Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

случаи одновременной делеций обоих гомологичных SMN-

генов. Возможно, такая аберрация проявляется как доми-

нантная леталь еще в эмбриогенезе. Наличие гомозиготных

делеций или повреждающих мутаций в SMNI-гене, является

необходимым, но недостаточным условием для развития бо-

лезни, так как в небольшом проценте случаев обнаружива-

ются гомозиготные делеций в гене SMN1 у здоровых родст-

венников больных (Cobben et al., 1995; Wang et al., 1996).

Описано несколько полиморфизмов в гене SMN1 (Wang et

al., 1996; Velasco et al., 1996). Один из них в экзоне 7 может

быть при проведении молекулярной диагностики ошибочно

принят за делецию этого экзона. Другая полиморфная нейт-

ральная мутация приводит к образованию гибридного гена

SMN, в котором экзон 7 теломерной копии гена сочетается с

экзоном 8 SMN2. Такая аберрация, по-видимому, возникает

за счет генной конверсии между теломерной и центромер-

ной копиями SMN. Поскольку экзон 8 не транслируется, гиб-

ридный ген может быть полностью функционален.

5. Характер экспрессии гена SMN

Теломерная и центромерная копии гена SMN активно

экспрессируются во многих типах тканей с образованием

мРНК размером в 1700 п.о. (Liu, Dreyfuss, 1996). Особенно

высокие уровни экспрессии наблюдаются в мозге, почках и

в печени, умеренные — в скелетных и сердечной мышцах и

низкие уровни экспрессии характерны для фибробластов и

лимфоцитов.

С использованием набора антител, сконструированных

на разные детерминанты белка, показано, что белок выжи-

вания двигательных нейронов присутствует в цитоплазме и в

ядрах клеток (Liu, Dreyfuss, 1996). Ядерная форма белка най-

дена в структурах, названных темами (gem от 'Gemini of the

coiles bodies'). Эти новые структуры внутри спиральных тел

размером 0.1-1 микромикрон выявляются пока только анти-

телами против белка выживания двигательных нейронов. По-

видимому, они ассоциированы с гетерогенными ядерными

211

рибонуклеопротеинами, предположительно участвующими в

метаболизме и в процессинге мРНК. Показано, что гемы вну-

три спиральных тел ко-локализованы со сплайсеосомальны-

ми факторами.

С использованием метода иммуноблота показано, что

характер экспрессии гена SMN заметно меняется в постна-

тальном периоде по сравнению с эмбриональным (Burlet et

al., 1998). Во всех тканях плода, за исключением скелетных

мышц, белок выживания двигательных нейронов имеет диф-

фузное распределение в цитоплазме. При иммуногистохи-

мическом анализе мышц обнаруживается пятнистое окраши-

вание, что позволяет предполагать ассоциацию SMN-белка

с большими цитоплазматическими структурами, сходными по

величине с темами. Седиментационный анализ показывает,

что SMN-белок тесно ассоциирован с тяжелыми комплекса-

ми, не связанными с мембранами. Эти результаты указыва-

ют на важную роль белка выживания двигательных нейро-

нов в эмбриональном развитии.

Иммуногистохимический анализ показал, что в фибро-

бластах, лимфобластах и в мышцах пациентов не наблюда-

ется резкого снижения количества SMN-белка (особенно при

наиболее тяжелом первом типе заболевания), однако число

гемов значительно уменьшено, причем это уменьшение по-

ложительно коррелирует с тяжестью течения заболевания

(Coovert et al., 1997). Подобный анализ гемов в культивируе-

мых первичных фибробластах больных может быть исполь-

зован как очень эффективный диагностический тест. Кроме

того, в отличие от других тканей, в спинном мозге пациентов

с первым типом заболевания наблюдается резкое, почти

100-кратное снижение общего количества продукта гена SMN,

что находится в соответствии с клиническим течением этой

формы спинальной мышечной атрофии. Заметно снижено ко-

личество этого белка и в скелетных мышцах больных.

