Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

тический анализ семей, в которых наблюдалась сегрега-

ция по сцепленной с полом форме дилатационной кардио-

миопатий, показал, что ген, ответственный за развитие

заболевания, локализован в той же области Хр21, где на-

ходится ген DMD (Towbin et al., 1993). Спустя некоторое

время у ряда больных с семейной Х-сцепленной формой

дилатационной кардиомиопатий, так же как и в нескольких

спорадических случаях у мужчин, были идентифицирова-

ны мутации в гене DMD. Это были либо делеции,затраги-

вающие регуляторную область и первый экзон DMD, либо

сплайсинговые мутации, локализованные в начале перво-

го интрона гена дистрофина (Yoshida et al., 1993; Muntoni

et al., 1995b; Milasin et al., 1996). У трех пациентов с Х-сцеп-

ленной дилатационной кардиомиопатией из двух неродст-

венных японских семей была обнаружена уникальная ин-

серция транспозоно-подобного элемента L1 в первом эк-

зоне гена DMD (Yoshida et al., 1998). В дальнейшем были

определены начальные этапы молекулярного патогенеза

подобных форм дилатационной кардиомиопатий. Оказа-

лось, что идентифицированные мутации приводят к полно-

му отсутствию мышечной изоформы дистрофина у боль-

ных. Кроме того, в миокарде пациентов отсутствует экс-

прессия двух других полноразмерных изоформ мРНК дис-

трофина, транскрибирующихся с промоторов мозгового

типа. В отличие от этого, в скелетных мышцах наблюдает-

ся достаточно высокий уровень двух полноразмерных изо-

форм дистрофина мозгового типа и потому сохраняется

дистрофин-гликопротеиновый комплекс. В сердечной мыш-

це не происходит компенсаторной экспрессии дистрофина

с альтернативных промоторов и дистрофин-гликопротеино-

вый комплекс полностью разрушен, несмотря на присутст-

вие там апо-дистрофина-1. В результате у пациентов раз-

вивается дилатационная кардиомиопатия без каких-либо

проявлений слабости скелетной мускулатуры.

Вскоре вслед за описанием молекулярного дефекта

Ри Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатий у боль-

ных с аутосомно-рецессивными формами заболевания

были обнаружены мутации в двух группах генов. Одни гены

оказались связаны с белками дистрофин-ассоциированного

комплекса, такими как а-дистрогликан, а- и у-саркоглика-

ны, другие гены — с белками цитоскелета мышечной клет-

ки: метавинкулином, актином, мышечным белком, участ-

вующим в позитивной регуляции миогенеза, так называе-

мым LIM-белком (Towbin, 1998). Примечательно, что иден-

тифицированные у пациентов мутации в актиновом гене

приводили к дефекту того домена актина, который участ-

вует во взаимодействии с дистрофином. Дефект 5-сарког-

ликана найден в линии хомячка BI014.6 с кардиомиопати-

ей. Все эти факты свидетельствуют о центральной роли дис-

трофин-ассоциированного комплекса в функционировании

кардиомиоцитов. Не исключено, что и приобретенные фор-

мы дилатационной кардиомиопатии, доля которых дости-

гает 30% от общего числа дилатационных кардиомиопатии,

связана с нарушением нормальной работы дистрофина.

Энтеровирусы, и в частности вирусы Коксаки, способны

индуцировать дилатационную кардиомиопатию. Оказалось,

что единственным белком человека, который расщепляет-

ся вирусной протеазой 2А, является дистрофин. Это было

предсказано на базе компьютерного анализа и подтверж-

дено в опытах in vitro (Badorf et al., 1999). Дистрофин так-

же расщепляется в культивируемых миоцитах, зараженных

вирусом Коксаки, и in vivo в сердечной мышце инфициро-

ванных мышей. При этом в инфицированных миоцитах от-

сутствует не только дистрофин, но и ассоциированные с

ним гликопротеины — а-саркогликан и р-дистрогликан.

Очевидно, что разрушение дистрофинового комплекса яв-

ляется одним из центральных звеньев в этиологии дилата-

ционных кардиомиопатии.

