Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

Подождите немного. Документ загружается.

ого и мозгового типа, различающиеся по структуре первого

экзона, одновременно присутствуют в нейронах коры и гип-

покампа, и дополнительный полноразмерный транскрипт иден-

тифицирован в клетках Пуркинье. В последнем случае транс-

крипт также отличается от двух известных продуктов по струк-

туре первого экзона, который оказался локализован в большом

интроне между мышечным промотором и вторым экзоном гена.

Все образующиеся при этом формы дистрофина имеют неболь-

шие отличия в N-концевом участке белка.

В немышечных тканях и в клеточных линиях найдено

множество укороченных форм дистрофина — апо-дистрофи-

нов, образующихся за счет альтернативной транскрипции —

Dp40, Dp71, Dpi 16, Dpi40, Dp260. Цифры в названии этих

белков соответствуют молекулярным весам соответствующих

апо-дистрофинов. Dp71, или апо-дистрофин-1, по-видимому,

является основным продуктом гена DMD в немышечных тка-

нях, включая ткани мозга (Lederfein et al., 1993а; 1993b; Bar

etal., 1990). В Dp71 присутствует С-концевой домен дистро-

фина и часть цистеин-богатого, а также 7 дополнительных

аминокислот на N-конце белка. Содержание этого белка в

некоторых тканях сопоставимо с количеством дистрофина в

мышцах, и особенно обильно он представлен в клетках Шван-

на, где дистрофии отсутствует (Blake et al., 1992). В скелет-

ных мышцах взрослых Dp71 отсутствует, тогда как в мышцах

плода наряду с дистрофином экспрессируется и апо-дистро-

фин-1. Уровень мРНК Dp71 в культуре дифференцирующих-

ся миобластов сохраняется стабильным, тогда как содержа-

ние белка в процессе дифференцировки значительно возра-

стает, что указывает либо на его большую стабильность по

сравнению с полноразмерным дистрофином, либо на возмож-

ность изменений в эффективности трансляции (Tennyson et

'-i 1996). мРНК-транскрипт Dp71 более устойчив по сравне-

нию с полноразмерным транскриптом, так как период его

полураспада составляет около 20 часов, тогда как для мРНК

Дистрофина — только 16 часов (Tennyson et al., 1995). Иден-

тифицированы различные изоформы апо-дистрофина-1, об-

разующиеся за счет альтернативного сплайсинга последних

экзонов гена DMD. Характерным для Dp71 является сплай-

сирование экзона 78.

Dpi 16 и Dpi40 и Dp260 в дополнение к С-концевым

доменам имеют дистальные области стержневого домена

дистрофина различной протяженности. Все эти белки так-

же связаны с клеточными мембранами, однако их функ-

ции остаются в значительной степени неясными. Апо-дис-

трофин-2 — Dpi 16, преимущественно экспрессируется у

взрослых в периферических нервах. Размер мРНК самого

маленького апо-дистрофина-3 (Dp40) составляет 2.2 кб

(Tinsley et al., 1993). Чисто нейрональной изоформой дис-

трофина является Dpi40 (Morris et al., 1995). Наиболее

интенсивная экспрессия этого белка в мозге наблюдается

в эмбриональном периоде. Трансляция Dpi40 начинается

с 51 экзона гена дистрофина, а промотор и первый экзон

этой последовательности локализованы в 44 интроне гена

DMD. Показано, что снижение интеллекта, которое харак-

терно для части больных с миодистрофией Дюшенна, до-

стоверно коррелирует с делециями в районе экзонов 40-

52 гена DMD. Эти делеции могут затрагивать синтез или

функции Dpi40. В плексиформном слое сетчатки глаза

избирательно экспрессируется изоформа дистрофина

Dp260. Этот апо-дистрофин участвует в контроле нормаль-

ной электрофизиологической функции сетчатки (D'Souza

et al., 1995). Апо-дистрофины, так же как и полноразмер-

ные дистрофины, способны взаимодействовать с белками

дистрофин-ассоциированного комплекса. Однако из-за

отсутствия в их структуре N-терминальной части дистро-

фина эти белки не способны взаимодействовать с акти-

ном и потому их функции не связаны с поддержанием це-

лостности мембран мышечных волокон.

Уровень транскрипции полноразмерного мышечного

дистрофина в процессе дифференцировки миобластов воз-

растает примерно в 10 раз. Однако активность мышечного

промотора в зрелых миофибриллах в 30 раз ниже, чем в

незрелых мышечных волокнах — миотубулах, что указы-

вает на существование дополнительных транскрипционных

элементов, вовлеченных в регуляцию экспрессии гена DMD

s мышцах (Klamut et al., 1996). Одним из них является 5-кб

энхансер, локализованный внутри первого мышечного ин-

трона. Этот элемент специфическим образом активирует-

ся в мышцах. В генно-инженерных опытах in vitro было по-

казано, что мышечный DMD-энхансер обеспечивает повы-

шенный уровень экспрессии генов-репортеров независи-

мо от своего положения и ориентировки. По-видимому,

существуют и дополнительные подобные элементы в дру-

гих частях гена DMD.

