома

Дежерина-Сотта (Hoogendijk et al., 1993). Кроме того, две дру-

гие миссенс-мутаций в РМР22-гене — М69К и S72L иденти-

235

фицированы в семьях с клиническим диагнозом болезни

Дежерина-Сотта, что еще раз свидетельствует о том, что этот

синдром не является самостоятельной нозологической фор-

мой (Roa et al., 1993b). Одна из пациенток с тяжелой формой

болезни Шарко-Мари-Тус I типа оказалась компаунд гетеро-

зиготой по рецессивной миссенс-мутации в РМР22-гене и 1.5-

Мб делеции, локализованной в 17р12-р11.2 (Roa et al., 1993b).

Ее сын, гетерозиготный по миссенс-мутации в РМР22 гене,

был здоров. В то время как двое родственников этой женщи-

ны, гетерозиготные носители 1.5-Мб делеции, были больны

наследственной нейропатией со склонностью к парезам

вследствие сдавления ствола нерва.

5. Мутации в гене РМР22

Преобладающим типом мутационных повреждений в

гене РМР22 у пациентов с невральной амиотрофией Шарко-

Мари-Тус 1А типа являются дупликации. По данным разных

авторов, они были обнаружены в 68% (Wise et al.,1993), 92%

(lonasescu etal., 1993), 82% (Mostacciuoloetal., 1995) и в91%

семей с СМТ1 (lonasescu et al., 1995), а также в 9 из 10 спо-

радических случаев заболевания (Hoogendijk et al., 1992).

Таким образом, СМТ1А является уникальным случаем на-

следственной частичной трисомии, при которой идентифици-

рован главный и, возможно, единственный ген, связанный с

данной патологией. Другим локусом, гиперэкспрессия кото-

рого приводит к тяжелым неврологическим состояниям, по-

видимому, является недавно идентифицированный по ана-

логии с геном minibrain (mnb) Drosophila melanogaster ген MNB,

кодирующий серинтреонинпротеинкиназу, играющую сущест-

венную роль в постэмбриональном нейрогенезе (Guimera et

al., 1996). MNB локализован в бенде 21 q22.2, входящем в кри-

тический для синдрома Дауна район (DSCR), трисомия по

которому и определяет фенотип заболевания. Ген MNB ак-

тивно экспрессируется в тех структурах мозга, которые по-

ражаются при синдроме Дауна. Все это дает основания пред-

полагать, что гиперэкспрессия MNB может быть определяю-

236

щим следствием трисомии хромосомы 21 в развитии синдро-

ма Дауна.

6. Генетические модели болезни Шарко-Мари-Тус IA типа

Мы уже упоминали о том, что спонтанно отобранные

генетические линии мышей Trembler с гипомиелиновой ней-

ропатией, наследуемой по аутосомно-доминантному типу,

могут рассматриваться в качестве моделей болезни Шарко-

Мари-Тус 1А типа, так как у мутантных животных присутству-

ют мутации в гене Gas-З, гомологичном гену РМР22 челове-

ка (Vance, 1991). Идентифицированные у мышей мутации

затрагивают домены, предположительно ассоциированные с

мембраной. Кроме того, методом направленного разруше-

ния гена («нокаут») получена трансгенная линия Ртр22-де-

фицитных мышей с доминантно наследуемой периферичес-

кой нейропатией (Adlkofer et al., 1995).

Хотя генетические линии Trembler, так же как и транс-

генная линия Ртр22-дефицитных мышей, являются адекват-

ными моделями данной формы полинейропатии, обусловлен-

ной точковыми мутациями в гене РМР22, они не могут ис-

пользоваться для анализа молекулярных последствий гипер-

экспрессии этого гена. Для анализа фенотипических послед-

ствий мутаций подобного типа была сконструирована транс-

генная линия мышей, содержащих около 8 дополнительных

экспрессирующихся копий гена РМР22 человека (Huxley et

al., 1996). Эта линия была создана путем прямой инъекции в

пронуклеус соответствующей генетической конструкции, на-

ходящейся в составе дрожжевого вектора (YAC). Дрожжевые

искусственные хромосомы являются идеальными векторами

для создания подобных модельных линий животных, так как

они содержат регуляторные элементы, обеспечивающие вы-

сокий уровень тканеспецифической экспрессии. Оказалось,

что у мутантных животных этой трансгенной линии развива-

ется доминантно наследуемая нейропатия, сходная с болез-

нью Шарко-Мари-Тус I типа с прогрессирующей слабостью

передних конечностей и значительной демиелинизацией пе-

237

риферической нервной системы с появлением луковицепо-

добных образований. Уровень экспрессии введенного гена

РМР22 оказывает прямое влияние на степень демиелиниза-

ции, не меняя при этом ее характер. Гистологический и

электрофизиологический анализ пяти подобных трансген-

ных линий мышей, несущих от одной до семи дополнитель-

ных копий гена РМР22, показал, что патологический про-

цесс находится в прямой зависимости от уровня экспрес-

сии трансгена (Huxley et al., 1996). Когда отношение меж-

ду человеческими и мышиными мРНК оказывается мень-

ше 0.8, никаких аномалий не наблюдается. При значениях

этого соотношения, лежащих в диапозоне от 0.8 до 1.5,

поведенческих признаков нейропатии у мышей не обнару-

живается, однако выявляются гистологические аномали-

ии и нарушения в скорости проведения нервного импуль-

са. При соотношениях, больших 1.5, между уровнями экс-

прессии периферического миелинового белка-22 челове-

ка и мыши у трансгенных животных развивается тяжелая

форма нейропатии. Таким образом, линии мышей с гипер-

экспрессией гена РМР22 являются наиболее адекватны-

ми моделями для болезни Шарко-Мари-Тус 1А типа и пер-

спективны для разработки и испытания различных тера-

певтических подходов применительно к данному заболе-

ванию, включая отработку методов генной терапии.