Экспрессия дистрофина и Dp260 обнаружена во внеш-

нем плексиформном слое сетчатки глаза, где фоторецеп-

торные клетки взаимодействуют с нейронами ганглиев, в

то время как другой апо-дистрофин — Dp71 — экспресси-

пуется на внутренней ограничивающей мембране сетчат-

ки и на ее сосудах (Fillers et al., 1993; Howard et al., 1998).

у некоторых пациентов с миодистрофией Дюшенна /Бек-

кера и у мышей генетических линий mdx с мутациями в

гене Dmd выявлен аномальный характер электроретино-

грамм, причем степень аномалий зависит от типа мутаци-

онных повреждений.У трансгенных мышей с направленно

разрушенным экзоном 52 гена Dmd и отсутствием экспрес-

сии Dp260 изменена локализация р-дистрогликана и обна-

руживаются аномалии на электроретинограмме (Катеуа

et al., 1998). Показано, что присутствие каждого из двух

аподистрофинов — Dp71 и Dp260 — необходимо для пра-

вильной локализации р-дистрогликана, а это взаимодейст-

вие, в свою очередь, имеет важное значение для исполне-

ния нормальной электрофизиологической функции сетчат-

ки. Не исключено, что некоторые мутации в гене DMD, со-

провождающиеся образованием дефектных форм дистро-

фина и аподистрофинов Dp71 и Dp260, могут быть ответ-

ственны за развитие Х-сцепленной формы ночной слепо-

ты, ген которой также картирован в области Хр21.

Кроме того, полноразмерный дистрофии и его укоро-

ченная форма Dpi 16 активно экспрессируются во внутрен-

них и внешних волосковых клетках улитки, где эти белки

преимущественно располагаются на латеральной поверх-

ности и в синаптических районах (Dodson et al., 1995). Ген,

ответственный за развитие одной из моногенных форм ней-

росенсорной тугоухости, также картирован в области Хр21

недалеко от DMD (Lalvani et al., 1994). Возможно, дистро-

фины участвуют в трансдукции акустического сигнала в

нейрональный и некоторые их дефекты или дефекты дис-

Рофин-гликопротеинового комплекса ответственны за

°пределенные типы нейросенсорной тугоухости. Не исклю-

чено также, что делеций в 44-м интроне, «горячей» точке

Вн

Утригенной рекомбинации, специфически разрушающие

Ромоторную область для наиболее интенсивно экспрес-

Си

Рующегося в раннем эмбриогенезе нейронального апо-

дистрофина Dpi40, могут приводить к одной из форм

Х-сцепленной изолированной умственной отсталости, ген

которой также локализован в области Хр21.

Предполагается, что среди семей с миодистрофией

дюшенновского типа в 6.8% случаев наследование осуществ-

ляется по аутосомно-рецессивному типу (Zatz et al., 1989).

По оценкам этих же авторов, доля мальчиков с аутосомно-

рецессивным типом наследования среди изолированных слу-

чаев миодистрофии Дюшенна составляет 2.5-4%. Аномалии

дистрофин-связанных белков в сарколемме — первый об-

щий шаг в патологическом процессе, ведущем к некрозу мы-

шечных клеток, не только при Х-сцепленной форме миодист-

рофии Дюшенна, но и при тяжелых аутосомно-рецессивных

дюшенно-подобных миодистрофиях, так же как и при миоди-

строфии Фукуяма.

Дюшенно-подобные формы миодистрофии представ-

ляют собой генетически гетерогенную группу аутосомно-

рецессивных заболеваний. Чаще всего такие семьи выяв-

ляют потому, что в них наблюдаются девочки с клиникой

миодистрофии Дюшенна. При этом у больных девочек не

находят каких-либо структурных аномалий, затрагивающих

Х-хромосому. В частности, необычно высокая частота тя-

желой прогрессирующей мышечной дистрофии с аутосом-

но-рецессивным характером наследования описана в Ту-

нисе (Ben Hamida et al., 1983). Из 93 диагностированных

пациентов 75 принадлежали 17 семьям, в которых присут-

ствовали больные обоих полов, и 18 принадлежали 11 се-

мьям, в которых больными были только девочки. Оказа-

лось, что в большинстве случаев аутосомно-рецессивные

дюшенно-подобные формы миодистрофии обусловлены

мутациями в генах, кодирующих белки дистрофин-ассоци-

ированного комплекса. В табл. 7 суммированы данные по

локализации таких генов и их связи с наследственными

заболеваниями.

