Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

сенс и нонсенс типа, а также делеций приводят к синдрому

тестикулярной феминизации, характеризующемуся генетиче-

ски детерминированными нарушениями половой дифферен-

цировки, при которых у индивидуумов с кариотипом 46, XY

наружные половые органы сформированы по женскому типу.

CAG-повтор, кодирующий полиглютаминовый трек в пер-

вом домене адренорецептора, не оказывает никакого влияния

на функции связывания ДНК и/или андрогена. Никакой корре-

ляции между величиной CAG-повтора и связыванием андроге-

на in vitro не наблюдается. В то же время выявлена четкая за-

висимость между длиной этого повтора и тяжестью течения

болезни Кеннеди. При позднем дебюте и мягких клинических

проявлениях симптомов заболевания число повторов у па-

циентов, как правило, не превышает 40. Около 30% экспан-

сированных CAG-аллелей оказываются нестабильны при на-

следственной передаче. Наблюдается как сокращение числа

триплетов, так и их увеличение, при этом нестабильность бо-

лее выражена в мужском мейозе (La Spada et al., 1992).

В первом интроне гена AR идентифицирован второй

полиморфный тринуклеотидный повтор — (GGC)n. Проведе-

но сопоставление уровня полиморфизма по (CAG)n и (GGC)n

повторам у 113 пациентов со спинально-бульбарной мышеч-

ной атрофией и у 173 контрольных индивидуумов в Японии

(Tanaka et al., 1996). Среднее число С AG-повторов в нормаль-

ных Х-хромосомах составило 21+-3, в мутантных — 47+-3. В

контрольных Х-хромосомах найдено 7 различных аллелей по

GGC-повтору с рангом изменчивости от 11 до 17 триплетов.

Наиболее часто (79%) встречался аллель (GGC)16, тогда как

частота аллеля (GGC)17 составила лишь1%. В мутантных

хромосомах было найдено только 2 аллеля с 16 и 17 GGC-

повторами с частотами 61%и39%, соответственно. На рис. 22

и 23 представлены результаты этих исследований. Обнару-

женное неравновесие по сцеплению между двумя типами

тринуклеотидных повторов в гене AR указывает на значитель-

ный вклад эффекта основателя в формирование пула мутант-

ных по гену AR хромосом в японской популяции.

221

Рис. 22. Распределение величины CAG-повтора

в контрольной популяции (светлые столбики) и у пациентов

с болезнью Кеннеди (темные столбики).

Рис. 23. Распределение величины CGC-повтора в

контрольной популяции (светлые столбики) и у пациентов с

болезнью Кеннеди (темные столбики).

Проведена прямая оценка частоты возникновения му-

таций в области локализации CAG-повтора в нормальных ал-

лелях гена AR путем типирования с помощью ПЦР состояния

повтора в отдельных зародышевых клетках (Zhang et al., 1994).

Всего было протипировано около 4300 сперматозоидов, по-

лученных от 110 доноров. Предварительно частота мутаций

этой области была оценена, как 6.7x10

. Скорость мутаций

для аллелей (CAG) 22-24 сопоставима с той, которая наблю-

дается при семейном анализе. Частота экспансии аллелей с

28—31 повторами оказалась в 4.4 раза ниже частоты их со-

кращения, что согласуется с результатами аналогичных экс-

периментов с геном миотонической дистрофии — DM, но на-

ходится в значительном противоречии с наблюдаемой час-

тотой экспансии при отцовской передаче аллелей с 29—44

повторами (6 из 11 — 54%). То есть реальное увеличение

числа повторов при прохождении через мужской гаметоге-

нез оказалось в 175 раз больше скорости экспансии, непо-

средственно наблюдаемой в мужских зародышевых клет-

ках (54% по сравнению с 0.31%). Для объяснения этого па-

радокса авторы привлекают идею различных мутационных

механизмов, ведущих к увеличению числа экспансирован-

ных повторов и к их сокращению.