Высококонсервативные последовательности шести эк-

зонов, кодирующих С-конец дистрофина, альтернативно

сплайсируются, образуя несколько структурно различающих-

ся изоформ дистрофина, осуществляющих различные функ-

ции. Очевидно, что продукты дистрофинового гена могут вза-

имодействовать со множеством различных белков и не толь-

ко в мышечных и нейрональных тканях (Monaco, 1989). В

настоящее время функции многочисленных изоформ дистро-

фина, обильно экспрессирующихся в различных специали-

зированных тканях и способных взаимодействовать со мно-

жеством белков и не только мышечного или нейронального

происхождения, изучены явно недостаточно.

6. Риртрпфин-ассоииированный комплекс белков

Связь цитоскелета мышечной клетки с экстраклеточ-

ным матриксом осуществляется за счет взаимодействия

полноразмерного дистрофина с дистрофин-ассоциирован-

ным комплексом белков. При разрушении этого комплек-

са мышечные волокна теряют свою структурную целост-

ность и погибают. Кроме того, связывание различных изо-

Ф°рм дистрофина с сарколеммой необходимо для их нор-

мального функционирования в центральной нервной сис-

теме. Оказалось, что дистрофин-ассоциированный ком-

плекс белков имеет гораздо более сложную структуру, чем

это представлялось вначале, и в нем могут быть выделены

три отдельных субкомплекса — дистрогликановый, сарког-

ликановый и синтрофиновый (рис. 7).

Рис. 7. Дистрофин-ассоциированный комплекс белков

В первый субкомплекс входят два гликопротеина, яв-

ляющиеся коровыми белками для всего комплекса — боль-

шой экстраклеточный белок ct-дистрогликан (156DAG) и не-

посредственно взаимодействующий с ним трансмембранный

р-дистрогликан (43DAG или АЗа). Заякоревание дистрофина

на внутренней поверхности сарколеммы обеспечивается за

счет его связывания с цитоплазматическим хвостом р-дис-

трогликана (Suzuki et al., 1994). а-дистрогликан, взаимодей-

ствуя с компонентом базальной мембраны ламинином 2 (или

мерозином), обеспечивает связь между внеклеточным мат-

риксом и сарколеммой, а через дистрофин — и с цитоскеле-

том клетки. Ламинин-связанный а-дистрогликан, соединен-

ный с экстраклеточным участком р-дистрогликана, форми-

рует дистрогликановый субкомплекс (Suzuki et al., 1995). Уча-

сток связывания дистрофина с р-дистрогликаном, начинаю-

щийся в цистеин-богатом районе дистрофина и захватываю-

щий часть концевого С-домена, имеет огромное значение для

функционирования полноразмерных и укороченных изоформ

дистрофина. Так, одна из редких миссенс-мутаций в гене

DMD — C3340Y, сопровождающаяся заменой консерватив-

ного цистеина в дистрогликан-связывающем домене, приво-

дит к тяжелой форме миодистрофии Дюшенна в комплексе с

умственной отсталостью и отсутствием b-волны на электро-

ретинограмме (Lenk et al., 1996). Участок связывания дис-

трофина с р-дистрогликаном содержит три пептидных моти-

ва, найденных в других неродственных дистрофину белках —

WW, EF, ZZ. Эти мотивы кодируются экзонами (63), (65-66),

(68-69), соответственно. Интересно, что р-дистрогликан спо-

собен связываться с src-гомологичным доменом SH3 одного

из адапторных белков (Grb2). SH3 — высококонсервативная

некаталитическая последовательность, участвующая в обра-

зовании стабильного комплекса между scr-киназами и дру-

гими сигнальными молекулами, включая рецепторы. Пред-

полагается, что b-дистрогликан взаимодействует с WW-участ-

ком дистрофина посредством атипичных ЭНЗ-связывающих

модулей (Yang et al., 1995). EF-последовательность может уча-

ствовать в связывании кальция. ZZ-мотив способен связывать

бивалентные катионы металлов, в частности цинка.

