Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

разработаны очень эффективные методы диагностики

делеций в гене DMD, основанные на мультиплексной (мно-

жественной) полимеразной цепной реакции (Chamberlain et

al., 1988а; 1990; Beggs et al., 1989; 1990;. Abbs et al., 1991).

Одновременная амплификация 18 экзонов и промоторной

части гена позволяет выявить до 98% всех протяженных де-

леций гена (рис. 3). На этом рисунке у пациентов под номе-

рами 1—5 делетированы соответственно экзоны 51-60, 42-

44,47-52,43-60 и 13-19. Идентификация делеций в гене DMD

у больного является бесспорным подтверждением диагноза

миодистрофии Дюшенна/Беккера. Кроме того, в семьях с ге-

нотипированной делецией возможна прямая пренатальная

диагностика заболевания, которая обычно проводится в пер-

вом триместре беременности. В некоторых случаях делеций

в DMD находят у пациентов, клинически отнесенных к дру-

гим формам миопатии: аутосомно-рецессивной миодистро-

фии Фукуяма (Arahata et al., 1989; Francke et al., 1989), спи-

нальной амиотрофии (Clarke et al., 1989), тазовопоясной ми-

одистрофии Лейдена-Мебиуса (Arikawa et al., 1991). Во всех

этих случаях проводится корректировка диагноза в пользу

миодистрофии Дюшенна/Беккера.

ГЧ I с о м 14 О Э

Ри

с 3. Идентификация делеций в гене дистрофина методом

множественной полимеразной цепной реакции

Однако для обнаружения гетерозиготного носительства

делеции у матери больного ребенка метод мультиплексной ПЦр

не может быть использован. В ряде случаев носительство деле-

ции удается установить по появлению фрагментов ДНК необыч-

ного размера (junction fragments) при проведении блот гибриди-

зации рестрицированной геномной ДНК с внутригенными кДНК-

зондами. Однако такие фрагменты обнаруживаются не более

чем в 17% случаев делеций в гене DMD. Для выявления гетеро-

зиготного носительства делеций, дупликаций или инсерций в гене

DMD в общем случае был разработан метод обратной ПЦР (RT

PCR), основанный на изоляции специфической мРНК, обрат-

ной транскрипции и использования образовавшейся кДНК в

качестве матрицы для проведения мультиплексной амплифи-

кации всей кодирующей области гена (Roberts et al., 1990). По-

сле электрофоретического разделения продуктов амплифика-

ции фрагменты ДНК необычного размера образуются при лю-

бых структурных внутригенных перестройках, находящихся как

в гемизиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Таким обра-

зом, обратная ПЦР является наиболее эффективным методом

молекулярной диагностики делеций не только у пациентов с

миодистрофией Дюшенна/Беккера, но и у их родственников.

Ген миодистрофии Дюшенна может быть вовлечен так-

же в другие структурные перестройки (Ни et al., 1989). Так, у

5% пациентов наблюдаются дупликации одного или несколь-

ких экзонов. В относительно небольшом проценте случаев у

больных обнаружены микроделеции, захватывающие от 1 до

нескольких нуклеотидов, а также много нонсенс-мутаций, по-

видимому, из-за присутствия в гене DMD большого количе-

ства глютаминовых триплетов, мутации в которых часто при-

водят к образованию стоп-кодонов. Крайне редки миссенс-

мутации (Roberts et al., 1992а; 1992b).

Молекулярная диагностика мутаций неделеционного типа

чаще всего осуществляется косвенными методами. В началь-

ный период исследований для этих целей использовали внутри-

генные полиморфные сайты рестрикции (табл. 3 и 4). В даль-

нейшем в гене миодистрофии Дюшенна были обнаружены мно-

^численные микросателлитные гипервариабельные последо-

аательности, отличающиеся очень высоким уровнем информа-

тивности (Beggs, Kunkel, 1991; Feener et al., 1991). В табл. 5 пред-

ставлена характеристика полиморфных микросателлитных по-

второв, локализованных в гене DMD. Наиболее удобными для

пренатальной диагностики миодистрофии Дюшенна являются

аллельные варианты динуклеотидных СА повторов в интронах

49 и 50 — STR-49; STR-50 (Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990;

1991;Beggs etal., 1989; 1990; 1991; Clemens etal., 1991;Oudet

etal., 1991; Евграфов, Макаров, 1991).

