Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

350

Тихоненко Т.І. (1983) для вирішення найбільш гострих

проблем і подалання труднощів виробництва повнорозмірних

імуногенних вірусних білків пропонує використовувати куль

туру клітин людини чи тварин з наступною її трансформацією

генами капсидних вірусних білків, забезпечених регуляторни

ми елементами еукаріот.

Вітчизняні і закордонні автори встановили, що отримані

шляхом хімічного синтезу чи еліміновані з відповідної білкової

молекули олігопептидні структури, адекватні по набору послі

довності залишків амінокислот, а також конформації епітопних

ділянок нативного капсидного вірусного білка забезпечують

імуногенний ефект, подібний до активності інтактного вірусу.

Цей принцип покладений в основу одержання протиящурної

вакцини, синтетичні олігопептидні епітопи якої відтворюють

антигенні детермінанти, що знаходяться як у мономерних полі

пептидах, так і в четвертинних надмолекулярних структурах і

належать до епітопів конформаційного типу. У зв’язку з цим є

розходження в первинній структурі синтетичних олігопепти

дних епітопів і епітопів, які сформовані амінокислотними за

лишками в нативному капсидному білку, що, однак, не першко

джають досягненню синтезованими епітопами імуногенного

ефекту.

Білкові молекули, що у розчині приймають вторинну і тре

тинну структури, заздалегідь визначену дослідником, викори

стовуються в практичній імунології. Оскільки тривалість життя

синтезованих генноінженерним шляхом олігопептидних епіто

пів у бактеріальній клітині дуже коротка, пропонується для по

долання цієї перешкоди включати антигенні детермінанти олі

гопептидних епітопів, що належать одному чи декільком

серотипам або навіть декільком видам вірусу, до складу спе

ціального сконструйованого химерного білканосія з заздале

гідь установленою вторинною і третинною структурами. Це до

зволяє антигенним детермінантним ділянкам прийняти

положення, що забезпечує найбільшу імуногенну активність.

Цей принцип був використаний Тихоненко Т.І. (1983) при

створенні вакцини проти вірусу гепатиту В людини. Ген, який

входив до складу сконструйованої ним рекомбінантної ДНК,

кодував біосинтез химерного білка, у складі якого знаходилися

олігопептидні ділянки, що є епітопами HBSантигену вірусу ге

патиту В людини. При парентеральному введенні тваринам

цього білка було встановлене утворення нейтралізуючих вірус

(протективних) антитіл. Гетерополіантигенні поліпептидні

структури, названі вакцинами другого покоління, цікаві ще й

тим, що їхнє виробництво може бути полегшене біотехнологіч

ним шляхом.

При створенні вакцин третього покоління ставиться завдан

ня використовувати для утворення антитіл консервативні епі

топні ділянки, загальні не тільки для вірусів різних серотипів,

але й видів, а можливо, навіть родів. Вони також розташовані на

поверхні й беруть участь в утворенні капсидної оболонки, однак

від антигенних детермінант, що мають високу імуногенную

активність, відрізняються значною мінливістю первинної

структури, у зв’язку з чим цим вірусам удається порівняно лег

ко переборювати імунний захист клітинигосподаря. Вони ха

рактеризуються дуже слабкою імуногенністю, хоча і не позбав

лені потенційної здатності індукувати синтез антитіл. Синтез

хімічним чи генноінженерним шляхом консервативних анти

генних детермінант, пошук прийомів, спрямованих на підви

щення їхньої імуногенної активності, складають основний зміст

нового підходу в конструюванні вакцин третього покоління, які,

є штучними, тому що в природних умовах потенціал консерва

тивних епітопів не реалізується. До цього варто додати здат

ність вакцин третього покоління індукувати синтез протектив

них антитіл і захищати від вірусів, ступінь генетичного

споріднення між якими віднаходить відбиток в адекватності

слабкоімуногенних консервативних епітопів, розташованих у

консервативних ділянках капсидних поверхневих вірусних біл

ків. Практичним підтвердженням цієї ідеї є синтез нейтралізую

чих серотипи вірусу грипу А і В антитіл, що утворилися в

результаті імунізації синтезованими хімічним шляхом антиген

ними детермінантами, локалізованими в зоні консервативних

ділянок вірусного гемаглютиніну.