Показано, что а- и р-дистрогликаны являются альтер-

нативными продуктами одного гена DAG1, картированного в

области 3р21 (Ibragimov-Beskrovnaya et al., 1992; 1993). Со-

ответствующий белковый продукт, транслирующийся с мРНК

размером 5.5 кб, расщепляется на две нековалентно-ассо-

Циированные субъединицы — аир. Ген DAG1, состоящий из

Двух разделенных большим интроном экзонов, экспрессиру-

втся во множестве типов тканей. В опытах на мышах пока-

зан высокий уровень экспрессии этого гена в раннем эмбри-

огенезе. Дистрогликаны обнаруживаются в децидуальной тка-

и уже на периимплантационной стадии развития (Yotsumoto

et al., 1996). По-видимому, в этот период они выполняют роль

медиаторов для адгезии между децидуальными клетками или

между децидуальными и трофобластными клетками. Присут-

ствие дистрогликанов необходимо для формирования одной

из первых оболочек зародыша — Рейхеротовской мембра-

ны (Williamson et al., 1997). Роль дистрогликанов в различных

специализированных тканях во многом остается неясной.

В нейромышечных соединениях а-дистрогликан явля-

ется функциональным рецептором для агрина — нейрональ-

но секретируемого гликопротеина, индуцирующего кластери-

рование ацетилхолиновых рецепторов и последующую реор-

ганизацию постсинаптического цитоскелета (Sealock,

Froehner 1994). В ряде работ было показано, что в культиви-

руемых миотубулах антидистрогликановые антитела ухудша-

ют кластерирование ацетилхолиновых рецепторов (Campanelli

et al., 1994; Gee et al., 1994). Показано, что домен агрина,

ответственный за кластерирование ацетилхолиновых рецеп-

торов, физически отделен от домена, осуществляющего связь

с дистрогликаном (Gesemann et al., 1996). Поэтому представ-

ляется более вероятным, что дистрогликан трансдуцирует

сигнал от агрина для начала кластерирования ацетилхолино-

вых рецепторов через промежуточный белок, которым, по

всей видимости является перлекан (Peng et al., 1999). Не ис-

ключено, что именно через эту связь осуществляется учас-

тие дистрофина в синаптогенезе.

Другой саркогликановый субкомплекс формируется

четырьмя трансмембранными белками и включает а-сарко-

гликан (50DAG или адхалин или А2), р-саркогликан (43DAG

или АЗЬ), у-саркогликан (35DAG или А4) и 5-саркогликан

(35DAG). В этот субкомплекс, по-видимому, входит 25DAP (А5

или саркоспан). Связь саркогликанового субкомплекса с дис-

трофином осуществляется посредством его взаимодействия

с цитоплазматическим участком 35DAG. Для сохранения ста-

бильности всего саркогликанового комплекса особое значе-

ние имеет карбокси-терминальный район у-саркогликана. В

настоящее время все гены, кодирующие саркогликаны, кар-

тированы и клонированы. Мутации в саркогликановых генах

являются причиной развития различных аутосомно-рецессив-

нь1Х

дюшенно-подобных и конечностно-поясных миодистрофии.

Третий синтрофиновый субкомплекс образован четырь-

мя ассоциированными с дистрофином цитоплазматически-

ми белками — тремя 59DAP, получившими название синтро-

финов или А1 триплета (а-А1, р1 -А1 и р2-А1), а также минор-

ными белками комплекса, относящимися к группе дистроб-

ревинов (АО). Синтрофины связываются с участком С-кон-

цевого домена дистрофина, кодируемым экзонами 73-74,

альтернативно сплайсирующимися во многих типах тканей

на разных стадиях развития (Suzuki et al., 1994; Ahn, Kunkel,

1995). В частности, р1-синтрофин специфически связывает-

ся с расположенной в концевом С-домене последовательно-

стью из 53 аминокислот, кодируемой 74 экзоном дистрофи-

на. а-синтрофин связывается с другим участком дистрофи-

на, локализованным в непосредственной близости от сайта

связывания р1-синтрофина (Suzuki et al., 1995). Возможно,

дистробревин участвует в связи между дистрофином и сар-

когликановым субкомплексом. Синтрофины, по-видимому,

являются сигнальными медиаторами, так как они содержат

протеин-связывающие домены (PDZ). Они могут опосредо-

вать соединение дистрофин-ассоциированного комплекса

белков с киназами, натриевыми каналами и nNOS. Предпо-

лагается также их участие в пострансляционных модифика-

циях DAP-комплекса в мышцах в ответ на изменение меха-

нического стресса. Синтрофины, локализованные в нейро-

мышечных соединениях, и в первую очередь р2-синтрофин,

по-видимому, принимают участие в синаптогенезе.