Таблица 5

Микросателлитные полиморфные

маркеры гена дистрофина

Маркер

Повтор

Локализация

Уровень

гетерози-

готности

(PIC)

DYSI

DYSII

DYSIII

DYSIV

(ТА)11(СА)6

(СА)23

(ТА)11(СА)10

TACA(TG)5(TA)4TG

5'-нетранслируемая

область

0.586 - 0.786

DYSMSB

(TG)29

5'-нетранслируемая

область

0.25

DYSMSA

(TG)21

интрон 1

0.57

DMD-44

(CA)n

интрон 44

>0.8

DMD-45

(CA)n

интрон 45

>0.8

UMD-49

(CA)n

интрон 49

>0.8

(CA)n

интрон 50

>0.8

(CA)n

З'-нетранслируемая

область

0.35

(CA)8TA(CA)7

З'-нетранслируемая

область

0.46

(TTGA)n

З'-нетранслируемая

область

0.17

Для всех представленных в табл. 5 вариабельных по*

второв разработана простая и эффективная система их ге*

нотипирования с помощью ПЦР, то есть для всех этих сайтов

подобраны системы праймеров из уникальных смежных об*

ластей ДНК. Для того чтобы избежать ошибок косвенной ди-

агностики, связанных с возможностью внутригенной реком-

бинации, необходимо использовать несколько полиморфных

маркеров, фланкирующих ген DMD.

4. Структура и функции дистрофина

Основным продуктом гена DMD в мышцах является

структурный белок с молекулярной массой в 427 кД — дис-

трофин, имеющий стержневидную форму с длиной около 125

нм. Это полифункциональный белок, участвующий в форми-

ровании нейромышечного синапса и в поддержании целост-

ности мембраны мышечного волокна при его сокращении

(Sealock, Froehner, 1994).

Дистрофин относится к числу минорных белков, его со-

держание по отношению к общему белку мышц составляет

всего 0.002% и поднимается до 5% среди мембранных бел-

ков цитоскелета. В мышцах дистрофин локализован на цито-

плазматической поверхности сарколеммы. В нейромышеч-

ных соединениях он является компонентом постсинаптичес-

кой мембраны и участвует в синаптогенезе. В мышечно-су-

хожильных соединениях дистрофин ко-локализован с тали-

ном, винкулином и утрофином — продуктом аутосомного го-

молога гена DMD (см. ниже).Мышечно-сухожильные соеди-

нения являются основным сайтом силовой трансмиссии. Это

также место локализации контакта между актиновым цитос-

келетом и внеклеточным матриксом, при этом дистрофин и

утрофин концентрируются именно в точках данных специа-

лизированных контактов.

Дистрофин принадлежит к спектрин/ос-актининовому

суперсемейству белков цитоскелета (Koenig et al., 1988).

Он состоит из 4 отдельных доменов (рис. 4), обнаружива-

ющих много общих черт со спектрином и ос-актинином. Так,

isl-концввой домен дистрофина имеет сходство с большим

семейством актинсвязывающих белков, и в частности — с

isi-концевыми доменами а-актинина и р-спектрина. Во всех

типах клеток эти белки выполняют структурную роль при

физиологических, статических и динамических клеточных

процессах. Наиболее крупный домен, обеспечивающий

гибкость молекулы, имеет структуру трехгранного стерж-

ня. Он образован 24 слегка повторяющимися сегментами,

каждый из которых содержит около 110 аминокислотных

остатков, а-актинин содержит четыре подобных повтора,

а спектрины — 17 или более. Следующий за стержневым

участком цистеин-богатый домен, состоящий из 150 ами-

нокислот, сходен с СООН-фрагментом А-актинина и содер-

жит два неполных Са

-связывающих мотива. Для послед-

него 420-аминокислотного С-концевого домена не найде-

но гомологии с другими белками. Последовательности ци-

стеин-богатого и С-концевого доменов дистрофина высо-

коконсервативны, что указывает на их особую функцио-

нальную значимость. В С-концевом домене обнаружены

многочисленные потенциальные сайты фосфорилирования,

в том числе для МАР-киназы, p34cdc2-, СаМ- и казеино-

вой киназы. Это предполагает возможность участия дис-

трофина в трансдукции сигналов через сарколемму мы-

шечного волокна (Michalak et al., 1996).