Таблица 7

Белок

Ген

Лока-

лизация

Заболевание

а-саркогликан,

адхалин

SGA, aSG,

ADL,

DAG2

17q21

первичная адхалинопатия;

SCARMD*); конечностно-

поясная миодистрофия 2D;

дилатационная

кардиомиопатия

р- саркогликан

SGB, pSG

4q12

конечностно-поясная

миодистрофия 2Е; ARMD**

у-саркогликан

SGG, ySG

13q12

конечностно-поясная

миодистрофия 2С;

SCARMD; дилатационная

кардиомиопатия

S-саркогликан

SGD, 8SG

5q33

конечностно-поясная

миодистрофия 2F

а- дистрогликан

DAG1

3p21

дилатационная

кардиомиопатия

р- дистрогликан

DAG1

3p21

не найдено

Дистробревин

DRP3

18q12.1-1

2.2

не найдено

Ламинин 2,

мерозин

LAMA

6q22-q23

миодистрофия врожденная

мерозин дефицитная

*) SCARMD — тяжелая детская аутосомно-рецессивная

мышечная дистрофия.

**) ARMD аутосомно-рецессивная мышечная дистрофия

Дюшенновского типа.

В ряде семей с тяжелой формой детской аутосомно-

Рецессивной мышечной дистрофией (SCARMD), впервые

описанной в большой тунисской семье, при сохранении нор-

мальных уровней дистрофина наблюдали выраженный дефи-

цит a-саркогликана, называемого иначе адхалином или

50DAG (Matsumura etal., 1992; Piccolo et al., 1995). Во многих

^каз №

170

Связь генов, кодирующих белки

дистрофин-ассоциированного комплекса,

с наследственными заболеваниями

таких семьях этот дефект является вторичным. В относитель-

но небольшом проценте семей подобный дефект является

первичным, то есть обусловлен мутациями в гене а-сарко-

гликана -aSG или ADL, картированном в области 17р21

(McNally et al., 1994).

Такая форма очень варьирующей по степени тяжести

аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии получила на-

звание первичной адхалинопатии. Для пациентов с первич-

ной адхалинопатией характерным является преимуществен-

ное поражение проксимальных мышц, высокие уровни сыво-

роточной креатинкиназы, нормальное содержание дистрофи-

на, сохранный интеллект. Дебют и степень выраженности

клинических симптомов могут варьировать от ранних и тя-

желых форм до поздних с минимальными проявлениями

мышечной слабости. Примерно в 25% случаев у больных с

первичной адхалинопатией обнаруживается однотипная мис-

сенс-мутация R77C в гене ADL (Roberds et al. 1994). Пациен-

ты с этой мутацией были найдены в семьях различного этни-

ческого происхождения из Франции, Германии, Африки, США.

В дальнейшем эта форма миопатии была классифицирова-

на, как один из генетических вариантов конечностно-пояс-

ных миодистрофии, обусловленных наследственными дефек-

тами белков саркогликанового комплекса.

Аномально низкий уровень экспрессии саркогликанов

и дистрогликанов обнаружен у пациентов в Японии с врож-

денной аутосомно-рецессивной прогрессирующей мышеч-

ной дистрофией типа Фукуяма, сочетающейся с умствен-

ной отсталостью (см. ниже). Однако и в данном случае эти

дефекты являются вторичными, так как прослежено сцеп-

ление заболевания с маркерами длинного плеча хромосо-

мы 9 (9q31-q33).

Картированы и клонированы гены, кодирующие другие

белки саркогликанового субкомплекса. Мутации в этих генах

сопровождаются разрушением этого субкомплекса и реали-

зуются либо в виде различных форм миодистрофии плечево-

го и тазового пояса (Lim et al., 1995), либо в виде аутосомно-

рецессивной мышечной дистрофии (ARMD) дюшенновского

типа (Bonnemann et al., 1995).

