Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

Не исключено, что разрушение дистрофин-ассоцииро-

ванного комплекса белков может происходить не только в

оезультате генетических дефектов, но и вследствие вирус-

ных инфекций. Это, в частности, доказано в отношении виру-

са Коксаки, способного разрушать дистрофии и ассоцииро-

ванный с ним комплекс белков в кардиомиоцитах, и это, по-

видимому, является одним из начальных молекулярных ме-

ханизмов патогенеза наиболее частой приобретенной фор-

мы дилатационной кардиомиопатий.

Учитывая особую значимость миодистрофии Дюшен-

на и дистрофинопатий среди нервно-мышечных заболеваний,

мы постарались дать наиболее полный обзор молекулярно-

генетических исследований, проводимых в последние годы в

этой области неврологии. На примере дюшенно-подобных

миодистрофии особенно отчетливо может быть прослежена

связь между открытием гена и расшифровкой молекулярных

основ патогенеза, а значит, и разработкой методов точной

диагностики (включая пренатальную), профилактики и тера-

пии моногенных заболеваний.

а) Псевдогипертрофическая мышечная дистрофия

Дюшенна/Беккера (MIM: 310200)

1. Клиническая характеристика заболевания

Х-сцепленная рецессивная псевдогипертрофическая

мышечная дистрофия Дюшенна, впервые подробно описан-

ная G.Duchenne в 1868 г., — одна из наиболее частых и зло-

качественных форм нервно-мышечной патологии детского

возраста, характеризующаяся началом клинических прояв-

лений в первом пятилетии жизни, прогредиентным течением

заболевания с последующей инвалидизацией и летальным

исходом, как правило, в конце второго — начале третьего

Десятилетия жизни. Обобщенные данные о распространен-

°сти миодистрофии Дюшенна в разных популяциях указы-

вают на относительно высокую частоту этой формы, колеб-

лющуюся от 9,7 до 32,6 случаев на 100 000 родившихся жи-

вь,

ми мальчиков. Для Санкт-Петербурга она составляет не

менее 18,9 на 100 ООО (Красильников, 1989). Примерно 1/з

единичных случаев миодистрофии Дюшенна должна быть

обусловлена вновь возникшими мутациями (при условии ра-

венства частоты мутирования в мужских и женских гаметах,

а также нулевой фертильности больных). Последнее обсто-

ятельство имеет принципиальное значение для оценки по-

вторного риска при медико-генетическом консультировании

соответствующих семей. Долгое время в литературе обсуж-

дался вопрос о взамоотношении миодистрофии Дюшенна и

мышечной дистрофии Беккера (Беккера-Кинера), впервые

описанной в 1955 г. (Becker, Kiener, 1955), протекающей со

сходной клинической картиной, но отличающейся относитель-

но доброкачественным течением. К настоящему времени

получены данные, однозначно указывающие на то, что обе

формы являются результатом мутаций в одном и том же ло-

кусе. Так называемые женские случаи миодистрофии Дюшен-

на/Беккера возможны у девочек с Х-аутосомной транслока-

цией либо числовой аномалией Х-хромосомы (моносомия X).

Сходные с миодистрофией Дюшенна клинические проявле-

ния могут отмечаться у лиц женского пола с дюшенно-по-

добными аутосомно-рецессивными формами миопатии (см.

ниже). В части случаев субклинические проявления мио-

дистрофии Дюшенна/Беккера в виде «малой болезни» от-

мечаются у гетерозиготных носительниц мутантного гена.

На наличие «малых признаков» у женских родственников

больных миодистрофией Дюшенна указывал еще С. Н.

Давиденков (Давиденков, 1934). Клиническая симптоматика

носительства может проявляться умеренным снижением мы-

шечной силы и сухожильных рефлексов, утолщением (за счет

псевдогипертрофии) икроножных мышц, поясничным гипер-

лордозом, варусной деформацией стоп, другими симпто-

мами. Данное обстоятельство хорошо объясняется гипо-

тезой Лайон, предполагающей случайную инактивацию

одной из Х-хромосом в женском зачатке в раннем эмбрио-

генезе и соответственно преобладанием в подобных слу-

чаях среди функционально активных Х-хромосом, несущих

утантный аллель.