Идентификация крысиного гомолога SMN и конструи-

рование антител на продукт этого гена позволили провести

исследование характера его экспрессии в ЦНС с использо-

212

ванием иммуногистохимического анализа и метода гибриди-

зации in situ с мРНК (Battaglia et al., 1997). У новорожденных

и взрослых животных белок выживания двигательных нейро-

нов локализован главным образом в цитоплазме нейронов и

особенно обильно представлен в нижних двигательных ней-

ронах. Присутствие мРНК гена SMN зарегистрировано в пла-

стинке дуги IX грудного позвонка. Подобный характер экс-

прессии гена SMN не противоречит предположению о том,

что отсутствие белка выживания двигательных нейронов,

наблюдаемое у подавляющего большинства пациентов со

спинальными амиотрофиями, является причиной специфи-

ческой дегенерации нейронов.

Обнаружены два альтернативных транскрипта гена

SMN: полноразмерный и с делецией области, соответствую-

щей экзону 7 (Gavrilov et al., 1998). Делетированная изофор-

ма транскрибируется исключительно с гена SMN2. В норме

количество полноразмернй изоформы РНК-транскрипта в

лимфобластозных клеточных линиях вдвое выше по сравне-

нию с делетированной. В культурах клеток пациентов с лю-

бой формой спинальной мышечной атрофии полноразмер-

ная изоформа составляет лишь 55—60% по сравнению с нор-

мой. При этом клетки пациентов со спинальной мышечной

атрофией типа I и II продуцируют соответственно на 27% и на

21% больше альтернативного транскрипта, в то время как в

клетках пациентов с типом III заболевания количество аль-

тернативного транскрипта на 54% меньше по сравнению с

контролем. Эти данные подтверждают вклад SMN2-reHa в

патогенез спинальной мышечной атрофии.

6. Функции белка выживания двигательных нейронов

Продуктом гена SMN является ранее неизвестный бе-

лок, состоящий из 294 аминокислот, с молекулярным весом

38 кД. Этот белок содержит домен модулярной олигомериза-

ции, кодируемый экзоном 6 (Lorson et al., 1998). Подавляю-

щее большинство идентифицированных миссенс-мутаций в

гене SMN1 приводят к аминокислотным заменам именно в

213

этом домене или в непосредственной близости от него. При

этом наблюдается прямая корреляция между степенью на-

рушения процесса олигомеризации и тяжестью течения спи-

нальной мышечной атрофии. Продукт центромерной копии

SMN2, кодируемый экзонами 1—6, но не 7, имеет уменьшен-

ную способность к самоассоциации. По-видимому, наруше-

ние способности к олигомеризации является первичным би-

охимическим дефектом при спинальной мышечной атрофии

и течение заболевания определяется содержанием в клет-

ках компетентных по олигомеризации форм белка выжива-

ния двигательных нейронов.

В карбокси-терминальном районе SMN-белка иденти-

фицирован высококонсервативный тирозин-глициновый трип-

лет (YxxG)3, сходный по структуре с RGG-боксами РНК-свя-

зывающих белков (Talbot et al., 1997). Примечательно, что пять

миссенс-мутации расположены именно в этой (Уххв)-трип-

лицированной области, что является дополнительным указа-

нием на ее функциональную значимость (Lefebvre et al., 1995;

Talbot et al., 1997; Hahnen et al., 1997). Эти данные также рас-

сматриваются как косвенные подтверждения возможного

участия белка выживания двигательных нейронов в метабо-

лизме мРНК. Однако они не объясняют, почему мутации в

гене SMN ведут к такому специфическому нейромышечному

поражению.

Биохимический анализ подтвердил критическую роль

продукта гена SMN в процессинге РНК и его участие в биоге-

незе рибонуклеопротеинового комплекса сплайсеосом

(Lefebvreet al., 1998). Район белка выживания двигательных

нейронов, кодируемый экзоном 2, непосредственно участ-

вует в связывании РНК, а также обладает связывающей ак-

тивностью по отношению к однонитевой и двунитевой ДНК

(Lorson, Androphy, 1998). Этот домен гомологичен факторам

связывания нуклеиновых кислот, включая некоторые белки,

содержащие высокомобильные группы (НМб).Обнаружение

в этом домене миссенс мутации, резко уменьшающей РНК-

связывающую активность SMN-белка, у одного из пациентов

214

со спинальной мышечной атрофией доказывает функциональ-

ную значимость его взаимодействия с нуклеиновыми кисло-

тами. С другой стороны, в ряде экспериментов выявлена анти-

апоптозная роль белка выживания двигательных нейронов.