Провідний радянський імунолог Петров Р.В. (1984), харак

теризуючи план створення й основні параметри вакцини май

бутнього, вказує на те, що антигенний її компонент буде предста

влений синтетичними олігопептидними епітопами, включеними

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

351

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

352

в полілізинову структуру, складену з багатьох сотень залишків

амінокислоти лізину, тобто носієм полігетероантигенних детер

мінант є полііонна, а точніше, полікатіонна структура. Однієї

імунізації достатньо, щоб захистити організм людини чи тварин

від тих інфекцій, антигенні детермінанти яких були представле

ні в полікатіонному носії. Петров Р.В. пропонує нові підходи –

цілеспрямований вплив на імунну систему організму за допо

могою введення в штучну вакцину стимулюючого компонента

на основі знання механізмів реалізації генетичного контролю

імунної відповіді.

На сьогодні існує обгрунтована й експериментально під

тверджена дослідженнями Петрова Р.В., Хаітова Р.М. і Кабано

ва В.А. наукова концепція і програма конструювання штучних

антигенів нового типу, кінцевою метою якої є створення штуч

них макромолекулярних вакцинуючих препаратів, що не мають

відповідних природних аналогів.

Щоб вакцина майбутнього, проект якої в 1973 р. представив

Села М., була ефективною у всіх випадках її застосування,

необхідно одержати відповідь на питання, чому деякі організми,

оброблені приготованими за пастерівськими принципами ос

лабленими чи мертвими вакцинами або виділеними з них анти

генами і в багатьох інших випадках діяли безвідмовно, залиша

лися неімунними. Крім того, приготовані за класичним

принципом вакцини при багатьох інфекціях виявляються не

ефективними; не виникає імунітету до повторного зараження

даним збудником навіть після хвороби, викликаної деякими ін

фекціями. У зв’язку з цим низка інфекцій належить до категорії

непереможених. Тим часом збудники цих інфекцій є носіями

антигенних детермінант. Однак заздалегідь відомо, що їхнє ви

ділення, установлення структури з урахуванням можливих кон

формаційних впливів, наступний ресинтез і використання як

субодиничних вакцин не матимуть ефекту. Причини нереагу

вання чи низького реагування на введену в макроорганізм суб

станцію мають геномну локалізацію, тобто є генетично детермі

нованими.

Села М. (1969, 1983), Петров Р.В. (1976), Петров Р.В., Хаі

тов Р.М., Атауллоханов Г.І. (1983) й інші з відкриттям генів

імунної відповіді встановили механізм генетичного контролю

сили імунного реагування. Виявлено гени імунної відповіді

(Irгени) і гени імунної супресії (Isгени). При антигенному

впливі на організм реакція Irгенів реалізується у вигляді висо

кої чи низької відповіді до даних антигенів залежно від того,

який Irген (високої чи низької відповіді) знаходиться в геномі.

Деякі гени на антигенну детермінанту певної будови реагують

розвитком вираженої імунної відповіді, інші генотипи на цей

епітоп реагують слабко чи не відгукуються зовсім на антигенні

детермінанти, що розрізняються за будовою. В одних випадках

розвивається швидка і висока імунна реакція, в інших — розви

нути таку реакцію організм не може. У тих випадках, коли в ге

номі міститься Irген низької відповіді і (чи) Isген сильної су

пресії, традиційно приготованою вакциною ефективної імунної

відповіді одержати не вдається.

За сформульованим і успішно реалізованим Петровим Р.В.

і його школою принципом створення штучних вакцин допуска

ється одержання макромолекул, що включають епітопний ком

понент і полііонну штучну структуру, яка індукує імуногенез і

забезпечує обхід Тклітинного і Irгенного контролю імунної

відповіді. Незалежність такого штучного макромолекулярного

комплексу від антигенної конкуренції створює принципову

можливість її використання як вакцинний препарат проти тих

інфекцій, що дотепер належали до категорії непереможених лю

диною, а також, можливо, проти раку й алергійних станів. Отже,

за новим принципом створення штучних вакцин можлива

участь певного епітопу в макромолекулярному вакцинуючому

комплексі як обов’язкового компонента.

Вирішенню цього питання молекулярної імунології переду

вали дослідження з моделювання антигенів. Антигенні власти

вості встановлені у тринітрофенолу, приєднаного до такої висо

комолекулярної сполуки, як полі2метил5вінілпіридин

(молекулярна маса — 80–100 тис. дальтон), динітрофенолу,

кон’югованого з макромолекулярною полікатіонною структу

рою, створеною на основі поліLлізину, у кон’югату тетрапеп

тиду ТирГлуАлаЛіз (сополімер тирозину, глутамінової ки

слоти, аланіну і лізину) з поліаніоном, утвореним у результаті

полімеризації чи сополімеризації акрилової кислоти (поліакри

лова кислота).