Клиническая картина миодистрофии Дюшенна достаточ-

но хорошо изучена (Дрознина, 1970; Гринио, 1976). Заболева-

ние характеризуется сравнительно ранним началом и относи-

тельно быстрым прогрессированием процесса. Первые призна-

ки заболевания в виде мышечной слабости появляются в воз-

расте 2—5 лет. У части детей отмечается задержка темпов мо-

торного развития уже на 1—2-м году жизни. Дети начинают ис-

пытывать затруднения при ходьбе по лестнице, вставании с пола,

перестают бегать. Очень типичной становится переваливающа-

яся («утиная») походка, заключающаяся в раскачивании в та-

зобедренных суставах. Рано возникают псевдогипертрофии за

счет разрастания жировой и соединительной ткани, захватыва-

ющие главным образом икроножные, дельтовидные и ягодич-

ные мышцы. В последующем постепенно появляются гипотро-

фии мышц бедер и тазового пояса, нередко внешне скрытые

из-за развитой подкожной жировой клетчатки. Процесс носит

отчетливо восходящий характер: мышечная слабость и гипотро-

фии распространяются на мышцы спины, плечевого пояса, про-

ксимальных отделов верхних конечностей. Характерны «кры-

ловидные лопатки», симптом «свободных надплечий». Из-за уси-

ливающейся слабости к 9—12 годам дети, как правило, пере-

стают ходить, постепенно превращаясь в «кресельных пациен-

тов». Становятся заметными вторичные деформации скелета,

усиливаются атрофии и сухожильные ретракции. Наиболее ран-

ние изменения обнаруживаются в ахилловых сухожилиях, при-

водящие в последующем к патологической деформации стоп.

Возможны контрактуры в локтевых, коленных и тазобедренных

оуставах. Первым из глубоких рефлексов исчезает коленный,

затем—рефлексы с двуглавой и трехглавой мышц. Дольше дру-

гих сохраняется ахиллов рефлекс. Для миодистрофии Дюшен-

а типично поражение сердечной мышцы в виде кардиомиопа-

^и. При ЭКГ-исследовании обнаруживаются углубление зубца

Пат

ология зубца R, блокада ножки пучка Гиса. Особеннос-

тью данной формы миопатии является нередко наблюдаемая

Заказ № ПО

умственная отсталость, как правило, неглубокая. Причиной ле-

тального исхода являются обычно пневмонии, которые боль-

ные не в силах перенести из-за включения в процесс дыхатель-

ной мускулатуры. Лабораторная диагностика миодистрофии Дю-

шенна/Беккера включает использование различных методов:

электрофизиологических, биохимических, гистологических, а в

последние годы — гистохимических и молекулярно-генетичес-

ких. Электромиографическое исследование, а также изучение

мышечных биоптатов обнаруживает признаки первично-мышеч-

ного поражения. Удобным и информативным тестом является

определение сывороточной креатинкиназы, уровень активнос-

ти которой в случае миодистрофии Дюшенна в десятки раз пре-

вышает нормальные значения. Следует подчеркнуть, что дан-

ный тест может быть использован в до- или субклинической ста-

дии заболевания.

2. Картирование и идентификация гена DMD

Ген миодистрофии Дюшенна — DMD (Duchenne muscular

dystrophy) — один из первых генов человека, идентифициро-

ванных методами позиционного клонирования. Успешному кло-

нированию гена предшествовало описание достаточно редких

пациентов, имеющих в области локализации гена цитогенети-

чески идентифицируемые структурные перестройки — транс-

локации и делеции. Так, в частности, у нескольких девочек, стра-

дающих заболеванием, сходным по клинике с миодистрофией

Дюшенна, были обнаружены различные реципрокные Х-ауто-

сомные транслокации, причем во всех случаях точка разрыва

Х-хромосомы оказалась локализована в области р21 (Burghes

et al., 1987; Boyd et al., 1988; Bodrug et al., 1989). Было высказа-

но предположение, нашедшее подтверждение в последующих

исследованиях, что клиника миодистрофии Дюшенна у этих де-

вочек развивается вследствие разрушения транслоцированно-

го гомолога DMD-гена, локализованного в области Хр21, в со-

четании со специфическим характером лайонизации нормаль-

ной Х-хромосомы. На следующем этапе изолированные после-

довательности ДНК, примыкающие к точкам разрывов Х-хро-

мосомы при транслокациях или отсутствующие у пациентов с

делециями, были использованы в качестве зондов для поиска и

анализа полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном

миодистрофии Дюшенна. Одним из первых таких зондов была

последовательность RC8, локализованная методами соматиче-

ской гибридизации в области Хр22.3-р21 на расстоянии около

10сМ от DMD-гена (Murrey et al., 1982). В дальнейшем была изо-

лирована целая серия подобных последовательностей ДНК.

Среди них фрагмент гена орнитинтранскарбомилазы (ОТС),

зонды р754, XJ1-8, а также внутригенные зонды серии pERT

(Francke et al., 1985; Bakker et al., 1985; Kunkel et al., 1985). С

помощью этих ДНК-зондов было обнаружено большое число

полиморфных сайтов рестрикции, ассоциированных с DMD-re-

ном, и определены генетические расстояния между ними. В

табл. 3 показано расположение некоторых полиморфных мар-

керов относительно DMD-гена и суммированы результаты не-

скольких исследовательских групп по оценке частот рекомби-

нации между этими локусами (Murray et al., 1982; Boyd et al.,

1988; Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990).