В геноме человека в области 10q23 идентифицирован

еще один ген, кодирующий ядерный белок, родственный про-

дукту гена SMN (Talbot et al., 1998). Этот ген экспрессируется

во многих тканях и особенно активно в скелетных мышцах.

Показано, что новый белок, кодируемый SMN-родственным

геном и обозначаемый как SPF30, также входит в комплекс

сплайсеосом. Его гиперэкспрессия в культуре HeLa клеток

индуцирует апоптоз. Исследование SPF30 имеет важное зна-

чение для понимания функционирования SMN-родственных

белков и их участия в патогенезе спинальной мышечной ат-

рофии.

7. Молекулярная диагностика спинальной мышечной

атрофии

В настоящее время возможна прямая молекулярная

диагностика спинальной мышечной атрофии более чем у 98%

пациентов. Она основана на амплификации и анализе экзо-

на 7 гена SMN1, отсутствующего у подавляющего большинст-

ва больных. Экзоны 7 генов SMN1 и SMN2 дифференцируют

методом SSCP-анализа. Однако следует учитывать, что при-

мерно в 4% образцов ДНК, полученных от бессимптомных

членов семей со спинальной мышечной атрофией, присут-

ствует полиморфная мутация в экзоне 7, которая может

быть интерпретирована в условиях SSCP-анализа как де-

леция экзона 7 (Wang et al., 1996). Дискриминация этих

двух ситуаций приобретает особую важность при проведе-

нии пренатальной диагностики. В данном случае анализ

должен быть дополнен исследованием делеций экзона 8. В

последнее время разработан еще более удобный метод

диагностики спинальной мышечной атрофии, основанный

на рестрикционном анализе определенных ПЦР-продуктов

экзонов 7 и 8 (van der Steege et al., 1995b).

215

8. Вклад в патогенез спинальных мышечных атрофии другиу

генов, расположенных в SMA-области

В непосредственной близости от теломерного конца

гена SMN1 идентифицировано еще три гена, расположенных

в 500-кб инвертированной дупликации, перекрывающей SMA-

область. Один из них NAIP — ген ингибитора нейронального

апоптоза также представлен в SMA-области несколькими

высокогомологичными копиями, хотя, по-видимому, только

одна из них содержит полный набор экзонов (Roy et al., 1995).

Этот ген имеет высокий процент гомологии с бакуловирус-

ными генами, вовлеченными в ингибирование апоптоза в

инфицированных клетках насекомых. Оказалось, что коди-

рующая последовательность XS2G3, идентифицированная в

процессе поиска гена SMA (Thompson et al., 1995), компле-

ментарна экзону 7 и фланкирующим интронным областям

NAIP-гена (Mahadevan et al., 1995). От 40% до 70% больных с

тяжелой клинической формой спинальной мышечной атро-

фии первого типа и от 14% до 22% пациентов со II и III типа-

ми имеют в гомозиготном состоянии делецию специфичес-

ких экзонов NAIP-гена (Roy et al., 1995; Velasco et al., 1996).

Однако и у бессимптомных облигатных гетерозигот подоб-

ная делеция обнаруживается в 2% случаев. Таким образом,

утрата NAIP сама по себе недостаточна для развития болез-

ни. Имеются ли точковые мутации в NAIP-гене у пациентов

со спинальной мышечной атрофией, в настоящее время не-

известно. Подавляющее большинство пациентов (96%) с го-

мозиготными делециями экзона 5 NAIP-гена также несут де-

леции гена SMN1. Однако описаны редкие пациенты, у кото-

рых при наличии гомозиготной делеции в гене NAIP сохране-

ны экзоны 7 и 8 гена SMN1.

Ближе всех к SMN1 оказался расположен другой ген

H4F5, делетированный у 90% больных со спинальной ами-

отрофией I типа (Scharf et al., 1998). H4F5 активно экспрес-

сируется с образованием двух альтернативных транскрип-

тов во многих тканях, включая спинной мозг и централь-

ную нервную систему. Продукт этого гена, по-видимому,

216

участвует в связывании нуклеиновых кислот и, подобно

продукту гена SMN, ко-локализован с малыми ядерными

ринуклеопротеиновыми комплексами (мяРНП), участвую-

щими в процессе сплайсинга. H4F5-reH также рассматри-

вается как возможный модификатор тяжести течения спи-

нальной мышечной атрофии.