В опытах in vitro показано, что андрогеновый рецептор,

так же как и другие белки, содержащие полиглютаминовые

треки, способен специфически взаимодействовать с ключе-

вым ферментом клеточного гликолиза — глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназой (Koshy et al., 1996). Агрегация и про-

теолитический процессинг мутантных форм андрогенового

рецептора зависят от длины глютаминового повтора, причем

степень нарушения этих процессов коррелирует с уровнем

цитотоксичности (Merryet al.,1998). Мутантные формы белка

с удлиненными полиглютаминовыми треками обладают по-

вышенной устойчивостью к протеолизу (Abdullahetal.,1998).

Даже после обработки таких белков 2М мочевиной глюта-

мин-содержащие фрагменты сохраняют устойчивость к про-

теолизу. Более того, в культуре COS клеток, трансфециро-

223

ванных фрагментами кДНК гена AR с экспансированными

CAG-повторами, образуются аберрантные ассоциированные

с ядрами 75-кД белковые производные с удлиненными поли-

глютаминовыми треками. Такие клетки почти вдвое менее

жизнеспособны по сравнению с COS-клетками, трансфеци-

рованными нормальной кДНК гена AR, причем их гибель но-

сит характер апоптоза. Подобные нейроно-токсические про-

изводные могут образовываться de novo либо вследствие

токсического накопления белков, теряющих способность к

правильной диспозиции в клетке при наличии в них удлинен-

ных глютаминовых повторов.

Введение кДНКовых конструкций гена AR с экспан-

сированным CAG-повтором (CAG)52 в клетки нейроблас-

томы мыши (NB2a/d1) также сопровождается образовани-

ем наряду с полноразмерным адренорецептором с м. в.

114-116 кД его С-терминально-укороченной формы с м. в.

74 кД (Butler et al.,1998). По-видимому, в этом укорочен-

ном фрагменте белка сохранен ДНК-связывающий домен,

но отсутствует гормон-связывающий. В этом случае не ис-

ключено, что токсичность 74 кД изоформы адренорецеп-

тора в двигательных нейронах связана с возможностью

инициации транскрипции в этих клетках специфических

генов в отсутствие гормонального стимула.

С использованием иммунофлюоресцентной микро-

скопии показано, что после гормональной активации ад-

ренорецептор дикого типа транслоцируется в ядра, тогда

как мутантный белок главным образом остается в цито-

плазме в форме плотных агрегатов, и лишь небольшая его

часть обнаруживается в ядрах. Этим может быть объясне-

но наблюдаемое уменьшение транскрипционной активно-

сти в NB2a/d1 клетках, трансфецированных мутантными

конструкциями, по сравнению с клетками, трансфециро-

ванными кДНК гена AR дикого типа.

Сконструирована серия трансгенных мышей, несущих ген

AR человека с экспансированными CAG-повторами. При ис-

пользовании для трансгеноза кДНКовых конструкций с 45 и 66

224

CAG-триплетами никаких фенотипических аномалий у мышей

не наблюдается и введенные последовательности оказывают-

ся стабильными (Bingham et al.,1995). В отличие от этого, при

использовании для трансгеноза геномных конструкций экспан-

сированного AR-гена в составе искусственных дрожжевых хро-

мосом (YAC) введенные последовательности даже с 45 CAG-

повторами обладают значительной мейотической нестабильно-

стью со средней скоростью экспансии около 10% за поколение,

причем эта нестабильность более выражена при материнской

передаче (в отличие оттого, что наблюдается у человека) и уве-

личивается с возрастом самки (LaSpadaet al., 1998). Сущест-

венное понижение порога для длины CAG-повтора, при кото-

рой возникает подобная нестабильность, указывает на важ-

ную роль в этом процессе геномных последовательностей, флан-

кирующих ген AR. Идентификация цис-действующих элементов,

допускающих подобную нестабильность, и транс-активирующих

факторов, способных ее модулировать, могут пролить свет на

понимание молекулярных основ контроля общей нестабильно-

сти тринуклеотидных повторов у человека.