Таблица 3

Расположение полиморфных сайтов рестрикции,

сцепленных с геном дистрофина

Локус

ДНК-зонд

Границы гена

Расстояния в сМ

DXS84

р754

DXS206

рХЛ-8

3.7 + 0.6

DYS MSA *)

DXS142

PERT84

5' DMD

1.0 +0.4

DXS164

PERT87

МР1Р *)

DXS41

р99-6

3' DMD 1.9+ 0.6

DXS270

J-Bir

DXS28

12.0 + 1.1

*) микросателлитные маркеры, фланкирующие ген дистрофина.

Описание большого количества полиморфных марке-

ров, сцепленных с DMD-геном, и точное физическое карти-

рование области его локализации способствовало изоляции

специфической мРНК из скелетных мышц плода, клонирова-

нию и секвенированию полноразмерной кДНК длиной в

14 тысяч пар нуклеотидных оснований (Koenig et al., 1987;

Monaco, Kunkel, 1988). DMD — самый крупный из известных

в настоящее время генов, его размер 2.5 миллиона пар ос-

нований, и он занимает около 2% Х-хромосомы. Кодирую-

щая часть гена DMD разделена на 79 экзонов и составляет

менее 1% геномной области (Roberts et al., 1992с; 1993).

3. Мутации в гене DMD и их диагностика

Более чем в 60% случаев у больных мальчиков с мио-

дистрофией Дюшенна/Беккера обнаруживаются протяженные

делеции в гене DMD, захватывающие от одного до несколь-

ких соседних экзонов и сосредоточенные обычно в двух «го-

рячих» районах — в области 5'-конца гена (экзоны 6—19) и в

З'-конце (экзоны 40—53), при этом 30% делеций локализо-

ваны в проксимальной части гена и 70% — в дистальной

(Koenig et al., 1989; Dunnen et al., 1989; Liechti-Gallati et al.,

1989; Oudet et al., 1992). Считается, что в 30% семей с еди-

ничными случаями миодистрофии Дюшенна/Беккера болезнь

развивается вследствие спонтанного возникновения в гаме-

тах мутаций в DMD-гене и матери таких больных не являют-

ся гетерозиготными носителями этих мутаций. В подобных

семьях риск повторного рождения больного ребенка мини-

мален и не превышает общепопуляционной частоты. В ос-

тальных 70% семей матери больных мальчиков гетерозигот-

ны по мутациям DMD-гена, и при каждой беременности та-

ких женщин риск повторного рождения больного сына состав-

ляет 50%. Очень часто концы делеций локализованы в цент-

ральной части гена DMD. Так, в интроне 44, протяженностью

160—180 кб, расположено около 40% точек разрыва всех де-

леций. Проксимальные делеции возникают, по-видимому, в

раннем эмбриогенезе и имеют больше шансов стать «семей-

ными» мутациями. Дистальные делеции возникают позднее

и чаще встречаются как изолированные случаи. Считается,

что повторный риск рождения больного ребенка с прокси-

мальной вновь возникшей делецией составляет 30%, тогда

как с дистальной — только 4% (Passos-Bueno et al., 1992).

По-видимому, значительная часть делеций в гене DMD

возникает при мейотической рекомбинации. Частота мейо-

тической рекомбинации в гене дистрофина составляет 10%,

что в 4 раза больше, чем можно было ожидать на основании

длины гена (Qudet et al., 1992). С использованием 10 внутри-

генных полиморфных маркеров показано существование двух

горячих точек рекомбинации в гене DMD. Одна из них между

экзонами 44 и 51 с пиком в 44-м интроне, другая между ни-

троном 7 и 5'-концом DMD. Локализация горячих точек ре-

комбинации очень сходна с распределением точек разрывов

делеций у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера. Эти

результаты дают основание предполагать участие одного и

того же молекулярного механизма, лежащего в основе об-

разования делеций и повышения частоты рекомбинации в

гене DMD.

В нескольких случаях показано, что один из концов де-

леций, локализованных в интроне 43, расположен внутри ТНЕ-

1 элемента, принадлежащего семейству ретротранспозонов

(Pizzuti et al., 1992). Эти элементы, размером 2.3 кб, фланки-

рованные 350-нуклеотидными длинными терминальными по-

вторами (LTR), встречаются в геноме человека около

10 ООО раз. Гипотеза о том, что нестабильность гена DMD вы-

звана присутствием транспозоно-подобного элемента, при-

влекается также для объяснения нескольких случаев обна-

ружения различий в молекулярном дефекте у пациентов, при-

надлежащих одной и той же родословной, у которых предпо-

ложительно должна быть мутация общего происхождения

(Miciak et al., 1992). В некоторых случаях удалось проследить

присутствие Alu-элементов, локализованных в точках разры-

вов внутригенных структурных перестроек. Так, при секве-

стровании концевых участков дупликаций в гене DMD в 2 слу-

чаях из 8 были обнаружены Alu-элементы (Ни et al., 1989). В

остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между

негомологичными последовательностями.