Третий ген, расположенный по соседству от SMN1 и

также представленный несколькими копиями, — BTF2p44 —

кодирует р44 субъединицу базального транскрипционного

фактора II (van der Steege et al., 1995a; Carter et al., 1997).

Этот белок, являющийся субьединицей комплекса РНК поли-

меразы II, участвует в транскрипции и репарации, сопряжен-

ной с транскрипцией. Оказалось, что одна из копий этого гена

делетирована по крайней мере у 15% пациентов со спиналь-

ной мышечной атрофией. Однако никакой корреляции меж-

ду тяжестью течения заболевания и делецией гена BTF2p44

не обнаружено.

Для изучения связи между характером мутационных

повреждений и типом заболевания был проведен молекуляр-

ный анализ делеций в генах SMN1 и NAIP у пациентов из

187 семей, при этом в 77 семьях наблюдали больных с ти-

пом I спинальной мышечной атрофии, в 69 — с типом II и в

41 —с типом III (Rodriguesetal., 1996). Делеций в каждом из

изученных генов могут встречаться как при тяжелых, так и

при очень мягких типах спинальной мышечной атрофии.

93.5% пациентов оказались гомозиготны по делециям хотя

бы части теломерной копии SMN1, причем в подавляющем

большинстве случаев были делетированы оба экзона: 7 и 8.

Изолированные делеций экзона 8 не были найдены ни у од-

ного больного. У облигатных гетерозиготных носителей по-

добных делеций в теломерной копии SMN1 не найдено. У всех

оставшихся пациентов, кроме двух, присутствовали обе ко-

пии гена SMN и по крайней мере одна копия гена NAIP. У

одного больного была обнаружена гомозиготная делеция по

экзону 5 NAIP-гена и у другого — гомозиготная делеция по

экзонам 7 и 8 центромерной копии SMN2. Следует подчерк-

217

нуть, что гомозиготные делеции в NAIP-гене обнаруживают-

ся у 1.9% фенотипически нормальных носителей, причем, как

правило, эти гетерозиготы оказываются родителями пациен-

тов с I типом заболевания. Кроме того, гомозиготные деле-

ции центромерной копии SMN2 были найдены у 19 из 358

обследованных контрольных индивидуумов и не обнаруже-

ны ни у одного из 373 облигатных гетерозигот. Гомозиготные

делеции в SMA-области большей протяженности связаны с

более тяжелыми формами заболевания. Так, случаи одно-

временных делеций в генах SMN и NAIP значительно чаще

встречаются среди пациентов с первым типом заболевания,

в то время как пациенты со II и III типами не различаются по

характеру делеций.

Показано, что около 50% больных со спинальной мы-

шечной атрофией I типа на каждой из гомологичных хромо-

сом 5 несут только одну копию мультилокусных микросател-

литных маркеров С212 и AG1-CA (Wirth et al., 1995). 10% та-

ких пациентов несут гемизиготную делецию в области лока-

лизации этих маркеров. AG1-CA расположен в 5'-конце гена

SMN1, а С212 — проксимальнее SMN1 в последнем интроне

гена H4F5. Для AG1 -СА, так же как и для САТТ1, обнаружена

сильная аллельная ассоциация с самыми тяжелыми форма-

ми заболевания. У пациентов со II и III типами количество

копий этих маркеров достоверно больше, чем с первым ти-

пом заболевания. Если учесть, что ген SMN1 у подавляюще-

го большинства пациентов со спинальной мышечной атрофи-

ей делетирован, увеличение числа копий данных маркеров

может быть связано с эффектом дозы центромерной копии

SMN2. Действительно, у родителей пациентов с I типом за-

болевания, как правило, сохранены 2 копии SMN2, в то вре-

мя как у 66.5% и 75% родителей больных с типами II и III

обнаруживается от трех до пяти копий этого гена соответст-

венно (Velasco et al., 1996).