3.3. Наследственные полинейропатии

Наследственные полинейропатии включают в себя раз-

личные формы болезни Шарко-Мари-Тус и синдрома Деже-

рина-Сотта. Это большая генетически гетерогенная группа

заболеваний со сходной клинической картиной. Патологиче-

ский процесс затрагивает главным образом нижний двига-

тельный неврон. Страдает либо тело мотонейрона, либо, что

бывает чаще, его аксональная часть. Сходство клинических

проявлений заключается в симметричности парезов, дисталь-

ной их локализации, преимущественным вовлечением в про-

цесс перонеальной группы мышц. Моторные нарушения час-

то сочетаются с сенсорными расстройствами. Парезы сопро-

вождаются мышечными атрофиями, которые в первую оче-

редь затрагивают стопы, голени, затем кисти. Соответствен-

но первыми снижаются, а затем утрачиваются ахилловы и

коленные рефлексы. Дистальные парезы следует рассмат-

15 Заказ № 170

225

ривать как дебют заболевания, в дальнейшем в процесс мо-

гут вовлекаться мышцы проксимальных отделов и даже туло-

вища. Течение наследственных полинейропатий медленно

прогрессирующее. Степень прогрессирования и тяжесть за-

болевания в значительной мере зависит от типа нейропатии.

Перонеальная мышечная атрофия или болезнь Шарко-

Мари-Тус— наиболее распространенная наследственная пе-

риферическая нейропатия у человека. Известны аутосомно-

доминантные, рецессивные и сцепленные с полом формы

заболевания. Общая частота всех типов невральных амиот-

рофии Шарко-Мари-Тус составляет 1 на 2500. В границах

синдрома выделяют две наиболее значимые формы.

Чаще встречается I тип моторной и сенсорной нейро-

патии с аутосомно-доминантным характером наследования.

Соответствующие гены получили название HMSN I (hereditary

motor and sensory neuropathy I) или CMT1 (Charcot-Marie-Iooth

1). Дебют заболевания относится к первому десятилетию

жизни. Начальными симптомами является слабость дисталь-

ных отделов нижних конечностей или их деформация в виде

эквиноварусных стоп из-за укорочения икроножных мышц.

В дальнейшем появляется слабость дистальных отделов верх-

них конечностей. У большинства больных выявляется эссен-

циальный тремор пальцев рук. Одновременно снижаются

глубокие рефлексы. Снижение поверхностной чувствитель-

ности возникает не постоянно и чаще в более поздней ста-

дии болезни. Атрофиям подвергаются главным образом мыш-

цы стоп, голеней, кистей. Заболевание медленно прогресси-

рует. Для заболевания типично снижение скорости проведе-

ния по нерву. С генетической точки зрения эта клинически

однородная группа состоит по крайней мере из 3 заболева-

ний, каждое из которых связано с дефектами разных генов —

СМТ1А, СМТ1ВиСМТ1С.

II тип моторной и сенсорной нейропатии (СМТ2) с ауто-

сомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типами на-

следования характеризуется более поздним дебютом по срав-

нению с I типом полинейропатий. Обычно процесс начинает-

226

ся с дистальных отделов конечностей в виде слабости и утом-

ляемости главным образом передней группы мышц голеней.

Снижение или угасание рефлексов выражены в меньшей сте-

пени, чем при I типе полинейропатии, как и уровень чувстви-

тельных нарушений. Скорость проведения по нерву нормаль-

ная. При морфологическом исследовании обнаруживается

дегенерация аксонов.