Делеции в гене DMD часто возникают в процессе про-

лиферации зародышевых клеток, следствием чего является

гонадный мозаицизм — появление нескольких генераций

половых клеток (ооцитов) с мутантными и нормальными ал-

лелями (Darras et al., 1988; Bakker et al., 1989). Гонадный мо-

заицизм представляет серьезную проблему для диагностики

гетерозиготного носительства и, следовательно, для медико-

генетического консультирования семей с миодистрофией

Дюшенна. Предполагается, что такие мутации могут возни-

кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на

ранних стадиях внутриутробного развития будущей матери.

По ориентировочным оценкам примерно 6—7% всех спора-

дических случаев являются следствием гонадного мозаициз-

ма у матери. Оценить величину аберрантного клона ооцитов

практически не представляется возможным. В связи с этим

прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семь-

ях, в которых у матери больного миодистрофией Дюшенна не

удается определить гетерозиготное носительство, весьма

затруднен. Эмпирически определено, что при наличии спо-

радического случая рождения ребенка с миодистрофией

Дюшенна и при отсутствии прямых молекулярных доказа-

тельств гетерозиготного носительства мутации в гене дистро-

фина у матери риск повторного рождения больного ребенка

может достигать 14% (Essen et al., 1992). Мутации возникают

преимущественно в оогенезе (Bakker et al., 1989), несмотря

на то, что теоретическая вероятность отцовского происхож-

дения делеций в гене дистрофина выше за счет большего

числа репликаций ДНК, происходящих в процессе созрева-

ния мужских половых клеток (Giannelli, 1988).

Отмечены особенности паттерна делеций в разных

европейских популяциях (Beggs et al., 1990; Abbs et al., 1991)

и в популяциях России и стран СНГ (Baranov etal., 1993). Так,

в результате объединенных межлабораторных исследований

показано, что соотношение делеций в 3'- и в 5'-районах «го-

оячих» точек возникновение мутаций в различных популя-

циях Западной Европы составляет 3.5:1, тогда как в России

только 2:1. У некоторых пациентов может быть делетирован

не только весь ген дистрофина, но достаточно протяженные

соседние области. Прямой корреляции между тяжестью те-

чения заболевания и длиной делеций не отмечается, но раз-

личия между формами Дюшенна и Беккера в общем случае

связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считыва-

ния (Malhotra et al., 1988; Koenig et al., 1989). При миодистро-

фии Дюшенна делеций сопровождаются сдвигом рамки счи-

тывания и вследствие этого преждевременной терминацией

трансляции, тогда как при форме Беккера такого сдвига не

происходит. Поэтому у пациентов с миопатией Дюшенна про-

дукт гена либо полностью отсутствует, либо деградирует вско-

ре после синтеза. У больных с формой Беккера такой белок,

как правило, присутствует, хотя и в измененном, чаще всего

в укороченном виде. Эта гипотеза оказалась справедливой

для 94% делеций с картированными точками разрывов. Ис-

ключения из этого правила связаны со сложным характером

экспрессии гена DMD.

Рис. 1. Расположение кДНКовых зондов гена дистрофина

После клонирования гена появилась возможность ис-

пользовать кДНКовые зонды для анализа изменчивости вну-

Ригенных полиморфных сайтов рестрикции. На рис. 1 пока-

зано расположение этих зондов относительно кДНК-гена дис-

Рофина. кДНКовые зонды явились прекрасными маркера-

ми для выявления делеций в DMD-гене (Dunnen et al., 1989).

табл. 4 указаны некоторые полиморфные сайты рестрик-

Чии

выявляемые

с помощью этих кДНК-овых зондов. Распо-

ложение относительно гена DMD геномных районов, гибри-

дизующихся с некоторыми геномными и кДНКовыми зонда-

ми, после рестрикции ДНК редкощепящей эндонуклеазой Sfj

I изображено на рис. 2.

Рис. 2. Расположение относительно гена дистрофина

геномных районов, гибридизирующихся с некоторыми

геномными и кДНКовыми зондами, после рестрикции ДНК

редкощепящей эндонуклеазой Sfi 1

Таблица 4

кДНКовые полиморфные сайты рестрикции

Районы кДНК

Рестриктаза

Аллели (кб)

Районы кДНК

Рестриктаза

мажорная

минорная

0-2а

Xmn1

2.0

2.1

ЗЬ-5а

EcoR1

9.4

9.7

5Ь-7

EcoRY

7.3

EcoR1

10.5

Xmn1

4.7

4.4

9 -10

EcoRY

Pvu11

9.3

Taq1

2.1

1.7