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

353

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

354

У ході цих досліджень було сформульоване поняття про ан

тигенну детермінанту (епітоп). Установлено, що антигенна спе

цифічність макромолекулярної структури визначається анти

генною детермінантою, а за допомогою антитіл виявляються

незначні зміни в структурі антигенних детермінант; були іден

тифіковані гени імунної відповіді в морських свинок (1963) і

виявлені Irгени у мишей; експериментально підтверджені

слабкі антигенні властивості поліпептидів навіть у тих випад

ках, коли вони модифікувалися гаптенами, а також виявлена та

ка важлива властивість полііонних носіїв гаптенів, як здатність

їх виступати ефективними імуностимуляторами. Головним при

проведенні цих досліджень було те, що антигенні макромолеку

лярні комплекси на полііонній основі взагалі не стимулювали

біосинтез антитіл, а процес антитілоутворення тривав активно

навіть у тих генотипів, що при традиційній вакцинації не за

лежали від тимуса і від Irгенного контролю імунної відповіді.

Остання обставина була покладена в основу при конструюван

ні штучних вакцин нового типу.

Крім штучних антигенних структур, інтенсивно вивчають

ся олігопептидні білкові ділянки, що формують антигенні

детермінанти вірусів, бактерій, найпростіших. Досить грун

товно досліджуються олігоцукристі антигенні детермінанти

сальмонел.

Було встановлено, що виділені з білкової структури вірусу

чи отримані синтетичним шляхом олігопептиди з різною кількі

стю амінокислотних залишків здатні індукувати біосинтез

антитіл проти цілого білка; взаємодія антитіл з білковою моле

кулою, що утримує антигенні детермінанти, приводить до ней

тралізації вихідного вірусу. Виділені чи синтезовані олігопеп

тидні структури з’єднували найчастіше з такими носіями, як

бичачий сироватковий альбумін, поліD,Lаланін, правцевий

анатоксин, гемоціанін равлика, лізоцим, гликопептид та ін.

Майже у всіх випадках сконструйовані на основі олігопепти

дної антигенної детермінанти і поліпептидної структури, вико

ристаної як носій, антигенні комплекси для стимулювання іму

ногенезу мали потребу в одночасному введенні ад’ювантів

(найчастіше повного ад’юванта Фрейда, алюмінієвих квасців чи

гідроокису алюмінію, які застосовувалися окремо чи в сполу

ках). Винятком були дослідження, де як носій використовував

ся мурамилдипептид, що стимулює імуногенез.

Синтез олігопептидів, що імітують константні ділянки ан

тигенної детермінанти поверхневого білка гемаглютиніну (НА)

вірусу грипу, має неабиякий практичний інтерес, тому що цей

принцип може бути покладений в основу конструювання вак

цини, при введенні якої синтезуються протективні (вірусней

тралізуючі) антитіла проти декількох різновидів вірусу грипу.

Білок 1 вірусу ящура (VP

) є найбільш ефективним антиге

ном, у відповідь на введення якого індукується біосинтез віру

снейтралізуючих антитіл (рис. 15.1). Крім того, відомо, що фраг

мент VP

включає 141–160й амінокислотні залишки і схильний

до найбільших змін у різних серотипів вірусу ящура. Передбача

ється, що вакцина, створена кон’югуванням олігопептидів,

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

355

Рис. 15.1. Схема конструювання протиящурної вакцини

(за Овчінніковим Ю.А., 1986)

ValProAsnLeuArgCly

AspLeuClnValLeuAla

GlnLysValAlaArgThr

LeuProCysSносій

характерних для кожного серотипу вірусу, на загальному білко

вому носії повинна забезпечити біосинтез протективних анти

тіл, що нейтралізують А, Оі Ссеротипи вірусу ящура (Shin

nick T.M. et al., 1983).

У колишньому Радянському Союзі був одержаний і прой

шов виробничі випробування вакцинуючий комплекс, створе

ний із синтезованого пентадекапептиду і його фрагментів, що

включають послідовність 145–159го залишків амінокислот

білка вірусу ящура і з’єднаних з такими носіями, як гемоці

анин равлика, БСА і глікопептид (Вольпіна О.М. й ін., 1984).

У дослідників, що працють у цьому напрямку, очевидно,

найбільшими труднощами є подолання Тклітинного і Irгенно

го контролю сили імунного реагування. Зазначені труднощі

можна здолати за допомогою штучних вакцин нового типу .