Для аутосомно-рецессивной формы моторно-сенсорной

нейропатии II типа типично раннее начало и более тяжелое и

прогрессирующее течение. Начальные признаки болезни

проявляются в первом десятилетии жизни, чаще в возрасте

3—5 лет. Парезы, имеющие все признаки периферических,

захватывают дистальные отделы сперва нижних, а затем и

верхних конечностей. Атрофии мелких мышц голеней и стоп,

а также предплечий и кистей сопровождаются контрактура-

ми, приводящими к деформациям. Стопы принимают поло-

жение эквиноварусных, кисти согнуты в средних и концевых

фалангах. Отмеченные дефекты моторики рано затрудняют

самообслуживание ребенка. Двигательные нарушения соче-

таются с сенсорными. Страдает главным образом поверхно-

стная чувствительность по полиневритическому типу.

Ill тип аутосомно-доминантной наследственной сенсор-

ной и моторной нейропатии идентифицируют с болезнью Деже-

рина-Сотта. Для последней характерно появление с 6—7 лет

слабости дистальных отделов конечностей, постепенно прогрес-

сирующей и переходящей затем на проксимальные отделы. В

таком же направлении угасают глубокие рефлексы. Появляют-

ся атрофии мышц, вторичные костные деформации. Типично

уплотнение нервных стволов (утолщается локтевой, седалищ-

ный нервы). Могут отмечаться боли в конечностях. Однако при

молекулярно-генетическом анализе заболевания было показа-

но, что синдром Дежерина-Сотта не является самостоятельной

нозологической формой, а представляет собой аллельные ва-

рианты болезни Шарко-Мари-Тус двух разных типов 1Аи 1В.

Выделяют также моторные и сенсорные нейропатии с

Х-сцепленным частично доминантным и Х-сцепленным ре-

227

цессивным типом наследования. В первом случае стеноти-

пические проявления более выражены у лиц мужского пола

и отсутствует передача мутантного гена от отца к сыну. Кли-

ническая картина соответствует наследственной моторно-

сенсорной нейропатии I типа (HMSN1). У гетерозиготных де-

вочек клинические проявления заболевания могут быть не-

значительны. Данные биопсии нервных волокон показывают

первичную атрофию с вторичной демиелинизацией. Клини-

ческая картина Х-сцепленной рецессивной полинейропатий

нередко сочетается с умственной отсталостью и неблагопри-

ятным витальным прогнозом.

На этом генетическая гетерогенность наследственных

полинейропатий не ограничивается. В настоящее время иден-

тифицировано 3 и картировано не менее 13 генов, ответствен-

ных за различные варианты этих заболеваний (табл. 12).

Таблица 12

Локализация генов, ответственных за различные

варианты наследственных полинейропатий

Ген

Локализация

MIM

СМТ1А, РМР22

17р11.2

118220, 145900

СМТ1В, MPZ, МРР

1q23-q25

118200, 145900

СМТХ1,СХ32

Xq13-q21

302800

СМТХ2

Хр22.2

302801

СМТХЗ

Xq26

302802

СМТ2А

1р36-р35

118210

СМТ2В

3q13-q22

600882

СМТ2С

158580

OMT2D

7р14

601472

СМТ4А

8q13-q21.1

214400

СМТ4В

11q23

601382

CMTND

5q23-33

601596

HSN1

9q22.1-q22.3

а) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IB (MIM: 118200;

159440; 145900)

Ключевым моментом для картирования, а в дальней-

шем и идентификации гена, дефектного при невральной ами-

отрофий Шарко-Мари-Тус 1В типа, явилось обнаружение в

ряде семей косегрегации заболевания с определенными ал-

лелями генов, локализованных в центромерном районе длин-

ного плеча хромосомы 1 (Bird et al., 1980; Guiloff et al., 1982).