DAG1 рассматривался в качестве кандидатного гена при

различных аутосомно-рецессивных формах миодистрофии.

Однако до сих пор в этом гене не обнаружено никаких мута-

ций, приводящих к наследственным миопатиям. По-видимо-

му, важная роль дистрогликанов в формировании оболочек

плода приводит к тому, что большая часть мутантов по DAG1

гену погибают в раннем эмбриогенезе. Мы уже упоминали о

том, что дефекты в а-дистрогликане обнаруживаются у неко-

торых пациентов с аутосомно-рецессивными формами дила-

тационной кардиомиопатий.

При иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц

более 500 пациентов с различными формами миопатии, у

которых был сохранен нормальный уровень дистрофина, в

10% случаев наблюдали отсутствие окрашивания на ос-сар-

когликан (Duggan et al., 1997). В 60% этих случаев были об-

наружены мутации в саркогликановых генах. Большая часть

из них (58%) оказалась локализована в гене адхалина, 27% и

13% в генах р- и у-саркогликанов, соответственно. Чаще все-

го такие мутации обнаруживаются у пациентов с тяжелыми

дюшенно-подобными формами миодистрофии, дебютирующи-

ми в детском возрасте. Среди проксимальных форм с поздним

началом подобные мутации были найдены в 6% случаев.

8. Семейство DMD-родственных генов

Обнаружен аутосомный гомолог гена DMD, локализо-

ванный в области 6q24, — ген UTRN или DRP1, кодирующий

дистрофин-родственный белок с молекулярной массой в 395

кД — утрофин (табл. 8). Показано, что утрофин в ряде случа-

ев может выступать в качестве функционального гомолога

Дистрофина. Геномная область, занимаемая UTRN, почти

втрое меньше гена DMD и составляет 900 кб. Размеры РНК-

"Фанскриптов этих двух генов близки — величина мРНК DMD

составляет 14 кб, a UTRN — 13 кб (Blake et al., 1996). Ген

UTRN активно экспрессируется в нейромышечных и в мы-

шечно-сухожильных соединениях, в мозге и в дополнение к

этому во многих других висцеральных тканях, в первую оче-

редь — в легких. Интересно подчеркнуть, что регуляция экс-

прессии генов DMD и UTRN осуществляется, по-видимому,

аналогичным образом. Так, обнаружен 5.5-кб транскрипт это-

го гена, преимущественно экспрессирующийся в сенсорных

ганглиях и в мозге, кодирующий 113 кД белок G-утрофин, го-

мологичный апо-дистрофину периферических нервов Dpi 16

(Blake et al., 1995). Описан также 80 кД утрофин, который,

по-видимому, является аутосомным гомологом Dp71

(Fabbrizio et al., 1995a).

Кроме того, в области Xq22 идентифицирован другой

небольшой ген, гомологичный З'-концу DMD — DRP2 (Roberts

et al., 1996). Этот ген занимает 45 кб геномной ДНК, его ко-

дирующая область разделена на 24 экзона. Продуктом гена

DRP2 является 110-кД белок, состоящий из 956 аминокислот.

Ген DRP2 преимущественно экспрессируется в головном и в

спинном мозге, и его продуктом является белок, родствен-

ный Dpi 16. Прослежена эволюционная связь между дистро-

фин-родственными генами млекопитающих и их предшест-

венниками у беспозвоночных (Roberts,Bobrow, 1998). По-ви-

димому, у большинства беспозвоночных имеется один ген,

кодирующий высококонсервативный дистрофин-родственный

белок, в дополнение к гену дистробревина (DRP3), имеюще-

му более отдаленное сходство с дистрофином. Дистрофин-

родственный ген и ген дистробревина произошли от гена-пред-

шественника путем более ранней дупликации. У позвоноч-

ных дистрофин-родственный ген подвергался серии дупли-

каций, приведших к образованию покрайней мере трех от-

дельных генов (DMD, UTRN и DRP2), способных выполнять

различные специализированные функции.