Рис. 4. Модель молекулы дистрофина

После расшифровки аминокислотной последовательно-

ст

и белка была предложена схема его функционирования,

согласно которой дистрофин в цитоплазме клетки распоп^

гается под сарколеммой мышечного волокна в виде перепле*

тенного антипараллельного димера (рис. 5). N-конец дистро.

фина связан с цитоплазматическим актином, причем имеет

большее сродство (аффинитет) не с саркомерным, а с немы*

шечным F-актином. Таким образом, дистрофин не связан

напрямую с сократительным аппаратом мышечного волок-

на, а соединен с субмембранной сетью цитоплазмы, образо-

ванной немышечным актином (Ervasti, Campbell 1991;

Monaco, 1989). Точнее, дистрофин взаимодействует с G-ак-

тиновыми мономерами и способствует G->F актиновой транс-

формации, которая стимулируется Са

-зависимым присутст-

вием кальмодулина (Fabbrizio et al., 1995b). Дистрофин явля-

ется якорным белком для актина и таким образом он вовле-

чен в контроль деформации поверхности клеточной мембра-

ны и в развитие F-актиновой сети, обеспечивающей жест-

кость цитоскелета миотубул.

Рис. 5. Расположение дистрофина под сарколеммой

мышечного волокна

С-конец дистрофина соединен с трансмембранным

комплексом, состоящим из белков с молекулярными веса-

ми 156, 59, 50, 43, 35 и 25 кД (Ervasti, Campbell, 1991). Эти

* ки получили название дистрофин-ассоциированных

белков (DAP) или дистрофин-ассоциированных гликопро-

теинов (DAG). Дистрофин-гликопротеиновый комплекс уча-

ствует в регуляции внутримышечного уровня кальция, обес-

печивая связь кальциевого комплекса с цитоскелетом клет-

ки, и не исключено, что сам этот комплекс является каль-

циевым каналом. 156DAG, 50DAG, 43DAG и 35DAG содер-

жат аспарагин-связанные олигосахариды, то есть являют-

ся гликопротеинами. 156DAG дополнительно содержит тер-

минально сиализированные серин/треонин-связанные оли-

госахариды, что, по-видимому, обеспечивает его повышен-

ную устойчивость к действию протеаз. При этом сам дис-

трофии и 59DAP относятся к элементам цитоскелета,

156DAG располагается на внешней стороне мембраны, в

то время как остальные белки комплекса интегрированы с

мембраной. У больных с миодистрофией Дюшенна/Бекке-

ра и с другими аутосомно-рецессивными дюшенно-подоб-

ными миодистрофиями, а также с некоторыми формами

конечностно-поясных миодистрофии этот комплекс оказы-

вается частично или полностью разрушенным.

Дистрофии способен взаимодействовать с рядом дру-

гих белков, не входящих в описанный выше комплекс. Так,

лигандом для дистрофина служит ацикулин — неэнзимати-

ческий белок, родственный фосфоглюкомутазе первого

типа. В мышцах ацикулин ведет себя подобно типичному

дистрофин-связанному белку, располагаясь в сарколемме.

Недавно было показано, что дистрофии ассоциирован так-

же с синтетазой окиси азота нейронального типа — nNOS

(Brenman et al., 1995). В скелетных мышцах nNOS соеди-

няется с сарколеммой через дистрофин-гликопротеиновый

комплекс белков. Еще одним ассоциированным с дистро-

Фином белком является мышечный кавеолин-3 — сарко-

леммный белок, являющийся главным компонентом каве-

0Л

плазменных мембран.

Сконструированы антитела на различные антигенные

Детерминанты дистрофина, нашедшие широкое примене-

а.

Рис. 6. Иммуно-

гистохимический

анализ дистрофина

в мышечных

клетках

а — норма,

б — миодистрофия

Дюшенна,

в — гетерозиготы

(стрелками

показаны зоны

отсутствия

дистрофина).