В этих же семьях было обнаружено сцепление заболевания

с генами антитромбина III —АТЗ, альфа-субъединицы слюн-

ной амилазы — AMY1, аполипопротеина А2 — АРОА2 и Fc-

фрагмента иммуноглобулинового кластера генов IgG —

FCGR2A, расположенных в районах 1q23-q25,1р21 ив 1q21-

q23 (два последних гена соответственно) (Griffits et al., 1987;

1988; Lebo et al., 1989). Описание редких пациентов с болез-

нью Шарко-Мари-Тус 1В типа, несущих небольшие хромосом-

ные перестройки в области 1q23-q25 — микроделеции и

транслокации, — способствовало сужению области поиска

дефектного гена с 18сМ до 6 сМ, что соответствовало сокра-

щению физического интервала с 15% хромосомы 1 до 3%

(Lebo et al., 1991). Был использован целый комплекс цитоге-

нетических и молекулярных методов для более точного кар-

тирования гена СМТ1В (Qharcot-Marie-Iooth 1 В), включая

сортинг хромосом, флюоресцентную гибридизацию in situ,

спот-блот анализ, изоляцию с помощью пульсирующего гель-

электрофореза и клонирование крупных фрагментов геном-

ной ДНК из области поиска гена.

Наиболее вероятным кандидатом на роль гена, дефект-

ного при типе IB болезни Шарко-Мари-Тус, оказался находя-

щийся в тесном сцеплении с FCGR2A и АРОА2 ген перифе-

рического миелинового белка МРР (myelin protein peripheral),

известный также как ген миелинового гликопротеина Р(0) —

MPZ (myelin protein zero) (Oakey et al., 1992). Ген MPZ высо-

коконсервативен и специфическим образом экспрессирует-

ся в миелин-формирующих клетках Шванна. Он состоит из 6

экзонов, распределенных на площади около 7 кб геномной

229

ДНК (Lemke, Axel 1985; Hayasaka et al., 1993a). Первые 28

аминокислот, кодируемых MPZ, не представлены в зрелом

белке и образуют сигнальный пептид, направляющий продви-

жение Р(0) к эндоплазаматическому ретикулуму. Р(0) — глав-

ный структурный белок периферического миелина с молеку-

лярным весом 28 кД, составляет более 50% всего белка, при-

сутствующего в оболочках периферических нервов. Этот ин-

тегральный мембранный белок связывает соседние ламел-

лы посредством гомофильных взаимодействий, что обеспе-

чивает компактизацию и стабилизацию всего миелинового

комплекса. Тремя другими главными компонентами этого

комплекса являются основной и протеолипидный белки мие-

лина, а также гликопротеин, ассоциированный с миелином.

В центральной нервной системе Р(0) не обнаружен.

Картирование гена MPZ в области 1q22-q23 явилось

основанием для его анализа в качестве кандидатного гена

при болезни Шарко-Мари-Тус 1В. При молекулярном обсле-

довании пациентов из разных семей с невральной амиотро-

фией Шарко-Мари-Тус 1В типа, были обнаружены многочис-

ленные мутации в гене MPZ (Hayasaka et al., 1993b; Kulkens

et al., 1993; Su et al., 1993). Большая часть этих мутаций отно-

сится к миссенс-типу, описаны также небольшие делеции и

мутации, нарушающие процесс сплайсинга. Дефекты лока-

лизованы главным образом в высококонсервативном райо-

не гена, полностью идентичном у крыс, коров и человека.

Следствием этих мутаций является замена или потеря одной

из аминокислот во внеклеточном домене Р(О), играющем

значительную роль в миелиновой мембранной адгезии. Одна

из миссенс-мутации — К96Е, по-видимому, является мажор-

ной. У гетерозигот по К96Е наблюдается типичная клиника

полинейропатий. Две мутации в MPZ-гене были обнаружены

у пациентов с синдромом Дежерина-Сотта. Одна из них со-

провождалась аминокислотной заменой во внеклеточном, а

другая — в трансмембранном домене Р(О). Эти находки под-

твердили генетическую идентичность некоторых форм синд-

рома Дежерин-Сотта и болезни Шарко-Мари-Тус IB типа.

230