Недавно был изолирован ген морского ежа, который,

по-видимому, является предшественником генов дистрофи-

на и утрофина (Wang et al., 1998). Более чем 300-кД продукт

этого гена содержит покрайней мере 3 из четырех доменов

дистрофина. В этом гене также обнаружено несколько про-

моторов и его наименьший продукт, по-видимому, родстве-

нен Dpi 16. Предложена модель, согласно которой ген DRP2,

кодирующий Ор116-родственный белок, также эволюциони-

ровал от этого гена-предшественника путем дупликации его

небольшой части. В настоящее время никаких мутаций в ге-

нах UTRN, DRP2 и DRP3 не описано.

Таблица 8

Семейство DMD-родственных генов

Ген

Локализация

Размер

гена (кб)

Размер

мРНК

(Кб)

Основной

продукт

DMD

Хр21 2500

дистрофии

UTRN,

DRP1

6q24

900 13

утрофин

DRP2

Xq22

45 2.8

дистрофин-род-

ственный белок 2

DRP3

18q12.1-12.2

дистробревин

395-кД утрофин также относится к спектрин/а-актини-

новому семейству белков. Он имеет доменную организацию,

гомологичную дистрофину. При этом сходство его актин-свя-

зывающего, цистеин-богатого и С-концевого доменов с соот-

ветствующими доменами дистрофина достигает 85—88%. На-

ибольшие различия касаются стержневого домена, состоя-

щего в утрофине из 22 повторяющихся спектрин-подобных

сегментов, прерванных двумя петлеобразными районами.

G-утрофин содержит уникальный N-конец, небольшой фраг-

мент стержневого домена, включающий два спектрин-подоб-

ных повтора и последний петлеобразный район, а также цис-

теин-богатый и С-концевой домены утрофина. Показано, что

утрофин подобно дистрофину способен взаимодействовать

с компонентами дистрофин-гликопротеинового комплекса и

выполнять сходные функции, то есть дистрофин и утрофин,

по-видимому, являются функциональными гомологами. Дру-

гой дистрофин-родственный белок, кодируемый геном DRP2,

содержит короткий пролин-богатый район, два спектрин-по-

добных повтора стержневого домена и последовательность,

гомологичную последующим доменам дистрофина и утрофи-

на — цистеин-богатому и С-концевому. Найдено большое

сходство между Dpi 16 изоформой дистрофина и дистрофин-

родственным белком drp2 (Roberts et al., 1996). Хотя точные

функции G-утрофина и drp2 неизвестны, они могут подобно

апо-дистрофинам связываться с р-дистрогликаном.

В раннем эмбриогенезе утрофин присутствует в сарко-

лемме скелетных мышц, занимая сходное с дистрофином

положение (Clerk et al., 1993). По-видимому, высокая скорость

деления клеток в этот период не позволяет транскрибиро-

ваться такому крупному гену, как DMD. Однако в дальней-

шем дистрофин постепенно замещает утрофин в сарколем-

ме мышц и начиная с 26 недель беременности утрофин там

уже не обнаруживается, а экспрессируется только в нейро-

мышечных и мышечно-сухожильных соединениях, причем его

локализация в этих сайтах отлична от локализации дистро-

фина. В сердечной мышце утрофин находят в интерколяр-

ных дисках, тогда как дистрофин располагается преимущест-

венно по периферии кардиоцитов.

Можно считать доказанным участие утрофина в синап-

тогенезе. Показано, что взаимодействие сс-дистрогликана с

агрином и перлеканом, стимулирующее в дальнейшем клас-

терирование ацетилхолиновых рецепторов, осуществляется

в тех случаях, когда этот гликопротеин находится в комплек-

се с утрофином. На рис. 9 изображена структура утрофин-

ассоциированного комплекса белков в нейромышечных со-

единениях. Оказалось, что утрофин, в отличие от дистрофи-

на, способен взаимодействовать с рапсином, содержащим

43кД цинк-фингерный домен и принимающим непосредствен-

ное участие в перекрестной сшивке ацетилхолиновых рецеп-

торов с образованием микрокластеров (Phillips et al., 1993).