Дистробревины относятся к семейству дистрофин-

Родственных белков. Их гомология с дистрофином в обла-

сти цистеин-богатого домена достигает 57%. Ген дистроб-

Ревина картирован в области 18q12.1-12.2 и кодирует се-

мейство белков, главными изоформами которых в мыш-

Чах являются дистробревин-1 (94 кД), дистробревин-2 (62

КД) и дистробревин-3 (42 кД) (Sadoulet-Puccio et al., 1996;

Metzinger et al., 1997). Обнаружено не менее 5 различных

транскриптов гена дистробревина, три из которых присут-

ствуют в мозге. Фосфорилированный по тирозину дистро-

бревин с молекулярной массой 94 кД имеет 90% гомоло-

гии с 87 кД постсинаптическим белком электрического ска-

та Torpedo (Wagner et al., 1993). He исключено участие дис-

тробревинов в синаптогенезе, так как они вычищаются в

комплексе с ацетилхолиновыми рецепторами. Хотя у

Torpedo дистробревин также ассоциирован с синтрофина-

ми и дистрофином, прямого взаимодействия между этим

комплексом и ацетилхолиновыми рецепторами не обнару-

жено. Иммуногистохимические исследования показывают,

что уровни дистробревина в сарколемме пациентов с мио-

дистрофией Дюшенна и, в меньшей степени, Беккера рез-

ко снижены. Однако присутствия дистрофина недостаточ-

но для правильной локализации дистробревинов в сарко-

лемме, так как аналогичное снижение наблюдается и у

пациентов с конечностно-поясными мышечными дистро-

фиями, обусловленными дефектами в саркогликановых

генах.

В целом организация дистрофин-гликопротеинового

комплекса очень сходна со структурой кадхеринов или ин-

тегринов, а сам этот комплекс является важнейшим эле-

ментом архитектуры мышечных клеток. Очевидно, что во

многих типах клеток позвоночных белки дистрофинового

семейства выполняют критическую роль в поддержании ас-

социированных с мембраной комплексов в местах меж-

клеточных контактов. Но на этом их функция не ограничи-

вается. Наличие многочисленных сайтов фосфорилирова-

ния в цистеин-богатом домене, присутствующем во всех

дистрофин-родственных белках, и возможность его связы-

вания с кальцием, магнием и кальмодулином доказывают

активное участие этих белков в передаче сигналов через

мембрану мышечного волокна (Michalak et al., 1996).Для

большинства дистрофин-ассоциированных белков выпус-

каются в настоящее время коммерческие антитела.

На рис. 8 схематически изображены связи между бел-

ками дистрофин-ассоциированного комплекса.

Рис. 8. Связи между белками дистрофин-ассоциированного

комплекса

7. Анализ корреляций генотип-фенотип. Дюшенно-подобные

аутосомно-реиессивные миопатии

Анализ корреляций между клиническим течением ми-

одистрофии Дюшенна/Беккера и делециями без сдвига рам-

ки считывания, затрагивающими специфические домены

белкового продукта DMD, позволяет строить своеобразную

«патофункциональную» карту дистрофина (Ahn, Kunkel,

1993). Показано, что N-концевые делеций приводят к гете-

рогенным, но достаточно серьезным формам Беккера.

Делеций проксимальной части стержневого домена связа-

ны с очень мягким или атипичным фенотипом, тогда как

Дистальные делеций этого же домена дают типичные фор-

мы Беккера. За некоторым исключением делеции двух С-

концевых доменов реализуются в виде миодистрофии Дю-

шенна.

У больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера коли-

чественное содержание всех белков гликопротеинового

комплекса, в том числе и внеклеточного альфа-дистрогли-

кана (156DAG), значительно понижено и одновременно

повышен уровень кальция скелетных мышц, "аким обра-

зом, аномальная экспрессия дистрофина может оказывать

влияние на внешние компоненты мышечных вогокон вслед-

ствие разрушения дистрофин-ассоциированно'о комплек-

са, нарушения целостности или эластичности сарколеммы,

ведущего либо к ее механическому повреждению, либо к

изменению механизмов регуляции кальция. Потеря экс-

траклеточного гликопротеина является, по-видимому, пер-

вым шагом в молекулярной цепи патогенеза данных форм

миодистрофии.

Не исключено, что делеции в некодируюдих облас-

тях DMD, специфическим образом нарушающее экспрес-

сию определенных изоформ дистрофина вследствие изби-

рательного разрушения промоторных областей для соот-

ветствующих транскриптов, могут реализоваться в сцеп-

ленные с полом заболевания, не сопровождающиеся мы-

шечной дистрофией. Так, было показано, что делеции об-

ласти локализации мышечного промотора, а также точко-

вые мутации в 5'-сайте сплайсинга первого экзона DMD

являются причиной одной из форм тяжелой Х-сцепленной

дилатационной кардиомиопатии, протекающей без прояв-

лений симптомов мышечной слабости (Muntoni etal., 1995а;

Milasin et al., 1996). Распространенность дилатационной

кардиомиопатии в США составляет 36.5 на 100 000. При-

мерно для 20% подобных случаев показано менделевское

наследование различного типа — аутосомно-доминантное,

аутосомно-рецессивное и сцепленное с полом. При этом

не наблюдается никаких клинических различий между се-

мейными и спорадическими случаями заболевания. Гене-