Аналогічні прийоми були використані при створенні синте

тичних олігопептидних антигенних детермінант для конструю

вання вакцини проти бактерій і їхніх токсинів: синтез олігопеп

тидного фрагмента, що включає епітопну ділянку, приєднання

синтезованого олігопептиду до білкового носія (бичачий сиро

ватковий альбумін, поліD,Lаланін, поліLлізин, правцевий

анатоксин та ін.) за допомогою біфункціонального глутарового

альдегіду чи іншим способом, введення отриманих комплексів

одночасно з повним ад’ювантом Фрейда або мурамилдіпепти

дом в організм тварин.

Синтетичні олігопептидні фрагменти, що відтворюють ан

тигенні детермінанти дифтерійного і холерного токсинів, а та

кож Мбілка Streptococcus pyogenes, приєднані до поліпепти

дного носія, індукували біосинтез пептидспецифічних антитіл,

здатних взаємодіяти з інтактними токсинами і в деяких випад

ках їх нейтралізувати. Кон’югати олігопептидних епітопів бак

теріальних білків і їхніх токсинів з поліпептидними носіями та

кож не забезпечують обхід Тклітинного і Irгенного контролю

імуногенезу, у зв’язку з чим створені на цій базі вакцини не мо

жуть індукувати ефективну імунну відповідь у генетично низь

кореагуючих індивідуумів.

До складу структурного поверхневого білка спорозонтів

P. Knowlesi входить 24амінокислотна пептидна послідовність з

властивостями антигенної детермінанти. Моноклональні анти

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

356

тіла проти поверхневого антигенного білка P. Knowlesi вступа

ли у взаємодію із синтезованим пептидом з 24х залишків амі

нокислот, що виконують функцію антигенної детермінанти.

Отримані методом хімічного синтезу з повторюваних оліго

цукристих ланок фрагменти мали властивості і специфічність

антигенних детермінант Оантигену сальмонел. При з’єднанні

синтетичних олігоцукристих фрагментів з бичачим сироватко

вим альбуміном чи дифтерійним токсином були отримані анти

генні комплекси, що при кількаразових імунізаціях за участю

ад’ювантів (повний ад’ювант Фрейда) набули деяких імуноген

них і протективних властивостей, що охороняло генетично ви

сокореагуючих на бичачий сироватковий альбумін особин від

, збільшеної приблизно в 10 разів. На тварин, генетично

низькореагуючих на бичачий сироватковий альбумін, сконстру

йований у такий спосіб антигенний комплекс зовсім не викли

кав імунізуючого ефекту. Ця обставина ще раз підтверджує

перспективність ідеї, розвинутої Петровим Р.В. і Хаітовим Р.М.

та їхньою школою (1986) про необхідність фенотипічної корек

ції генного контролю імунної відповіді з метою вивчення підхо

дів для переведення тварин, що слабко реагують на введений

антиген, в особини з ефективною імунною відповіддю.

У результаті проведених з 1972 р. у цьому напрямку дослі

джень установлено, що синтетичні полііони (полі2метил5ві

нілпіридин — ПМВП; поліакрилова кислота — ПАК; декстран

сульфат; полі4вінілпіридин — ПВП; Nвінілпіролідон –

NВПД; четвертинні солі полі4вінілпіридину і поліконідину й

ін.) є одним з головних компонентів у створенні штучних вакцин

нового типу. Молекулярна маса полііонів коливається в межах

10–100 тис. дальтон. Ні самі полімерні з’єднання, ні мономерні

ланки, з яких складаються полімерні молекули, не виявляють

антигенних властивостей. Один з інтегральних ефектів, вироб

лених полііонами — їх імунопотенціююча дія, складовими якої є

окремі ланки імуногенезу. Так, уведення полііонів значною мі

рою збільшує швидкість міграцій Т і Влімфоцитів відповідно з

тимуса і кісткового мозку в кров і селезінку, де забезпечуються

необхідні умови для взаємодії Т і Влімфоцитів, тобто Тхелпе

рів з Вклітинами, прискорення розмноження і диференціація

останніх в антитілоутворюючі клітини (АУК).

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

357

При цьому поліаніони (ПАК, декстрансульфат) впливають

тільки на Вклітини, а полікатіони активують також і Тлімфо

цити, підвищуючи в присутності макрофагів синтез ДНК: полі

аніони слабко стимулюють біосинтез ДНК і тому належать до

малоефективних мітогенів. Важливим для рішення розглянутої

проблеми (обхід Тклітинного і Irгенного контролю імуногене

зу) є встановлення можливості прямого стимулювання розпо

ділу і диференціації Влімфоцитів в АУК за допомогою полііо

нів; реакція на введення безтимусним тваринам полііонів

адекватна тому ефекту, що одержують при введенні в їхній ор

ганізм Тхелперів.