в) Х-сцепленная моторная и сенсорная нейропатия

(MIM: 302800 -304040;302801; 302802; 310490)

Хорошо доказано существование Х-сцепленных доми-

нантных форм болезни Шарко-Мари-Тус. Так, в одной из се-

мей было прослежено наследование заболевания на протя-

жении 6 поколений (Woratz, 1964). У10 больных отцов в этой

семье рождались только больные дочери (15 человек), в то

время как все их 8 сыновей были здоровы. У больных мате-

рей, которых в этой семье насчитывалось 26, рождались как

здоровые, так и больные дети, причем среди последних было

23 сына и 21 дочь. У мужчин болезнь протекала тяжелее, чем

238

у женщин, то есть наблюдалось частичное доминирование

мутантных аллелей. Примеры подобных семей не являются

единичными (Phillips et al., 1985; Fischbeck et al., 1986).

При генетическом анализе подобных семей было най-

дено тесное сцепление мутантного гена СМТХ1 с ДНК-мар-

керами, локализованным в проксимальной части длинного

плеча X хромосомы — Xq13-q21 (Bone et al., 1986; Gal et al.,

1985). Ближайшим проксимальным маркером гена СМТХ1

является ген PGK1, кодирующий 3-фосфоглицераткиназу, а

дистальным — DXS72 (Goonewardena et al., 1988; Bergofen et

al., 1993). Одновременно в той же области Х-хромосомы был

картирован ген Сх32, кодирующий один из бета-коннексинов

(Corcos et al., 1992). Группа белков, получивших название

коннексины, была изолирована из клеточных фракций, обо-

гащенных структурами, образующими канальные контакты

между соседними прикрепленными к субстрату клетками (gap

junction). Подобные регионально специализированные струк-

туры на плазменных мембранах контактирующих клеток впер-

вые были охарактеризованы с помощью электронной микро-

скопии. Коннексины участвуют в образовании межклеточных

каналов за счет совмещения мембранных пор (Sosinsky,

1995). По этим каналам может осуществляться прямой об-

мен небольшими молекулами и ионами между соседними

клетками и роль таких контактов особенна важна в синапти-

ческой передаче. Коннексины, изолированные из различных

тканей, представляют собой разные белки. Их классифика-

ция производится по молекулярному весу и эта цифра выне-

сена в название белка. Кроме того, на основе структурного

сходства все коннексины делят на 2 группы: альфа и бета.

Коннексин 32 — это бета-белок с молекулярным весом 32 кД,

обильно представленный в клетках печени. Ген Сх32 актив-

но экспрессируется в периферической нервной системе.

Цитогенетическая локализациия гена и характер его экспрес-

сии явились основаниями для исследования Сх32 в качестве

кандидатного гена, дефектного при Х-сцепленной форме до-

минантной полинейропатии (Bergofen et al., 1993).

239

При прямом секвенировании кодирующих областей гена

СХ32 у пациентов из различных семей с Х-сцепленной доми-

нантной формой болезни Шарко-Мари-Тус были идентифи-

цированы различные точковые мутации и микроделеции

(Guern et al., 1995; Nelis et al., 1996). Таким образом идентич-

ность генов СМТХ1 и СХ32 была доказана. Недавно было

показано, что наследственные дефекты двух других бета-кон-

нексинов 26 и 31 лежат в основе развития двух различных

форм изолированной нейросенсорной тугоухости (Zelante et

al., 1997; Xia et al., 1998). Напомним, что тугоухость как симп-

том нередко входит в комплекс полинейропатий.

В ряде семей сцепленные с полом формы невральной

амиотрофии Шарко-Мари-Тус наследуются по рецессивному

типу. Еще в прошлом веке была описана семья, в которой на

протяжении 4 поколений наблюдали 20 больных мужчин

(Heringham, 1889). Три подобные семьи были описаны в 1944

году (Erwin, 1944). При генетическом анализе этих семей,

выполненном сравнительно недавно, было показано, что в

одной из них мутантный ген СМТХ2 сцеплен с маркерами

короткого плеча Х-хромосомы, локализованными в Хр22.2,

тогда как в двух других семьях заболевание обусловлено

мутациями в другом гене СМТХЗ, тесно сцепленном с мар-

керами длинного плеча Х-хромосомы — Xq26 (2.11) (lonasescu

et al., 1992).

В длинном плече Х-хромосомы картируется ген, свя-

занный с необычной рецессивно наследуемой формой мо-

торно-сенсорной нейропатии Шарко-Мари-Тус II типа, сопро-

вождающейся нейросенсорной тугоухостью и/или умственной

отсталостью. Это заболевание получило название синдрома

Ковчока (Cowchock). Несмотря на явные клинические отли-

чия, не исключено, что этот синдром связан с реорганизацией

областей ДНК, смежных с геном СМТХ1 или двух других СМТ-

генов, расположенных на Х-хромосоме (Fischbeck et al., 1986).

К числу болезней, обусловленных реорганизацией

смежных генов (contiguous gene syndrome), следует, по-ви-

димому, отнести и те случаи, когда рецессивная, сцепленная

240