Согласно современным представлениям, для развития

спинальной мышечной атрофии необходима утрата или му-

тационное повреждение хотя бы в одном из трех генов SMN1,

218

NAIP и H4F5. Болезнь возникает при гомозиготном состоя-

нии мутаций (обычно делеций) в гене SMN1, при этом разли-

чия между формами спинальной мышечной атрофии опре-

деляются тремя основными факторами: наличием или отсут-

ствием гомозиготных делеций в генах NAIP и H4F5 (или иных

мутаций, существование которых в настоящее время не мо-

жет быть исключено) и числом центромерных копий гена

SMN2 (две — в случае типа I и от трех до пяти — в случае

болезни II и III типа). Сходная ситуация генетического кон-

троля определенной функции зарегистрирована для генов,

вовлеченных в систему апоптоза у Drosophila melanogaster.

Наблюдается функциональный избыток генов апоптоза, так

что потеря одного из них может компенсироваться другим

геном. В результате для получения мутантной линии мух, де-

фектных по системе апоптоза, необходимо возникновение

мутаций одновременно в двух генах reaper и hid, лежащих в

одном и том же районе геномной ДНК (Grether et al., 1995).

б) Спинально-бульбарная мышечная атрофия,

болезнь Кеннеди (MIM: 313200)

Сцепленная с полом рецессивная спинально-бульбар-

ная мышечная атрофия характеризуется поздним дебютом

(после 40 лет), медленным прогрессированием, участием в

процессе бульбарной группы черепных нервов, нисходящим

распространением параличей. Клиническая картина болез-

ни имеет четкие границы и порядок вовлечения в процесс

различных мышечных групп, что облегчает ее клиническую

диагностику. Периферические парезы начинаются с прокси-

мальных отделов верхних конечностей и мускулатуры над-

плечий. Слабость сопровождается атрофиями пораженных

мышечных групп и выраженными фасцикуляциями. Ранее

других снижаются сухожильные рефлексы двухи трехглавых

мышц. Типичен тремор пальцев рук. В дальнейшем слабость

появляется в проксимальных отделах нижних конечностей,

снижаются коленные и ахилловы рефлексы. Типично вовле-

чение в процесс двигательных ядер черепных нервов. Стра-

219

дает мимическая мускулатура и мышцы, иннервируемые

бульбарной группой черепных нервов, обусловливающие ди-

зартрию и дисфагию. Описаны эндокринные нарушения в

виде гинекомастии, обусловленной дефектом функциониро-

вания гипоталамуса. Впервые спинально-бульбарная мышеч-

ная атрофия была описана у 9 мужчин в двух неродственных

семьях и с тех пор получила название болезни Кеннеди

(Kennedy et al., 1968).

При семейном генетическом анализе найдено сцепле-

ние гена SBMA (spinal and bulbar muscular atrophy) с марке-

ром DXYS1, локализованным в области Xq21.3-q22

(Fischbecket al.,1986). С использованием большого числа ми-

кросателлитных полиморфных маркеров удалось точнее ло-

кализовать ген SBMA в области Xq12 (Ferlini et al., 1991).

Природа молекулярного дефекта, лежащего в основе разви-

тия болезни Кеннеди, была расшифрована при обнаружении

у пациентов необычно длинного CAG-повтора в гене андро-

генового рецептора-AR, локализованного в той же цитогене-

тической области (La Spada, Fischbeck, 1991; La Spada et al.,

1991). CAG-повтор, кодирующий цепочку из глютаминовых

остатков, расположен в первом экзоне гена AR. В норме

наблюдается полиморфизм по длине CAG-повторов со сред-

ним числом, равным 22+-3. У пациентов с болезнью Кенне-

ди было обнаружено 11 аллелей с числом повторов, варь-

ирующим в диапозоне от 40 до 52. Во всех исследованных

семьях аномалии по длине данного повтора ко-сегрегиро-

вали с заболеванием.

Ген AR клонирован, и определена полная нуклеотидная

последовательность его кДНК (Chang et al.,1988; Lubahn et

al.,1988). Ген AR кодирует адренорецептор с молекулярной

массой 110-112 кД, имеющий три главных функциональных

домена. N-терминальный домен, кодируемый первым экзо-

ном, осуществляет модуляторные функции. ДНК-связываю-

щий домен кодируется экзонами 2 и 3. Андроген-связываю-

щий домен кодируется пятью последующими экзонами. Раз-

личные мутации в гене адренорецептора, прежде всего мис-

220