У забезпеченні збалансованої функції імунної системи бе

руть участь Тсупресори, що під впливом полііонів також інак

тивуються. Однак стимулюючий вплив полііонів на швидкість

розмноження Влімфоцитів, їх диференціювання в антитілоу

творюючі клітини й участь останніх в утворенні антитіл, збе

реглися. Виявлено позитивний вплив полііонів на активність

природних кілерних клітин і кілерів, що походять з кровотвор

ної стовбурної клітини. За допомогою полііонів досягається ак

тивування реакцій, що супроводжують імунну відповідь, яка

була пригнічена внаслідок антигенної активації Тсупресорів.

Дія полііонів на імунокомпетентні клітини залежить від дози

поліелектроліту і його молекулярної маси.

Поліелектролітна природа розглянутих полімерних ад’ю

вантів і поліфункціональність властивостей білків, укладенихх

у клітинні мембрани, мають ідеальну можливість для їхньої ба

гатоточкової кооперативної взаємодії й утворення інтерполі

мерних комплексів. Супутня процесу комплексоутворення аг

регація білків клітинної мембрани призводить до порушення її

проникливості: збільшується швидкість надходження іонів ка

лію і кальцію за градієнтом концентрації — калій виходить із

клітини, а кальцій входить в клітину. Декотрі експериментальні

дані підтверджують аргументованість цієї точки зору. Так, ней

тральні полімери, а також олігополімери довжиною — 0,5–5 нм

позбавлені комплексоутворючої активності, не надто вплива

ють на проникливість клітинної мембрани для калію і кальцію,

а за допомогою електронної мікроскопії виявлені кластери, що

поєднують полііонні молекули 20–50 білкових глобул. До того

ЧастинаII.Спеціальнібіотехнолоії

358

ж активність Na

, K

, Ca

АТФаз, впливаючи полііонною мо

лекулою на клітинну мембрану, також зростає.

Сконструйовані на синтетичній полііонній основі за участю

гаптенів (тринітрофенолу – ТНФ) і білкових речовин (бичачо

го сироваткового альбуміну) штучні антигени без використання

ад’ювантів формують імунологічну пам’ять після одноразової

імунізації. Кон’югати на полііонній основі є дуже сильними ан

тигенами, індукуючими біосинтез специфічних до ТНФ і білко

вого компонента антитіл. Був отриманий штучний антиген, що

є трикомпонентним комплексним з’єднанням Ополіцукру, от

риманого з Оантигену сальмонел методом кислотного гідролі

зу, джгутикового антигену білкової природи — флагеліну, та

кож виділеного із сальмонел, з поліаніоном ПАК. Названий

комплекс має високі імуногенні властивості, що чітко реалізу

ється у вигляді первинної і вторинної імунної відповіді. Дво

компонентні антигенні комплекси ОполіцукорПАК і флаге

лінПАК без застосування ад’ювантів індукують високого рівня

імунну відповідь зі специфічністю відповідно Оантигену і фла

геліну. Штучний трикомпонентний антигенний комплекс до

цільніше використовувати для створення штучної протисаль

монельозної вакцини.

Індукування процесу розмноження і диференціації Влім

фоциту в антитілоутворюючу клітину відбувається в результаті

його контакту з Тлімфоцитом, що одержали від макрофага сти

мулюючі сигнали, які сформувалися при взаємодії антигену і

білка, що є продуктом Irгена. Влімфоцит впізнає антигени са

мостійно. В експериментах з використанням штучних комплек

сів, де складовими елементами виступали полііони, а також гап

тени, білки і поліцукри, на мишах, у яких практично відсутні

Тлімфоцити (Вмиші), після імунізації накопичується така ж

кількість антитілоутворюючих клітин, як у нормальних мишей.

Такі антигенні комплекси виявляють сильний тимуснезалеж

ний імуногенний ефект. Крім того, було встановлено, що слабкі

тимусзалежні білкові антигени (бичачий сироватковий альбу

мін) при з’єднанні з полііонними макромолекулами забезпечу

ють тимусзалежність імунної відповіді і нагромадження специ

фічних для цього білка антитілоутворюючих клітин у великій

клькості. У цьому випадку антигенна детермінанта, що входить

Розділ15.Біотехнолоіяівацинимайбтньоо

359