ние для его иммунодетекции непо-

средственно в белковом лизате мышц

и на гистологических препаратах

(Hoffman et al., 1989а; 1989b; Arahata

et al., 1989). В последнем случае спе-

цифическая окраска на дистрофин

располагается по периферии клеток

(рис. 6). Как правило, у больных с ми-

одистрофией Дюшенна либо вовсе не

обнаруживается иммунореактивных

форм белка, либо мутантный белок

обнаруживается лишь при использо-

вании определенных антисывороток,

чаще всего на аминотерминальную

часть белка. В мышцах гетерозигот

наблюдаются локальные области от-

сутствия иммуноокрашивания на дис-

трофин. При форме Беккера биохими-

ческие аномалии дистрофина выявля-

ются в виде прерывистого характера

окрашивания мышц, что свидетельст-

вует о дефектах в структуре цитоске-

лета миофибрилл. Иммунологический

анализ является наиболее простым

способом диагностики гетерозиготно-

го носительства мутаций в гене DMD

у родственниц пробанда. Однако для

его осуществления необходимо про-

водить биопсию мышц. В настоящее

время иммуногистохимические мето-

ды анализа с применением антисыво-

роток на разные районы дистрофина

активно используются не только при

медико-генетическом консультирова-

нии и проведении пренатальной диа-

гностики (Bieber et al., 1989; Ginjaar

etal., 1989; Bulman et al., 1991), но и при изучении молеку-

лярных основ патогенеза миодистрофии (Hurko etal., 1989).

У некоторых пациентов с миопатией Дюшенна при им-

муногистохимическом окрашивании мышц обнаруживают-

ся редкие дистрофин-положительные волокна. При этом в

случае использования антител с антигенными детерминан-

тами, кодируемыми делетированным участком гена, окра-

шивания не происходит, и это позволяет отвергнуть гипо-

тезу соматического мозаицизма. Наиболее вероятный

механизм такого явления — возникновение второй сома-

тической делеций в мышечной ткани, компенсирующей

едвиг рамки считывания, происходящий вследствие основ-

ной делеций. В результате мутантный локус может цели-

ком транскрибироваться и транслироваться с образовани-

ем стабильного, хотя и аномального дистрофина (Klein et

al., 1992).

5. Регуляция транскрипции и сплайсинга гена DMD. апо-

дистрофины

В соответствии с современными представлениями ог-

ромный ген DMD находится под контролем сложной системы

регуляции транскрипции и сплайсинга (Ahn, Kunkel, 1993).

Показано, что транскрипция DMD осуществляется со сред-

ней скоростью 2.4 кб в минуту, так что для образования пол-

норазмерного РНК-транскрипта требуется 16 часов (Tennyson

et al., 1995). Одновременно до окончания синтеза РНК, то

есть ко-транскрипционно, начинается сплайсирование пер-

вичного РНК-транскрипта. При этом скорость накопления

"Фанскриптов на З'-конце гена уменьшается по сравнению с

бЧонцом, возможно, за счет преждевременной терминации

транскрипционных комплексов.

По крайней мере, восемь независимых промоторов

осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию

°MD В разных тканях и на разных стадиях эмбрионального

Развития (табл. 6).

Таблица 6

Изоформы

дистрофина

Размер

мРНК(кб)

Локализаци

промотора

Экспрессия

мышечный

5'-UTR область

сердечная и скелетные

мышцы

мозговой

1 интрон

кора и гиппокамп

мозговой

1 интрон клетки Пуркинье

- Dp71

4.5-4.8

63 интрон

повсеместно,

кроме мышц

2-Dp116

5.5

56 интрон

периферические нервы

3 - Dp40

2.2

повсеместно,

кроме мышц

Dpi

7.5

44 интрон эмбриональные нейроны

Dp260

сетчатка

Один промотор мышечного типа (М) и два мозгового,

активные в кортикальном отделе мозга (С) и в клетках Пур-

кинье (Р) соответственно, экспрессируют полноразмерную

молекулу дистрофина, в то время как пять других промото-

ров (среди них R, ВЗ, S, G) обеспечивают экспрессию по-

следних доменов взаимоисключающим способом, главным

образом в немышечных и в немозговых тканях. Основным

продуктом DMD в сердечной и скелетных мышцах является

14-кб РНК-транскрипт. В различных отделах мозга продуци-

руются три полноразмерные формы дистрофина с разных

промоторов, а соответствующие транскрипты различаются по

первому экзону (Chamberlain et al., 1988b; Nudel et al., 1989;

Boyce et al., 1991). Один из промоторов мозгового типа (С)

расположен в первом интроне DWD на расстоянии более 90

кб от мышечного промотора (Celly et al., 1990; Gorecki et al.,

1992). 14-кб мРНК — продукты дистрофинового гена мышеч-

Изоформы дистрофина